방법 논문

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

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DOI:

10.3791/63107

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2022년 2월 16일

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1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

이 논문에서

요약

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

생체 내에서 산화질소(NO) 활성은 그의 직접적인 효과, NO autoxidation으로부터 생성된 그의 유도체의 작용, 및 니트로화 화합물의 효과의 조합된 결과이다. NO 대사산물을 측정하는 것은 혈관 수준과 다른 조직, 특히 외인성 NO가 투여되는 실험 환경에서 NO 활성을 연구하는 데 필수적입니다. 오존 기반 화학발광 분석은 유체(플라즈마, 조직 균질물, 세포 배양물 포함) 및 가스 혼합물(예: 내뿜는 호흡) 모두에서 NO 및 NO 대사산물의 정밀한 측정을 가능하게 합니다. NO는 오존과 반응하여 흥분 상태에서 이산화질소를 생성합니다. 결과적으로 발광은 광검출 및 샘플의 NO 함량을 반영하는 전기 신호의 생성을 허용합니다. 동일한 샘플로부터의 분취량은 특정 NO 대사산물, 예컨대 질산염, 아질산염, S-니트로소티올, 및 철-니트로실 착물을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 무세포 헤모글로빈에 의해 소비된 NO는 또한 화학발광 분석으로 정량화된다. 이러한 모든 기술에 대한 그림이 제공됩니다.

서론

살바도르 몬카다와 노벨상 수상자인 로버트 푸르치고트, 루이 이그나로, 페리드 무라드가 산화질소(NO)를 이전에 알려진 내피 유래 이완인자(EDRF)로 확인했기 때문에, NO의 중심 역할은 혈관 생물학, 신경과학, 대사 및 숙주 반응전반에 걸친 몇 가지 주요 메커니즘에서 확립되었다 1,2,3,4,5,6,7 . NO 가스의 외인성 투여는 신생아8에서 폐 고혈압으로 인한 호흡 부전에 대한 확립된 치료법이 되었다. 산화 질소 가스는 또한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염, 말라리아 및 기타 감염성 질환, 허혈 재관류 손상의 치료 및 심장 수술을받는 환자의 급성 신장 손상 예방 9,10,11,12에 대해 조사되었습니다. NO, 그 대사 산물 및 표적 단백질 및 화합물의 수준을 평가하기위한 정확한 측정 기술의 필요성은 기계론적 및 중재적 연구 모두에서 비롯됩니다.

그것의 높은 반응성으로 인해, NO는 그것이 생성 및/또는 방출되는 생물학적 매트릭스에 따라 상이한 반응을 겪을 수 있다. 헤모글로빈 (Hb) 또는 다른 옥시헤모단백질의 부재하에, NO는 아질산염 (NO2-)으로 거의 완전히 산화된다.

2NO + O2 →2NO2

NO2 + NO →N2O3

N2O3+H2O →NO2- + H+

NO는 먼저 분자 산소(O2)와 상호 작용하여 이산화질소(NO2)를 생성하고,NO2 자체와 반응하여 삼산화이질소(N2O3)를생성한다. N2O3의 한 분자는 물(H2O)과 반응하여 NO2- 및 양성자(H+)13의2분자를 형성한다. 전혈14,15 내에서, NO와 NO2-는 이들 분자가 Hb의 산화된 헴기[Hb-Fe2+-O2 또는 옥시헤모글로빈(oxyHb)]와 격렬하게 반응하여 질산염(NO3-)으로 빠르게 전환되어 NO3-를 생성한다. 이 반응은 헴기가 페릭 상태로의 전이와 결합된다 [Hb-Fe3+ 또는 메트헤모글로빈 (metHb)]:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ +NO3-

적혈구 (RBC) 장벽과 내피에 바로 인접한 공간은 이러한 반응을 제한하는 주요 요인이며 내피에 의해 방출되는 NO의 작은 부분이 EDRF16,17로 작용할 수 있도록합니다. 실제로, 순환에서 무세포 Hb는 실험 및 임상 설정(17,18)에서 혈관확장을 방해하는 것으로 알려져 있다. RBC 내에서, 산소화 및NO2-농도에 따라, NO의 일부는 데옥시헤모글로빈(Hb-Fe2+)과 반응하여 철-니트로실 Hb(Hb-Fe2+-NO 또는 HbNO)를 형성한다:

Hb-Fe2++ NO → Hb-Fe2+-NO

RBC15,17에서, NO2-NO의 방출을 유도하는 Hb-Fe2+를 감소시킴으로써 Hb-Fe3+를 형성할 수 있고, 이는 차례로 Hb-Fe2+-O2 (우선적으로) 또는 Hb-Fe2+에 결합한다.

NO 유도체의 생성은 NO가 다양한 조직 및 상이한 효소에 의해 (예를 들어, 장내 박테리아 또는 미토콘드리아 내에서, 특히 저산소 조건 하에서) NO2- 및NO3-로부터 재생될 수 있기 때문에 엄격하게 단방향성으로 간주되어서는 안 된다.19,20.

가변량의 NO 생성(또는 투여)은 주로 친핵체의 존재하에N2O3로부터 티올 트랜스니트로화에 의해 N-니트로소티올의 하류 생성을 유도하여 NO+ 공여체 중간체(Nuc-NO+-NO2-)를 생성한다:

N2O3+ RS-→ RS-NO + NO2-

S-니트로소티올스 생성에 대한 또 다른 가능성은 산화된 티올의 니트로실화(산화된 티올과 반응하는 NO)이다:

RS• + 아니오 → RS-아니오

NO2에 의한 이러한 메카니즘 및 직접적인 티올 산화는 다른 곳에서 설명되는 매우 특정한 조건에서만 가능할 수 있다(21). S-니트로소티올은 S-니트로소글루타티온과 같은 광분자에서 큰 티올 함유 단백질에 이르기까지 다양합니다. S-니트로소헤모글로빈(S-NO-Hb)은 β쇄(β93C)22 내에 보존된 시스테인 잔기의 티올기의 니트로화에 의해 형성된다.

