공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.
공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.
허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 재관류는 허혈을 넘어 추가적인 부상을 일으킨다. 내피 세포 (ECs)는 세포 - 세포 상호 작용을 통해 재관류 손상으로부터 심근 세포 (CM)를 보호 할 수 있습니다. 공동 배양은 세포 - 세포 상호 작용의 역할을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혼합 공동 배양은 가장 간단한 접근법이지만 단리 처리 및 단일 세포 유형의 하류 분석이 가능하지 않기 때문에 제한됩니다. ECs가 용량 의존적으로 CM 세포 손상을 감쇠시킬 수 있는지 여부와 두 세포주 사이의 접촉 거리를 변화시킴으로써 이러한 보호가 더욱 최적화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 마우스 일차 관상동맥 내피 세포와 성인 마우스 심근세포를 사용하여 0.5에서 세포간 층간 거리가 변화한 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물을 테스트했습니다. 각각 1.0 및 2.0 mm. CMs-전용에서, 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 방출에 의해 평가된 바와 같은 세포 손상은 저산소증 동안 그리고 거리가 0.5 및 1.0 mm에 비해 2.0 mm일 때 재산소화 시에 유의하게 증가하였다. EC와 CM이 거의 직접 접촉했을 때 (0.5mm), 저산소증에 따른 CM의 재 산소 부상의 경미한 감쇠 만있었습니다. 공간 거리가 1.0mm일 때 이러한 감쇠가 크게 증가하였다. 2.0mm 거리에서, ECs는 저산소증과 저산소증/재산소화 둘 동안 CM 손상을 감쇠시켰으며, 이는 EC가 CM과 교차하는 데 충분한 배양 거리두기가 필요함을 나타내므로, 분비된 신호 분자가 순환하고 보호 경로를 완전히 자극할 수 있다. 우리의 연구 결과는 시뮬레이션 된 허혈 / 재관류 손상에 대한 CM 보호에서 EC의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 EC / CM 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 처음으로 시사합니다. 이 보고서의 목표는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공하는 것입니다.
허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다 1,2. 그러나 재관류의 치료 과정 자체가 심근 허혈 / 재관류 (IR) 손상으로 알려진 심근 세포 사망을 유발할 수 있으며 여전히 효과적인 치료법이 없습니다3. 내피 세포 (ECs)는 파라크린 신호의 분비뿐만 아니라 세포 간 상호 작용을 통해 심근 세포 (CMs)를 보호하기 위해 제안되었습니다4.
세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 자가분비 및/또는 파라크린 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 공동 배양 모델 중에서, 혼합 공동 배양은 가장 간단하며, 여기서 두 가지 유형의 세포가 원하는 세포 비율5로 단일 배양 구획 내에서 직접 접촉합니다. 그러나, 세포 유형 사이의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 집단을 고려할 때 쉽게 실현 가능하지 않다.
이전의 연구에 따르면 저산소 및 허혈성 모욕은 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 방출에 의해....
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1. 실험 준비/도금
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이 실험에 사용된 세 가지 유형의 삽입물(A, B, C)은 모두 0.4 μm의 동일한 기공 크기를 갖는다. 이들 사이의 유일한 차이점은 인서트-베이스 높이인데, 이는 두 공동 배양된 세포층 사이의 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm가 되도록 허용하고(그림 3), 서로 다른 공급업체에서 온 것이라는 점입니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
IR 손상을 시뮬레이션하기 위해 HR을 겪는 두 세포주의 분리된 층과 함께 시험관내 공동 배양 모델을 확립하기 위해, ECs의 유무에 관계없이 공동 배양된 CMs의 세포막 무결성을 조사하였다. CM 층 위의 다양한 거리에 배치 할 수있는 EC에 대한 별도의 삽입물을 활용함으로써 CM의 막 손상의 심각성에 대한 세포층 거리의 차등 효과를 평가할 수있었습니다. 별도의 실험 세트에서 우리는 EC의 밀도와 EC와 CM의 비율을 다양화했습니다. 또한.......
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프로토콜의 중요한 단계
세포 공동 배양 모델은 심장 보호의 세포 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔습니다. 따라서 두 개의 서로 의미있는 거리를 가진 두 개의 개별 레이어를 만드는 방법은 적절한 공동 문화 모델을 개발하는 데 중요합니다. 시뮬레이션 된 IR, 즉 HR을 연구 할 때의 도전은 허혈 (저산소증) 자체뿐만 아니라 재관류 (재 산소화)가 세포 기능 장애를 악화시킨다는 것입니다. 따라서 현실적인 모델은 예를 들어 저산소증만과는 달리 저산소증에 따른 재산소화에 의한 부상이 충분히 증가했음을 입증함으로써 이러한 특성을 반영해야하지만 세포 보호 약물 또는 우리의 경우 EC의 존재와 같은 전략으로 부상의 감쇠를 허용해야합니다. 흥미롭게도, 두 세포층 사이의 거리는 적합한 공동배양 모델을 개발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 우리는 EC와 CM 사이의 1.0mm와 2.0mm 거리가 예상되는 HR 손상 반응을 허용한다는 것을 입증 할 수 있었지만, 더 중요한 것은 2.0mm만이 저산소 .......
