이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.
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방법 논문
라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
다세포 유기체의 발달과 항상성은 세포 이동의 조정 된 조절에 의존합니다. 세포 이동은 조직의 구성 및 재생에 필수적인 사건이며 배아 발달, 면역 학적 반응 및 상처 치유에 중요합니다. 세포 운동성의 조절 장애는 만성 염증 및 암 전이와 같은 병리학 적 장애에 기여합니다. 세포 이동, 조직 침윤, 축삭 및 수상 돌기 성장은 모두 액틴 중합 매개 세포 가장자리 돌출부로 시작됩니다. 여기에서는 확산 중 세포 가장자리 돌출 역학의 이미징 및 정량 분석을위한 간단하고 효율적이며 시간을 절약하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 돌출부, 수축 및 주름과 같은 세포 가장자리 막 역학의 개별 특징을 측정하고 주요 액틴 조절기의 조작이 다양한 맥락에서 세포 가장자리 돌출부에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
세포 이동은 모든 살아있는 유기체의 발달과 기능을 제어하는 중요한 과정입니다. 세포 이동은 배아 발생, 상처 치유 및 면역 반응과 같은 생리적 조건과 암 전이 및 자가면역 질환과 같은 병리학적 조건 모두에서 발생합니다. 서로 다른 철새 사건에 참여하는 세포 유형의 차이에도 불구하고, 모든 세포 운동성 사건은 원생 동물에서 포유류로의 진화에서 보존 된 유사한 분자 메커니즘을 공유하며, 환경을 감지하고, 신호에 반응하고, 반응에서 세포 행동을 조절할 수있는 일반적인 세포 골격 조절 메커니즘을 포함합니다1.
세포 이동의 초기 단계는 세포의 최첨단에서 매우 역동적인 돌출부를 형성하는 것일 수 있다. 라멜리 포디움 뒤에는 액틴을 미오신 II 매개 수축성에 결합시키고 기본 기질에 대한 접착을 매개하는 라멜라를 찾을 수 있습니다. 라멜리포디아는 성장 인자, 사이토카인 및 세포 부착 수용체와 같은 세포외 자극에 의해 유도되며, 액틴 중합에 의해 구동되며, 이는 원형질막을 앞으로 밀어내는 물리적 힘을 제공한다2,3. 많은 신호전달 및 구조 단백질이 이에 연루되어 있다; 그 중에는 Arp 2/3 복합체, WASP ....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 Bar-Ilan University의 IACUC (Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
참고: 이 절에서 설명하는 절차의 단계별 그래픽 묘사가 그림 1에 나타납니다.
1. 세포 배양
참고: 프로토콜에 사용된 세포는 야생형 C57BL/6 마우스의 E11.5-13.5 배아로부터 생성된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)이다. 일차 MEF는 잭스 실험실 프로토콜13에 따라 생성되었다. 다섯 개의 상이한 배아로부터의 세포를 함께 풀링하고, SV40 큰 T 항원을 발현하는 레트로바이러스 벡터로의 감염에 의해 불멸화시키고, 이어서 3주 동안 4 mM 히스티디놀로 선별하였다.
- 세포를 1 g/L 글루코스, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 함유하는 조직 배양 플레이트에서 37°C에서 5% ....
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결과
도 2에 기술된 실험에서, 불멸화된 MEFs를 피브로넥틴으로 사전 코팅된 유리 바닥 접시에 플레이팅하여 인테그린 매개 신호전달을 활성화시키고, 변성된 BSA에 의해 차단하여, 인테그린 활성화에 의존하지 않는 세포 부착을 위한 자유 전위 부위를 차단하였다. 실험 당일에 세포의 70%-80% 합류에서 대수 성장 단계에 도달하기 위해, 0.7 x 106 MEFs를 실험 16 h 전에 10 cm 직경의 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 실험 당일, 세포를 트립신화하고 계수하고, 20,000개의 세포를 피브로넥틴/BSA 코팅된 유리 바닥 접시에 플레이팅하였다. 디쉬를 영상화 전에 세포의 부착 및 확산을 허용하기 위해 37°C에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 현미경 인큐베이터 챔버 (37°C, 5% CO2)에 넣고, 단일 세포를 위상광에서 40x 건조 렌즈를 사용하여 이미지화하였다. 이미징은 세포가 이동하기 시작하기.......
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토론
돌출부, 수축 및 주름으로 구성된 세포 가장자리 돌출 역학은 세포 운동성에서 전제 조건이자 잠재적 인 속도 제한 사건입니다. 여기에서는 확산 중 세포 가장자리 돌기의 역학을 측정하기위한 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 단시간 이미징을 가능하게 하고, 상당한 양의 데이터를 생성하며, 세포의 형광 표지 또는 고가의 형광 현미경 검사 장비를 필요로 하지 않으며, 더 많은 자원을 요구하는 방법을 수행하기로 결정하기 전에 세포 운동성에 관여하는 세포골격 역학을 테스트하기 위한 예비 방법으로 사용될 수 있다. 또한,이 분석에서 녹아웃 또는 녹다운 세포 및 / 또는 단백질 돌연변이를 세포 골격 역학에 관련된 중요한 단백질 및 잠재적 인 신호 전달 메커니즘을 확인하는 빠르고 간단한 도구로 사용할 수 있습니다.
참고로, 돌출 분석을 위해 올바른 세포를 선택하는 것이 중요합니다. 세포는 확산을 허용하기 위해 영화가 획득되기 전에 15 분 동안 배양됩니다. 확산 중 돌출부를 측정하기로 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH MH115939, NS112121, NS105640 및 R56MH122449-01A1 (Anthony J. Koleske)과 이스라엘 과학 재단 (보조금 번호 1462/17 및 2142/21) (Hava Gil-Henn)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10cm 세포 배양 플레이트 | Greiner | P7612-360EA | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | 배지는 고포도당(4.5g/L D-glucose)을 함유하고 |
| . s 인산염 완충 식염수(1xDPBS) | 생물학 산업, 이스라엘 | 02-023-1A | |
| 소 태아 혈청(FBS) | 생물학 산업, 이스라엘 | 04-001-1A | |
| 인간 혈장에서 추출한 피브로넥틴, 액체, 0.1%, 세포 배양에 적합 | 시그마-알드리치 | F0895 | |
| 유리 바닥 접시 | 셀비스 | D35-20-1.5-N | 35mm 유리 바닥 접시, 접시 크기 35mm, 우물 크기 20mm, # 1.5 커버 유리 (0.16-0.19mm). |
| ImageJ 소프트웨어 | NIH | Feely 사용 가능: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | ORCA-Flash 4.0 V2 디지털 CMOS가 장착된 현미경 | ||
| 수집 소프트웨어 Leica AF6000 | Leica | 위상차 광학 장치가 장착된 거꾸로 명시야 현미경(40x, NA 1.3) 및 위상차 광학 장치가 장착된 CO2 장치, 인큐베이터 및 LAS AF 수집 소프트웨어가 장착된 CO2 장치 ORCA-Flash 4.0 V2 디지털 CMOS 카메라 . | |
| L-글루타민 용액 | 생물학 산업, 이스라엘 | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 디지털 CMOS 카메라 | 하마마츠 포토닉스 | ||
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | 생물학 산업, 이스라엘 | 03-031-1B | |
| 트립신-EDTA 용액 B(0.25%), EDTA(0.05%) | 생물 산업, 이스라엘 | 03-052-1A |
참고문헌
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112<....
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재인쇄 및 허가