S-니트로소티올의 생성과 신진 대사는 중요한 조절 메커니즘의 일부입니다. 그 예로는 글루타티온, 카스파제, N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA), 및 리아노딘 수용체 23,24,25,26,27,28의 조절이 포함된다. 이전에 생체내에서 NO 생물학의 주요 매개체로서 고려되었던 니트로화 알부민(S-nitroso-albumin)은 어떠한 특정한 추가적인 생물학적 활성도 없이 NO/NO+ 수송체인 것으로 보인다(29).

생물학적 매트릭스 내의 특정 생물학적 샘플로부터 NO 및 그 유도체의 농도를 측정할 때, 산도, 산소화, 온도 및 시약의 존재와 같은 특성을 고려하는 것이 중요하다. 그 예로는 외인성 NO 공여체 투여를 포함하고, 급성 염증의 설정에서, 과산화수소(H2O2)가NO2와 반응하여 퍼옥시아질산염(ONOO-)21과 같은 초정상 농도의 자유 라디칼의 생성을 유도한다. 사용되는 분석 방법 외에도 샘플 준비 및 저장의 사전 분석 단계가 기본입니다. 생체내 NO 활성을 나타내지 않는 하류 반응은 예측, 고려, 차단되어야 한다. 유효한 예는 S-NO-Hb의 불안정성이며, 측정22를 목표로 할 때 혈액 샘플의 전용 처리가 필요합니다.

화학발광-기반 분석은 조직 균질물30,31을 포함하는 임의의 생물학적 유체에서 NO 및 그의 주요 대사산물 [NO2-,NO3-, S-NO 및 철-니트로실 착물 (Fe-NO)]의 수준을 검출하기 위한 황금 표준이다. 이러한 방법은 NO와 오존(O3)의 반응을 수용하여 여기된 상태(NO2•)에서NO2를 생성하는 장치인 화학발광 검출기(CLD)에 의존합니다. NO2•의 이완은 광승수 튜브에 의해 검출되는 광자의 발광을 야기하여, 샘플링된 가스 혼합물(32)의 NO 함량에 직접적으로 비례하는 전기 신호를 생성한다. CLD의 단순화된 개략도가 표현된다.

화학발광 설정: NO + O₃ - NO₂* 반응; 광전자 증배관; 다이어그램은 광학 방출을 표시합니다.
그림 1: 산화질소 가스에 대한 화학발광 검출기의 단순화된 회로도. 화학발광 기반 산화질소(NO)의 검출은 화학발광 검출기(CLD)에 도입되는 NO 가스 분자당 하나의 광자의 화학량론적 생성이다. 화학 발광 반응은 내부 발전기에서 오존 (O3)이 공급되는 지정된 챔버에서 얻어지며, 외부 펌프와의 연결로 음압으로 유지되어 샘플 가스의 지속적이고 지속적인 유입을 허용합니다. O3의 생성에는 CLD와 연결된 전용 O2 탱크에 의해 공급되는 규원자 산소(O2)가 필요합니다(다른 제조업체는 주변 공기로 작동하는 CLD를 제공합니다). 반응 챔버 내에서, 샘플링된 가스에 포함된 NO 가스의 각 분자는 산소와 반응하여 활성화 상태의 이산화질소(NO2*) 한 분자를 산출한다. 그의 기저 상태로 되돌아감으로써, 각각의NO2* 분자는 반응 챔버에 인접해 위치한 광승수 튜브(PMT)에 의해 검출되는 하나의 광자를 방출한다. 증폭기 및 중앙 처리 유닛과 연관된 PMT는 반응 챔버 내의 광자 수 및 NO 분자의 수에 비례하는 신호를 생성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CLD의 샘플 입구는 액체 샘플용 반응 챔버를 함유하는 유리 시스템에 연결될 수 있다. 이 시스템은 질소, 헬륨 또는 아르곤과 같은 불활성 가스로 연속적으로 퍼징되어 NO를 반응 챔버에서 CLD로 전달합니다. 액상 샘플은 전용 멤브레인을 통해 정화 용기로 주입됩니다.

PTFE 슬리브, NaOH 트랩이 있는 퍼지 용기의 가스 흐름을 보여주는 화학 장치 다이어그램.
그림 2 : 화학 발광 기반 산화 질소 가스 검출을위한 정화 용기의 구조 퍼지 용기 (오른쪽)는 액상 시약에서 방출 될 때 NO 가스로 쉽게 전환 될 수있는 산화 질소 (NO) 가스 또는 기타 화합물의 검출을 허용합니다. 불활성 가스 유입구는 아르곤, 제온, 또는 이원자성 질소(N2)와 같은 불활성 기체의 소스(탱크)에 연결된다. 바늘 밸브 (왼쪽으로 열림)는 퍼지 용기 내의 압력 제어에 사용되며 용기를 청소하기 위해 완전히 제거 할 수 있습니다. 주입 포트는 샘플 주입을위한 막 중격이있는 캡으로 덮여 있습니다. 멤브레인은 자주 교체해야합니다. 가열된 재킷은 반응 챔버를 둘러싸고 온수 욕조에 연결되어 HCl 분석에서VCl3을 수행한다. 퍼지 용기 출구는 화학발광 검출기 (CLD) 또는 NaOH 트랩에 연결된다 (HCl 분석에서VCl3에 필요함). 반응 챔버 함량을 배출하려면 먼저 불활성 가스 입구와 퍼지 용기 출구에서 스톱콕을 닫고 바늘 밸브를 닫은 다음 주입구에서 캡을 제거한 다음 마지막으로 드레인에서 스톱콕을 엽니 다. NaOH 트랩 (왼쪽)은 HCl의 부식성 때문에 HCl 분석에서VCl3이 수행되는 경우 정화 용기와 CLD 사이에 인라인으로 배치해야합니다. CLD에 연결하려면 CLD와 퍼지 용기의 출력(또는 사용되는 경우 NaOH 트랩) 사이에 항상 강렬한 전계 유전체(IFD) 필터가 배치되어야 합니다. IFD 필터는 공기 중 입자를 제거하고 액체가 퍼지 용기를 통과하는 것을 방지합니다. PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과적으로, 특이적이고 조절된 화학 반응을 통해 NO로 전환될 수 있는 임의의 화합물은 임의의 생물학적 유체 및 조직 균질액(24)에서 높은 감도로 검출될 수 있다. 화학발광을 통한 기상NO의 직접 측정은 실험 및 임상 설정 모두에서 수행된다. 이들 기술은 다른 곳에서도 광범위하게 설명된다(33,34,35). NO2-, S-니트로소티올, S-니트로소티올, S-니트로화 단백질 및 Fe-NOs의 측정은 이들 모든 화합물로부터 NO 가스를 화학량론적으로 방출하는 트리요오다이드(I3-)와의 반응 혼합물에 샘플을 첨가함으로써 수행될 수 있다:

I3- → I2 + I-

2NO2 - +2I- +4H + → 2NO + I 2 +2H2 O

I3 - + 2RS-NO → 3I - + RSSR + 2NO +

2NO + + 2I - → 2NO + I2

반면 I 3-은 NO 3-15와 반응하지 않습니다. 각 화합물의 정확한 측정은 수은 염화물 (HgCl2)의 유무에 관계없이 산성화 된 설파 닐 아미드 (AS)로 샘플 분취량을 전처리함으로써 가능합니다. 구체적으로, AS로 전처리하면NO2-함량이 모두 제거된다. 결과적으로, CLD에 의해 측정된 NO 함량은 S-NOs 및 Fe-NOs 농도의 합만을 반영한다. AS 주입 전에 샘플 분취량에 HgCl2를 주입하면NO2-가 S-NO에 의해 방출됩니다. AS로 처리(NO2-제거로 이어짐)는 측정된 NO 함량이 Fe-NOs의 농도만을 반영하도록 보장한다. 평가 사이의 일련의 감산은 세 개의 NO 유도체(22)의 정확한 농도를 계산할 수있게한다.

시약 혼합, 배양 및 화합물 측정 단계가 포함된 순차적 생화학 분석 다이어그램.
도 3: I3-아세트산 화학발광 분석에서I3-용 시료 제조 단계. 아세트산 화학발광 분석에서 I3-의 제조를 위한 순차적 단계가 예시된다. 광 보호 원심 분리 튜브의 사용이 필요합니다. 튜브 1, 2, 및 3은 분석을 준비하기 위해 사용되는 것들이다. 또 다른 샘플 분취량 (튜브 4)은 질산염 (NO3-)의 측정이 필요한 경우 HCl 분석에서VCl3에 필요합니다. 단계는 빨간색으로 숫자로 표시됩니다. 샘플 부피를 첨가하기 전에 포스페이트 버퍼 식염수(PBS) 또는 HgCl2로 표시된 바와 같이 예비충전(단계 1). 지시된 바와 같이 샘플 부피 (2)를 첨가하고, 볼텍스하고, 실온 (RT)에서 2분 동안 인큐베이션한다. 지시된 바와 같이 (3) PBS 또는 산성화된 설파닐아미드 (AS)를 첨가하고, 볼텍스하고, RT에서 3분 동안 인큐베이션한다. 분석법에 의해 측정된 농도는 각 튜브 하에서보고된 화합물의 농도의 합이다. 튜브 번호 1은 단일 신호로서 아질산염(NO2-), S-니트로소티올(S-NO) 및 철-니트로실 착물(Fe-NOs)의 측정을 허용한다. 질산염 (NO3-) 측정을 위해, 샘플은 HCl 분석에서 아세트산의 I3-와 VCl3 둘 다로 실행되어야하며, 튜브 1로부터 얻은 값은 튜브 4로부터 얻은 값에서 뺄 수 있어야합니다. *잔류NO2-, S-니트로소헤모글로빈 및 철-니트로실헤모글로빈의 결정을 위해 Hb 분석에 사용되는 제안된 양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

NO3-측정을 위해, 염산(HCl) 중의 바나듐(III) 클로라이드(VCl3)는 CLD를 사용한 NO3-화학량론적으로 측정하기 위해 퍼지 용기 내의NO3-로의 NO로의 전환에 사용된다:

2 NO3- + 3V + 3 +2H2O→ 2NO + 3VO2 + + 4H +

충분히 빠른 전환을 달성하기 위해, 반응은 90-95°C에서 수행될 필요가 있다. NO3-에서 NO2-로의 환원은 HCl에 의한 NO2-내지 NO의 환원과 결합된다. 바나듐 금속은 또한 그들의 NO 모이어티22,36을 해방시키는 S-NOs를 감소시킨다. HCl 중의 VCl3을 갖는 CLD에 의해 수득된 최종 농도는NO3-, NO2, 및 다른 니트로화 화합물의 응집체 농도를 반영한다. I3-를 사용한 CLD로 수득된 농도로부터 후자의 값을 뺀 것은NO3-농도 36,37의 계산을 허용한다(도 3).

NO 소비 분석에서, NO 공여체에 의한 퍼지 용기 내의 NO의 연속 방출은 (Z)-1-[2-(2-아미노에틸)-N-(2-암모니오에틸)아미노]디아젠-1-륨-1,2-디올레이트(DETA-NONOate)와 같은 NO 공여체에 의해 주입된 샘플에서 무세포 옥시Hb를 정량화할 수 있게 하는 안정한 신호를 생성한다. 퍼지 용기에서 소비되는 NO의 양은 샘플(38) 중의 oxyHb의 양과 화학양론적 관계에 있다.