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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이 작업은 부분적으로 미국 재향 군인 사무국 생물 의학 실험실 R & D 서비스 (I01 BX003482)와 M.L.R.에 대한 기관 기금에 의해 지원되었습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 성인 마우스 심근 세포 (CM) | Celprogen Inc | 11041-14 | 성인 C57BL / 6J 마우스 심장 조직에서 분리 |
| Automated Cell Counter Countess II | Invitrogen | A27977 | 세포 수 계산을위한 세포 계수 |
| Bio-Safety Cabinet | Nuaire | NU425400 | Cell culture sterile hood |
| Cell Culture Freezing Medium | Cell Biologics Inc | 6916 | 장기 세포주 저장을 위한 세포 동결에 사용 |
| 세포 배양 인큐베이터 | Nuaire | Nu-5500 | 정상적인 세포 생활 조건(21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37° C, 가습) |
| 세포 배양 인큐베이터 가스 탱크 | A-L 압축 가스 | UN1013 | 세포 배양 인큐베이터에 필요한 가스 |
| 세포 배양 인서트 A(0.5mm) | Corning Inc | 353095 | EC-CM 공동 배양 |
| 세포 배양 인서트 B(1.0mm) | 에 사용되는 밀리셀 밀리포어 | PIHP01250 | EC-CM 공동 배양 |
| 세포 배양 인서트 C(2.0mm) | Greiner Bio-One | 662640 | EC-CM 공동 배양 |
| 원심분리기 | Anstel Enterprises Inc | 4235 | 세포 배양 도금 및 파시징용 |
| CMs 세포 배양 플라스크 T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | CM 일반 배양에 사용, 제조업체 코팅 |
| CMs 세포 배양 배지 Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs 배양 |
| 배지 완전한 페놀 프리 | Celprogen Inc | M11041-14PN | LDH 측정 중 사용되는 페놀 레드가 없는 CM |
| 배지 CMs 세포 배양 플레이트 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | LDH 측정 실험에 사용되며 제조업체 |
| CMs 저산소증 세포 배양 매체 | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | 저산소 상태에서 CMs 세포 배양 (포도당 및 무혈청) |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Invitrogen | C10283 | 세포 계수기에 사용되는 |
| 계수 슬라이드 Cyquant LDH 세포 독성 키트 | 써모 사이언티픽 | C20301 | LDH 측정 키트 |
| ECs 세포 배양 플라스크 T25 | Fisher Scientific | FB012935 | ECs 일반 배양 |
| ECs 세포 배양 배지 | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs 배양 완료 배지 |
| ECs 세포 배양 배지 완전한 페놀 프리 | Cell Biologics Inc | M1168PF | LDH 측정 중에 사용되는 페놀이 없는 ECS |
| 배양 배지 ECs 세포 배양 플레이트 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | LDH 실험에 사용됨 측정 |
| ECs 배양 젤라틴 기반 코팅 용액 | Cell Biologics Inc | 6950 | |
| ECs ECs 저산소증 세포 배양 매체 | Cell Biologics Inc | GPF1168 | 저산소 상태(포도당 및 무혈청)에서 ECs 세포 배양 |
| 태아 혈청(FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA 세포 배양 및 유지 관리 승인 |
| 저산소증 챔버 | StemCell Technologies | 27310 | 0.01 % O 2 < / sub> 환경에서 저산소 상태를 만들려면 |
| 산소증 챔버 유량계 | StemCell Technologies | 27311 | 일관된 가스 흐름 속도를 위해 저산소 가스 탱크와 연결 |
| 저산소 가스 탱크 (0.01 % O 2 < / sub> 실린더) | AL 압축 가스 | UN1956 | 저산소 매체 및 챔버 (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)를 플러시하는 데 사용됩니다 |
| Nikon | TMS | 세포 상태를 관찰하기 위해 | |
| 마우스 원발성 관상 동맥 내피 세포(ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | C57BL/6 마우스의 관상 동맥에서 분리 |
| NUNC 15ML CONICL 튜브 | Fisher Scientific | 12565269 | 세포 배양 공정, 실험, 용액 준비 등을 위해 |
| NUNC 50ML CONICL 튜브 | Fisher Scientific | 12565271 | 세포 배양 공정, 실험, 용액 준비 등에 사용됩니다. |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | 배양 또는 실험 중 세포 세척에 사용 |
| 플레이트 리더 | BioTek 기기 | 11120533 | 색 또는 형광 플레이트 판독 |
| 반응 96 웰 팔테(뚜껑 없음) | Fisher Scientific | 12565226 | CMS |
| 용 트립신/EDTA | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x 멸균 여과 및 조직 배양 테스트 |
| Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0.25% | 에 대한 트립신/EDTA |
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