우리는 제브라피시를 모델로 사용하여 척추 운동 뉴런의 빛에 의한 TAR DNA 결합 단백질(43)의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
비정상적인 단백질 집계 및 선택적 뉴런 취약성은 신경 퇴행성 질환의 두 가지 주요 특징입니다. 이러한 특징 들 사이의 인과 관계는 취약한 세포 유형에서 질병 관련 단백질의 위상 전이를 제어함으로써 심문 될 수 있지만, 이러한 실험적 접근방식은 지금까지 제한되었습니다. 여기서, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에서 퇴행성 모터 뉴런에서 발생하는 TDP-43의 세포질 응집 모델링을 위한 제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에서 RNA/DNA 결합 단백질 TDP-43의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 선택적으로 광유전학 TDP-43 변종을 전달하는 세균성 인공 염색체 (BAC)기지를 둔 유전 방법을 기술합니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 억제되지 않은 물고기에 대한 발광 다이오드(LED)를 사용하여 간단한 외부 조명에 의해 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 위상 전환을 허용합니다. 우리는 또한 광 조명에 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어와 함께 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징의 기본 워크플로우를 제시한다. 이 프로토콜은 ALS 취약 세포 환경에서 TDP-43 위상 전환 및 집계 형성의 특성화를 가능하게 하며, 이는 세포 및 행동 결과에 대한 조사를 용이하게 해야 합니다.
서론
리보뉴클레오단백질(RNP) 과립은 균질유체가 2개의 뚜렷한 액체 상1,2로 분해되는 현상인 액체 액체 상 분리(LLPS)를 통해 멤브레인 이없는 분할을 조립하여 핵 및 세포질에서 무수한 세포 활동을 제어합니다. RNP 과립 성분으로 일반적으로 작동하는 RNA 결합 단백질의 소화 불량 LLPS는 단백질 응집으로 이끌어 내는 이상한 상 전이를 촉진합니다. 이 과정은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 연루되었습니다3,4,5. RNA 결합 단백질과 질병 병인의 비정상적인 LLPS 사이의 인과 관계의 정확한 평가는 LLPS가 효과적인 치료 대상으로 악용 될 수있는 여부와 방법을 결정하기위해 중요합니다. RNA 결합 단백질의 LLPS는 시험관 내 및 단세포 모형에서 공부하기 쉽지만 다세포 유기체, 특히 척추동물에서는 어렵습니다. 조직 환경 내의 개별 세포에서 이러한 LLPS를 분석하기 위한 중요한 요구 사항은 질병에 취약한 세포 유형의 LLPS의 이미징 및 조작을 위한 프로브를 안정적으로 표현하는 것입니다.
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프로토콜
모든 어류 작업은 국립보건원 동물복지실(NIH, NIH)의 동물복지실(보증번호 A5561-01)을 제출하는 국립유전학원(일본)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(일본 24-2)에 따라 진행되었습니다. 미국).
1. mnr2b 프로모터로부터 광유전학 TDP-43 유전자의 발현을 위한 BAC의 건설
- BAC 준비
- 제브라피쉬 mnr2b 궤적(CH211-172N16, BACPAC 유전체학)을 함유한 제브라피쉬 BAC 클론을 구입한다. 온난화 외 18에 기술된 바와 같이 CH211-172N16을 항구하는 DH10B 대장균(E. coli)의 5mL 하룻밤 LB 배양으로부터 BAC DNA를 정화한다.
- 온난화 외 18에 설명된 바와 같이, 전기화에 의해 CH211-172N16을 전기기화로 변환한다.
참고: 전기기화 당일 대장균 으로부터 BAC DNA의 정제는 일반적으로 BAC transform18의 높은 성공률을 제공합니다. 그렇지 않으면, 정제된....
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결과
제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에 있는 광유전학 및 비 광유전학 TDP-43 단백질의 살아있는 화상 진찰
제브라피시의 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 상 전이를 유도하기 위해, N-및 C-테르미니에서 mRFP1 및 CRY2olig22로 태그되는 인간 TDP-43h는 각각 opTDP-43h14(도 1A)로 구성및 지정되었다. opTDP-43h 유전자 단편은 mnr2b 궤적(도 1B)을 포함하는 BAC로 도입되었다. mnr2b-hs:opTDP-43h로 지정된 결과 BAC는 Tol2 트랜스포슨 매개 BAC 트랜스게네시스19에 의해 제브라피시 게놈으로 도입.......
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토론
mnr2b-BAC-매개 발현은 제브라피시의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 발현을 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 위상 전이의 라이브 이미징을 위한 독특한 기회를 제공한다. 제브라피시 애벌레의 신체 조직의 광학적 투명성은 opTDP-43h의 간단하고 비침습적 광유전학적 자극을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 단일 척추 운동 뉴런 사이의 비교는 opTDP-43h의 빛 의존 올리고머화가 ALS 병리학을 연상시키는 세포질 클러스터링을 일으킨다는 것을 보여주었습니다.
본질적으로 무질서한 단백질의 위상 거동을 정의하는 중요한 매개변수 중 하나는 세포내 농도입니다. 높은 수준의 opTDP-43h 식은 잠재적으로 빛 독립적 opTDP-43h 올리고머화, 위상 전환 및 집계로 이어질 수 있습니다. 따라서, 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h 발현의 안정적이고 무독성 수준의 유도는 척추 운동 뉴런에 대한 opTDP-43 상 전환의 생리학적 및 병리학적 결과의 성공.......
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공개 사항
KA와 KK는 이 원고에 기재된 지적 재산권의 발명가이며, 임시 특허는 국립유전학원에 의해 제출되었다.
감사의 글
이 작품은 세리카 펀드 (KA), KAKENHI 그랜트 번호 JP19K06933 (KA) 및 JP20H05345 (KA)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 컨포칼 현미경 | 올림푸스 | FV1200 | |
| 에피 형광 현미경 | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| 형광 실체 현미경 | Leica | MZ16FA | |
| 유리 기본 접시 | IWAKI | 3910-035 | |
| 인큐베이터 | MEE | CN-25C | |
| LED 패널 | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA 스마트 키트 | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| 대물 렌즈 | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| 대물 렌즈 | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| 광 파워 미터 | HIOKI | 3664 | |
| 광학 센서 | HIOKI | 9742-10 | |
| 페놀 레드 용액 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA 중합효소 | TAKARA | R050A | |
| QIAquick 젤 추출 키트 | Qiagen | 28704 | |
| 6웰 접시 | FALCON | 353046 | |
| 분광계 프로브 BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| 주사기 바늘 | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 얼룩물고기 BAC 클론 CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
참고문헌
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biol....
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재인쇄 및 허가