혈장 샘플에서 무세포 Hb에 의한NO2-, NO3-, S-니트로소티올, 철-니트로실 착물, 및 NO 소비의 측정을 위한 프로토콜이 예시된다. RBC 환경에서 NO에 대한 연구는 총 Hb 농도15,22의 결정과 결합 된 매우 취약한 S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하기 위해 특정 샘플 처리 후 배제 크로마토그래피가 필요합니다. 샘플 준비는 측정을 교정하는 데 도움이됩니다. 분석 동안 H2O에서 NO2-의 사전 존재 및NO2-방출은 S-NO-Hb14,39와 같은 인위적으로 더 높은 농도의 NO 유도체의 측정을 유도할 수 있다. 샘플 준비의 중요한 측면도 제시됩니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 표시된 절차는 매사추세츠 종합 병원의 검토위원회에 따라 결정됩니다. 사용된 혈액 샘플은 이전 연구 동안 수집되었고, 현재의 목적(18)을 위해 비확인되었다.

주: 퍼지 용기, 세척 및 일반 유지 보수를 구성하는 튜브와 유리 제품 간의 최적 연결에 대한 구체적인 지침은 제조업체의 지침을 참조하십시오. 연결은 유리 제품을 손상시키지 않도록 단단하고 신중하게 만들어야합니다. 가스 유입 라인, 가열 재킷 및 응축기가있는 퍼지 용기, 수산화 나트륨 (NaOH) 가스 버블러 트랩, 퍼지 용기와 버블러 사이의 연결 라인, 퍼지 용기 출구 가스 라인 (CLD까지)에는 강렬한 전계 유전체 (IFD) 필터가 부여됩니다. 정화 용기와 CLD의 샘플 입구 사이의 IFD 필터 라인은 액체 형태의 NO 대사 산물 (플라즈마, 세포 배양물, 조직 균질물)이 측정 될 때마다 제자리에 있어야합니다 (프로토콜에 제시된 모든 분석). 샘플 준비는 분석되는 유체 또는 조직 및 관심있는 화합물에 따라 다릅니다. 사전 분석 단계의 중요한 측면은 섹션 1과 2에서 다룹니다. 특정 검정을 위한 특정 준비 단계는 섹션 3-5에 포함된다. 섹션 6-8은 모든 분석에 적용됩니다.

1. 전용시약의 제조

참고: 자세한 내용은 이전 간행물15,22를 참조하십시오.

  1. 500 mg의 설파닐아미드를 1N HCl 10 mL에 용해시켜NO2-제거를 위한 5% (290 mM) 산성화된 설파닐아미드 (AS) 용액을 준비한다. 이 솔루션은 몇 달 동안 안정적입니다.
  2. 67.9 mg의 HgCl2를 PBS 5 mL에 용해시킴으로써 S-NOs로부터 NO2-방출을 위한 50 mM 수은 클로라이드 (HgCl2) 용액을 제조하였다. 원액을 빛으로부터 보호하십시오.
  3. 티올기를 차단하기 위해 800 mM 페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]로 Hb를 산화시키기 위해 800 mM 페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]로NO2-블로킹 용액을 제조하고, 적색 세포막을 가용화하기 위해 10% 노닐페닐폴리에틸렌글리콜 용액(Nonidet p-40)을 제조하였다.
    1. 탈이온수 (ddH2O, 리터당 분말 263.5 g)에K3Fe(CN)6을 첨가하여 최종 농도 800 mM을 얻었다.
    2. ddH2O 용액 (100 mM 농도를 갖도록 리터 당12.5g의 분말)에서 800 mMK3Fe(CN)6에 NEM을 첨가하고 용액을 혼합하여 모든 결정을 용해시킨다.
    3. 800 mM NEMK3Fe(CN)6 100 mM NEM 용액 (리터당 111 mL)의 9 부분에 10% NP-40의 한 부분을 첨가하고 잘 섞는다 (전혈 분석을 위한 필수 단계).
  4. 그들의 원액으로부터 12 mMK3Fe(CN)6, 10 mM NEM, 100 μM 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA, 금속 킬레이트화용) 및 1% 노니데트 p-40 세제를 함유하는 S-NO-Hb 안정화 용액을 제조하였다.
    1. PBS (25 mg / mL, 예를 들어, PBS 중 250 mg)에 NEM 결정을 첨가하여 200 mM NEM 용액을 준비하고 모든 결정이 용해 될 때까지 용액을 혼합하십시오 (실험 당일에 제조).
    2. ddH2O (ddH2O5 mL 중 263.5 mg/mL 예컨대 1.32 g)에K3Fe(CN)6을 첨가하여 800mM K3Fe(CN)6 용액을 제조하여 800 mM의 최종 농도를 얻었다(실험당일에 제조됨).
    3. ddH2O200 mL에 DTPA 786 mg을 첨가하여 10 mM DTPA 원액을 제조하고 DTPA를 완전히 가용화하기 위해 5N NaOH로 pH를 7.0으로 조정하였다.
    4. 7.2 pH에서 PBS 81.5 mL에 200 mM NEM 용액 5 mL, 800 mMK3Fe(CN)6 용액 1.5 mL 및 DTPA 원액 1 mL를 첨가하고, 마지막으로 10% NP-40 11 mL를 마침내 첨가하여 최종 부피를 100 mL로 가져온다.

2. 샘플 수집

참고: 샘플 수집에 대한 자세한 내용은 이전에 출판된 작품 15,22,40을 참조하십시오.

  1. 전혈 수집
    1. 헤파린 코팅 튜브에 혈액을 모아 동맥 혈관보다 정맥을 선호하고 (특별히 필요하지 않은 경우) 용혈을 최소화하기 위해 적어도 20G 이상의 카테터 또는 바늘 보어로 정맥 천자 (가능한 경우)보다 카테터 배치를 선호합니다.
    2. NO2-블로킹 용액(전혈 4부에 용액 1부)을 즉시 첨가하고, 처리(섹션 3 또는 4)하거나, 동결시키고 -80°C에서 보관한다.
  2. 혈장 및 적혈구 (RBC) 수집
    1. 동맥혈보다 정맥을 선호하는 헤파린 코팅 튜브 (특별히 필요하지 않은 경우)와 적어도 20G 이상의 바늘에 혈액을 모아 용혈을 최소화하고 4 °C에서 4000 x g 에서 5 분 동안 즉시 원심분리하십시오.
    2. 상청액(플라즈마)을NO2-블로킹 용액(상청액의 4부까지 용액 1부)과 혼합하고 새로운 튜브(섹션 3 또는 4)에서 처리하거나(섹션 3 또는 4), 또는 -80°C에서 동결 및 보관한다.
      참고: NO 소비 분석의 경우,NO2-차단 용액을 사용할 수 없습니다. 상기 분석은 혈장 전처리 없이 수행될 수 있다.
    3. RBC 펠릿을 바닥으로부터 S-NO 안정화 용액 (단계 1.4 참조)으로 미리 충전된 새로운 튜브 (1 mL의 펠릿 내지 9 mL의 용액)에 재현탁시키고, 5분 동안 인큐베이션한다.
    4. RBC 용해물을 배제 크로마토그래피를 위해 이전에 ddH2O로 헹구어 온G-25세파덱스 중합체와 함께 사이징 컬럼에 통과시킨다.
    5. Hb 분획을 수집하여 처리하고(섹션 4) Drabkin의 시약을 사용하여 Hb 농도를 측정합니다(Hb 측정의 경우, 이전에 발표된 작업22 참조).
      참고 : 특정 조직 / 기관을 준비하고 샘플링하려면 그 틈새를 확인하고 외과 적으로 분리하십시오. 정맥을 절개하고, 동맥에 구멍을 뚫고, 동맥을 통해 헤파린화 식염수 (10 U / mL)를 주사하십시오. 식염수가 정맥 절개에서 역류하기 시작할 때 조직을 절제하십시오. 조직을 기계식 균질화기로 균질화하면서 균질화된 조직의 4 부에NO2-차단 용액 1 부를 첨가한다.

3. HCl 분석 제제에서 VCl3

참고 : HCl 분석 준비에서 VCl3에 대한 자세한 내용은 이전에 발표 된 작품37,41을 참조하십시오.

주의: 이 분석을 수행할 때 NaOH 트랩이 제대로 제자리에 있지 않으면 CLD가 손상됩니다. 이것은 HCl의 부식성 때문입니다.

  1. 표준 곡선에 대한 NO3- 의 표준 솔루션 준비
    1. 85 mg의NaNO3를 10 mL의 ddH2O에 용해시켜 0.1 MNaNO3-(이 용액은 몇 주 동안 안정하게 유지됨)를 얻었다.
    2. 원액을 사용하여ddH2O로 희석하여 표준을 준비하여 혈장 또는 소변 샘플에 대한 검량선을 수행하기 위해 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO3의 농도를 얻습니다 (세포 배양으로 작업하는 경우 더 낮은 농도 사용).
  2. 퍼지 용기에서 NO3-감소를 위해VCl3(염화바나듐) 포화 용액을 준비한다.
    주의: 물과 VCl3 의 반응은 발열성입니다. 산을 첨가 할 때와 실험이 끝날 때 유리 제품을 헹굴 때 높은 유리 제품 온도에주의하십시오.
    1. 1.6 g의 VCl3을 200 mL의 1 M HCl에 녹인 다음, 먼저 VCl3을 깨끗한 플라스크에 첨가한 다음, 200 mL의 1 M HCl을 첨가한다.
    2. 용액을 여과지를 통해 진공 여과한다(예: 11 μm 여과지, 그러나 임의의 여과지를 사용할 수 있다).
      참고 : 여과 된 용액은 맑은 파란색으로 변할 것이며, 여과되지 않은 VCl3 용액은 용해되지 않은 입자 때문에 갈색입니다.
    3. 화합물이 빛에 민감하므로 알루미늄 호일 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 테이프로 덮인 포화 용액을 보관하십시오.
  3. 순환 수조 준비
    1. 순환 수조 장치를 퍼지 용기의 워터 재킷에 연결하십시오. 프라이밍하기 전에 선이 건조한지 확인하십시오.
    2. 95°C에서 수조를 시작하고 라인 주위에 (비부착성) 종이 타월을 적용하여 워터 라인에 누출이 없는지 확인합니다.
  4. 가스 버블러 트랩 설정
    1. 버블러의 PTFE 슬리브가 제자리에 있고 손상되지 않았는지 확인합니다.
    2. 가스 버블러를 열고 15 mL의 1 M NaOH를 버블러 베이스에 주입한다.
    3. 가스 버블러를 재배치하고 하단을 위쪽으로 누르고 두 부분을 약간 비틀어 연결을 단단히 밀봉합니다. 힘을 가하지 않고 버블러의 상단을 돌릴 수 없다는 것은 올바른 씰을 나타냅니다.
    4. 퍼지 용기의 출구를 가스 버블러 트랩의 입구에 연결하십시오.

4.I3- 아세트산 분석 제제

참고: 아세트산 분석 제제에서 I 3-에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 저작 15,22,38,41,42를 참조하십시오.

  1. NO2-에 대한 표준 곡선 준비
    1. 69 mg의 아질산나트륨(NaNO2)을 10 mL의 ddH2O에 용해시켜 원액을 준비하여 100 mM 용액을 얻었다. 이 솔루션은 밀폐 용기에 보관하고 냉장 보관하며 빛으로부터 보호하면 안정적입니다.
    2. 원액을 900 μL의ddH2O로 미리 채워진 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 연속적으로 희석한다: 첫 번째 원심분리 튜브에 100 μL의 원액을 첨가하고, 혼합, 라벨링하고, 두 번째 튜브에 대해 100 μL의 튜브를 사용하고, 이어서 반복하여 10 mM, 1 mM, 이어서 100 μM의 결과를 초래한다.
    3. ddH2O로 추가로 희석하여 보정 곡선에 사용되는 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM 및 500 nM NaNO2 분취량을 얻었다.
  2. 퍼지 용기에 I3-아세트산을 준비한다(1주일 동안 실온(RT)에서 보관할 수 있음)22
    1. 요오드화칼륨(KI) 2g과 요오드(I2) 1.3g을ddH2O40mL와 아세트산 140mL에 첨가한다.
    2. 혼합물을 적어도 30분 동안 교반하여 충분히 혼합한다.
  3. NO2-, S-니트로소티올(S-NO-Hb, Hb가 수집되는 경우) 및 철-니트로실 착물(Hb가 수집되는 경우 Hb-NO)의 시차 측정을 위해 샘플을 준비합니다(그림 3).
    1. 각 샘플을 광보호 마이크로 원심분리 튜브에서 270 μL (S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하는 경우 900 μL의 Hb)의 3 분취량으로 나누고, 그 중 2 개는 30 μL의 1x PBS (S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하는 경우 100 μL)로 미리 채워지고 세 번째 튜브는 30 μL의 HgCl2 (S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하는 경우 100 μL)로 미리 채워지고, 와류하고 RT에서 2분 동안 인큐베이션한다(그림 3).
    2. Fe-NOs를 측정하기 위해 HgCl2를 갖는 샘플에 30 μL의 5% AS를 첨가하고, (Hb-NO의 경우 100 μL) 및 S-NOs 및 Fe-NOs를 측정하기 위해 PBS를 첨가한 것 (S-NO-Hb 및 Hb-NO의 경우 100 μL)을 측정하고, 30 μL의 PBS를 30 μL의 PBS를 이미 1x PBS로 미리 채워 30 μL를 첨가하여 Hb 수집으로부터 NO2-, S-NOs 및 Fe-NOs(잔류 NO2-에 대해 100 μL)를 측정하고, S-NO 및 Hb-NO). 소용돌이를 3분 동안 RT에서 인큐베이션한다(그림 3).

5. 셀 프리 Hb 설정에 의한 소비 없음

참고: 자세한 내용은 이전에 출판된 저작물(38)을 참조한다.

  1. 공지된 농도로 정제된 스톡 Hb 용액으로부터 표준 oxyHb 용액을 준비한다.
    1. ddH2O를 첨가하여 원액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 연속적으로 희석하여 검량선에 사용될 용액을 얻었다: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM, 1.56 μM.
  2. DETA-NONOate 용액 준비
    1. pH 7.4 PBS에서 10 μM NaOH 중 610 μL의 DETA-NONOate에 10 mg의 DETA-NONOate를 첨가하여 100 mM의 DETA-NONOate를 생성하고 이를 얼음 위에 보관한다.

6. 화학발광 검출기(CLD)를 시작하고 퍼지 용기를 준비한다.

주: 퍼지 용기의 준비에 대해서는, 이전에 발표된 작업(43)을 참조한다.

  1. CLD와의 기본 연결 확인
    1. 산소 라인을 CLD에 연결하고 CLD 제조업체와 일치하는 압력으로 산소 탱크를 엽니 다.
    2. IFD(집중 전계 유전체) 필터 라인이 CLD에 연결되어 있지만 퍼지 용기 또는 NaOH 트랩에는 연결되어 있지 않은지 확인하십시오.
  2. CLD 시작
    1. CLD 인터페이스에서 액상 분석을 위한 검출 프로그램 실행을 시작하십시오.
    2. 산소 공급이 적절한지 확인합니다. 이 경우 CLD는 입구에서 샘플링을 성공적으로 시작하고 밀리볼트 (0-5mV)의 신호로 감지를 나타냅니다. 그렇지 않으면 CLD가 네거티브 진단 신호를 프롬프트합니다.
  3. 퍼지 용기 준비
    1. 세 가지 포트 모두에서 퍼지 용기를 닫으십시오 : 바늘 밸브를 오른쪽으로 완전히 조이고 입구 및 출구 스톱콕을 닫으십시오.
    2. 정화 용기로부터 캡을 제거하고 계획된 분석법에 특이적인 시약의 충분한 양을 반응 챔버(표 1)에 첨가하여 샘플을 주입하는데 사용된 주사기 바늘이 유체 컬럼에 도달할 수 있도록 한다.
    3. 안정한 원하는 기준선의 존재를 검증한다(표 1).
  4. 퍼지 가스 흐름 시작
    1. 불활성 가스 탱크(예:N2)에 2단 조절기가 장착되어 있는지 확인하고 불활성 가스 탱크를 용기의 가스 입구와 연결하십시오.
    2. 1-5 psi의 조절기에서 출구 압력으로 가스를 열고 퍼지 용기의 입구를 열고 퍼지 용기의 바늘 밸브를 천천히 열어 가스가 유입 될 수 있도록하십시오. 퍼지 용기 내에서 버블링을 확인합니다.
  5. 가스 흐름 조정
    1. 주변 공기를 샘플링하는 IFD 필터 라인으로 CLD에 의해 측정된 셀 압력을 기록하십시오.
    2. 퍼지 용기 상에 캡을 재배치하고, IFD 필터 라인을 퍼지 용기에 연결하고(또는 HCl 분석에서 VCl3 내의 NaOH 트랩에), 퍼지 용기의 출구를 개방한다.
    3. 니들 밸브를 사용하여 주변 공기에 기록된 CLD 레벨에서 동일한 셀 압력에 도달하십시오.

7. 실험

참고: 실험에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 작업(43)을 참조한다.

  1. 화학발광 신호 수집 프로그램 시작
    1. CLD의 직렬 포트를 수집 프로그램이 설치된 컴퓨터의 직렬 포트에 연결합니다.
    2. 분석 프로그램을 실행합니다.
    3. 획득을 클릭하고 .data 파일을 저장할 폴더를 선택하고 파일 이름을 입력 한 다음 저장을 클릭하십시오.
      참고: 사전 설정된 시간이 경과하면 녹화가 자동으로 중지되므로 화면에서 미리 설정된 실행 시간을 확인합니다. 필요한 경우 사전 설정된 실행 시간을 늘릴 수 있습니다.
  2. 반복 시료 주입 준비
    1. 최소 및/또는 최대 버튼을 클릭한 다음 원하는 값을 입력하여 대상 기준선을 제어하도록 화면의 전압 배율을 조정합니다.
    2. ddH2O로 채워진20- 또는 50-mL 튜브를 가지고 샘플 사이의 주사기를 헹구십시오.
    3. 섬세한 작업 물티슈 상자를 쉽게 사용할 수 있습니다.
  3. 시료 주입
    참고: 보정 곡선에 대한 표준 솔루션(가장 덜 농축된 샘플에서 가장 농축된 샘플로 주입)에서 시작하여 실험 샘플로 진행하십시오(중복 또는 삼중으로 주입하는 것을 고려하십시오).
    1. 각 샘플을 철수하기 전에(그리고 각 주입 후)ddH2O로 주사기를 적어도 2배 이상 헹구고 작업 닦아내기에서 방해받지 않은 물이 분출될 때마다 확인하십시오.
    2. 주사기와 튜브를 모두 가까운 거리에 유지하면서 시료 튜브에 주사기를 삽입하고 플런저를 원하는 부피로 당기면서 기포 및/또는 비균질화된 고체 부품이 갇히지 않도록 합니다.
    3. 작업 와이퍼로 주사기의 팁을 닦은 다음 주사기를 주입구의 셉타 캡에 삽입하고 주사기의 팁이 반응 챔버 내의 액상 내에 있는지 확인한 후 주입합니다.
  4. 소프트웨어 프로그램에 주입을 표시하고 기다립니다.
    1. 주입으로 인해 신호가 위쪽으로 변경되는지 확인하고(보충 그림 1) (셀 프리 Hb 분석법에 의한 NO 소비량에서 아래쪽으로) 샘플 이름 아래의 회색 상자를 클릭하여 샘플 이름을 입력한 다음 마크 인젝션을 클릭합니다.
      참고: 시료 주입이 신호를 생성하지 않는 경우 주사기 폐색이 의심됩니다.
    2. 전기 신호가 기준선에 다시 도달 할 때까지 기다리십시오 (일반적으로 3-4 분 정도 소요됨). 이 시간은 7.3.1 단계를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
  5. 실험 종료 시와 주사 후 7.3 단계 및 7.4 단계에 표시된 모든 단계를 반복하십시오. 보존 솔루션의 샘플을 실행하는 것을 잊지 마십시오 (사용 된 경우)
  6. 실험 중지
    1. STOP을 클릭하여 신호 획득을 중단하고 CLD를 중지하고 수조를 끕니다 (NO3-가 측정 된 경우).
    2. 가스 흐름을 중단하고, 바늘 밸브를 열고, 퍼지 용기에서 캡을 제거하고, 폐기물 용기를 배수구 아래에 놓고 배수 스토콕을 엽니 다.
      참고: 실험에서 60분 이상 데이터 수집이 필요한 경우 실행 시간 60분 후(7.1.3단계 반복) 수집을 다시 시작하고 새 파일을 만들어야 합니다.

8. 측정 및 계산

참고: 측정 및 계산은 오프라인에서 수행되며 다른 시간에 수행할 수 있습니다.

  1. 오프라인 데이터 분석을 위한 화학발광 수집 프로그램 시작
    1. 프로그램을 시작하고 프로세스를 클릭하십시오.
    2. 실험 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
  2. 각 투여에 대한 곡선 아래의 면적 계산
    1. 이 소프트웨어는 기준선 (보충 그림 2A, 수평 노란색 선)과 각 샘플 투여에 의해 생성 된 각 파동의 피크 축 (세로 노란색 선)을 화면에 자동으로 그래프로 표시합니다 : 올바른 위치를 확인하고 (또는 각 라인을 클릭하고 마우스 또는 화살표로 이동하여 조정) 임계 값 확인 (보충 그림 2B)을 클릭하십시오.
      참고: 무세포 Hb 측정 분석법에 의한 NO 소비에서 소프트웨어는 일반적으로 샘플 주입에 의해 생성된 파형을 정확하게 캡처하지 못합니다. 각 파형을 확대함으로써 작업자는 영역 계산에서 소프트웨어를 쉽게 지원할 수 있습니다(보충 그림 2).
    2. 이 소프트웨어는 각 샘플 투여로 인해 발생하는 각 피크의 시작 (세로 녹색 선)과 끝 (세로 빨간색 선)을 자동으로 그래프로 표시합니다 : 올바른 위치를 확인하고 (또는 각 줄을 클릭하고 마우스 또는 화살표로 이동하여 조정) 통합 을 클릭하십시오 (보충 그림 2C).
      참고: 추적의 일부 영역은 이 시점에서 주입으로 잘못 정의될 수 있으며 일부 피크는 자동으로 두 번 계산될 수 있습니다. 두 실수 모두 8.2.2 단계에서 다시 식별하고 제거 할 수 있습니다.
    3. 이 소프트웨어는 실험 중에 표시된 주입 후 모든 신호 영역과 할당 된 이름을 자동으로 일치시킵니다 : 다음 피크 및 이전 피크를 클릭하여 할당 된 이름으로 각 피크 (노란색 세로선으로 표시됨)를 탐색 한 다음 버튼을 클릭하면 모두 확인] 버튼을 클릭하여 마침내 화면의 모든 영역에 대한 계산을 얻습니다.
    4. 사용자 또는 프로그램에서 만든 모든 이름 지정 또는 일치 실수를 수정하려면 보충 파일 1에 표시된 단추를 필요에 따라 사용하십시오.
  3. 보정 곡선 값을 스프레드시트로 전송하고 선형 회귀 방정식을 생성합니다(보충 그림 3).
    1. 복사 붙여 넣기를 통해 CLD 프로그램에서 새 스프레드 시트로 데이터를 전송하십시오. 데이터시트의 두 열을 표본 농도 및 곡선 아래 영역으로 정렬하고 두 열에 일치하는 0 값을 추가합니다.
    2. 두 열을 선택하고 분산형 삽입을 클릭> 다음 차트 디자인 메뉴에서 차트 요소 추가를 선택하여 추세선 > 선형>니다.
    3. 생성된 추세선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추세선 서식을 클릭한 다음 차트에 방정식 표시 옵션을 클릭하고 추세선 서식 메뉴의 차트에 R-제곱 값 표시 옵션을 클릭하여 간단한 선형 보정 방정식을 가져옵니다.
  4. 각 샘플의 계산된 면적을 전송하여 농도를 계산합니다(보충 그림 3).
    1. 스프레드시트의 모든 값을 보고합니다. 다음 컬럼에서, 단계 8.3.3으로부터 얻은 방정식을 적용하여 주입된 각 샘플의 농도를 구하고, 여기서 y는 농도(새로운 컬럼의 값)이고 x는 주입 후 측정된 곡선 아래의 면적이다.
      참고 : 보존 용액 (사용 된 경우)에서 측정 된 농도를 고려하고 그에 따라 값을 뺍니다.

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결과

무세포 Hb 분석법에 의한 NO 소비는 공지된 농도의 무세포 oxyHb를 함유하는 샘플에서 사용되었다(도 4). 옥시Hb의 하나의 헴이 화학량론적으로 분석에서 하나의 NO 분자를 방출함에 따라, 정제된 무세포 oxyHb는 검정에 대한 검량선을 구축하는데 사용된다(보충 도 3).

심장 수술 중 심폐 우회술(CPB)에서 벗어나는 환자에서 무세포 Hb(비색 분석법으로 측정됨)와 NO 소비 사이의 용량-반응 관계가 도 5에 도시되어 있다. CPB 후 Hb-Fe2+-O2 상태(도 5, 적색)에서 헴 그룹의 농도가 더 높다고 가정할 수 있는데, 이로부터 무세포 Hb의 헴 그룹 중 소수만이 NO를 소비하는 CPB 동안 NO를 투여받은 환자에 비해 (도 5, 적색

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토론

높은 민감도로 인해, NO 및 관련 화합물의 결정을 위한 화학발광 기반 분석은NO2-오염의 위험이 높다. 실험에 사용된 각각의 시약 (특히 NO2-차단 용액) 및 희석제 (ddH2O 포함)는 배경 신호에 대해 보정하기위해 그의NO2-함량에 대해 시험되어야 한다. 아질산염은 10분 전혈에서 반감기가 매우 반응하며NO3-를 빠르게 생성한다. 따라서 혈액 수집과 원심분리 또는NO2-차단 사이에 경과하는 시간은 사전 분석 오류를 일으킬 수 있으므로 최소화해야합니다15. 혈장 샘플을 이용한 분석에서, 바람직하게는 헤파린 튜브에 혈액을 수집하고, 250 mg의 NEM을 10 mL의 인산완충 식염수(PBS)에 용해시킴으로써 생성된 200 nM NEM의 40 μL로 티올기를 봉쇄한 후 4...

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공개 사항

L.B.는 용혈 및 산화 질소에 대한 그의 연구에 대한 수석 연구원으로 K23 HL128882 / NHLBI NIH로부터 급여 지원을받습니다. LB는 George Mason University의 Mercatus Center와 iNO Therapeutics LLC의 "COVID-19 연구를위한 빠른 보조금"으로부터 보조금을받습니다. B.Y.는 NHLBI / #R21HL130956 및 DOD / 제네바 재단 (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244)의 보조금으로 지원됩니다. B.Y.는 MGH에서 산화 질소의 전기 생성에 관한 특허를 받았습니다.

L.B.와 B.Y.는 2021년 6월 7일에 출원된 COVID-19 질병 PCT 출원번호: PCT/US2021/036269에서 NO 전달에 대한 특허 출원을 제출했습니다. RWC는 자원이 부족한 환경에 위치한 어린이의 결핵에 대한 분산 진단을 목표로하는 기술 개발의 수석 연구원으로 Unitaid로부터 급여 지원을받습니다.

감사의 글

이 원고에보고 된 프로토콜은 매사추세츠 종합 병원의 마취학과 인 워렌 자폴 (Warren Zapol) 박사의 중환자 치료 마취 연구 연구소의 이전 동료들의 축적 된 기여로 가능했습니다. 우리는 나카가와 아키토 박사, 프란체스코 자덱, 엠마누엘레 바세나, 정 레이, 나가사카 야스코, 에스테르 스파그놀리, 엠마누엘레 레조아글리 박사의 공헌을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산Sigma45754500 mL - 액체
소포제 B 에멀젼SigmaA5757250 mL - 액체
DETA NONOateCayman8212010 mg
Gibco DPBS (1x) 칼슘 없음, 마그네슘 없음ThermoFisher14190144500 mL
염산 37% (1 M)Sigma258148500 mL - 액체
요오드SAFC207772100 g - 고체
KimwipesKimtech34155
수은 (II) 염화물 ACS 시약> 99.5%Sigma215465100 g - 고체 (물에 용해)
Mili-Q 정수 시스템Millipore
모델 705 RN 50 μ L 주사기Hamilton80530마이크로리터 주사기
모델 802 N 25 μ L 주사기Hamilton84854마이크로리터 주사기
N-ethylmaleimideSigma426025 g - 결정질
질산화물 분석기 + 번들 소프트웨어 - 퍼지 용기ZysenseNOA 280i화학발광 검출기
Nonidet p-40  (NP-40)ThermoFisher8512510% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS 시약; 99%Sigma244023100 g - 분말
Potassium Iodide ACS 시약> 99%Sigma221945100 g - 고체
Potassium Nitrite cryst. 분석용 EMSURE ACSSupelco105067250g - 결정질
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251기계식 균질화기
RV3 2단 로터리 베인 펌프EdwardsA65201906진공 펌프 - 분석기와 함께 번들
파린 나트륨 - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD36787175 USP 단위
산화나트륨 무수 ACS 시약 &지; 97 %Sigma7954291 kg - 펠릿
질산 나트륨 ACS 시약 ≥ 99 %Sigma221341500 g - 분말
아질산 나트륨 ≥ 99 %SigmaS2252500 g - 결정질
설파 닐 아미드 ≥ 98 %SigmaS9251100 g - 고체
바나듐 (III) 염화물시그마11239325 g - 고체 -주의 (발열성)
Whatman 1 여과지시그마WHA10010155
헤 수

참고문헌

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