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방법 논문

로스 수술의 설치류 모델: 전신 위치에 있는 합성 폐 동맥 이식 이식

2.7K 조회수

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DOI:

10.3791/63179

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2022년 4월 1일

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1Pediatric and Congenital Cardiac Surgery Unit, Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Sciences and Public Health, University of Padua, 2Pediatric Cardiology Unit, Departments of Women’s and Children’s Health, University of Padua, 3Labatt Family Heart Centre, Department of Cardiovascular Surgery, The Hospital for Sick Children, University of Toronto

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 로스 절차를 시뮬레이션하기 위해 내림차순 대동맥에 폐 뿌리 이식의 뮤린 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 전신 위치에서 폐 자동 이식 리모델링의 중장기 평가를 가능하게 하며, 이는 적응을 촉진하기 위한 치료 전략 개발의 기초를 나타냅니다.

초록

대동맥 판막 질환에 대한 로스 수술은 뛰어난 장기 결과로 인해 새로운 관심을 회복했습니다. 그럼에도 불구하고, 독립형 뿌리 교체로 사용될 때, 폐 자동 이식 및 후속 대동맥 역류의 가능한 팽창이 설명된다. 여러 동물 모델이 제안되었습니다. 그러나, 이들은 일반적으로 상대적으로 비싼 큰 동물 모형을 가진 전 생체 내 모형 또는 생체 내 실험으로 제한됩니다. 이 연구에서는, 우리는 전신 위치에 폐 동맥 이식 (PAG) 이식의 설치류 모형을 설치하기 위하여 노력했습니다. 총 39 명의 성인 루이스 쥐가 포함되었습니다. 안락사 직후, 폐 뿌리는 기증자 동물 (n =17)에서 수확되었다. Syngeneic 받는 사람 (n=17) 및 가짜 조작 (n=5) 쥐 진정 및 환기 되었다. 수령군에서 PAG는 적외선 복강구대동맥의 종단 간 해부학으로 이식되었다. 샴 조작 쥐는 대동맥의 횡부와 재해부학를 겪었습니다. 동물은 2 달 동안 연쇄 초음파 연구와 사후 조직학 분석으로 뒤따랐습니다. 기본 위치의 중간 PAG 직경은 3.20mm(IQR=3.18-3.23)였다. 후속 조치시 PAG의 평균 직경은 1주에 4.03mm(IQR=3.74-4.13), 1개월 4.07mm(IQR=3.80-4.28), 2개월(p<0.01)에서 4.27mm(IQR=3.90-4.35)였다. 피크 수축기 속도는 1주에 220.07mm/s(IQR=210.43-246.41)였습니다. 430.88 mm/s(IQR=375.28-495.56) 1개월, 2개월(p=0.02)에서 373.68 mm/s(IQR=305.78-429.81)가 실험(p=0.02)의 샴 작동 그룹과 다르지 않았다. 조직학적 분석은 내피 혈전증의 흔적을 나타내지 않았다. 이 연구는 설치류 모델이 고압 시스템에 폐 뿌리의 장기 적응의 평가를 허용 할 수 있음을 보여 주었다. 체계적으로 배치된 회진 PAG 이식은 로스 수술의 결과를 더욱 개선하기 위해 새로운 수술 기술 및 약물 치료법의 개발 및 평가를 위한 간단하고 실행 가능한 플랫폼을 나타냅니다.

서론

선천성 대동맥 판막 협착증은 병변이 valvular 수준에 있는 좌심실 관의 방해를 특징으로 하는 선천성 심장병의 하위 그룹입니다. 기형은 1000의 살아있는 출생 1 당 대략 0.04-0.38에 영향을 미칩니다.

보정에 사용할 수있는 옵션은 많은, 각각 자신의 장점과 단점. 심실 교정에 적합한 환자의 경우2, 접근법은 밸브 수리(경피 또는 외과적 valvulotomy) 또는 그 대체3을 목표로 할 수 있다. 대동맥 판막이 회수할 수 없는 것으로 간주될 때 후자는 바람직합니다. 그러나, 유효한 선택권은 소아 환자를 위해 제한됩니다. 실제로, 생체 보철판은 초기 석회화4때문에 젊은 인구에 있는 대동맥 대체를 위해 표시되지 않습니다. 한편, 기계식 밸브의 변성은 상당히 느리지만 평생 항응고제 요법5가 필요합니다. 추가에서, 이 보철물의 중요한 한계는 추가 재내정간섭에 환자를 걸리기 쉬운 성장 잠재력의 부족에 의해 표현됩니다.

소아 인구에서 흥미로운 치료 옵션은 "Ross 수술"이라는 대동맥 위치로 폐 자가 이식을 전달하는 것입니다. 이 경우 폐 판막은 동종 이식으로 대체됩니다(그림 1)6. 이 절차는 폐 자가 이식이 성장 잠재력을 보존하고 평생 항응고제 치료의 위험을 수행하지 않기 때문에 아마도 어린이를위한 최선의 수술 선택을 나타낼 수 있습니다. 또한, 로스 절차는 또한 최고의 수술 솔루션이 될 수있는 잠재력을 갖는, 기계적 또는 생물학적 밸브를 피하기 위해 젊은 성인에서 큰 가치가있을 수 있습니다.

폐 자동 이식과 대동맥 판막 교체 후 결과는 우수한, 생존보다 큰 98% 좋은 장기 결과7. 문학 연구는 보고 93% 그리고 90% 폐 균종 교체에서 자유 4 그리고 12 년, 각각8.

이 절차의 주요 제한은 특히 독립형 루트 대체로 사용되는 경우 장기적으로 팽창하는 자동 이식의 경향입니다. 이것은 재개입을 요구할 수 있는 용감한 무능을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 실제로, 지금까지 수행 된 가장 긴 후속 연구는 10 년 에서 88 %와 20 년 에서 75 %의 자동 이식 교체를위한 재작업에서 자유를보고합니다.

실험 적인 환경에서 Ross 작업을 다시 만들 가능성은 전신 압력에 대한 폐 자동 이식 적응의 기본 메커니즘을 조사하기위한 기본 전제 조건입니다. 여러 모델이 과거에 제안되었습니다. 그러나, 이들은 일반적으로 상대적으로 비싼 큰 동물을 가진 전 생체 내 실험 또는 생체 내 동물 모형으로 제한됩니다. 이 연구에서는, 우리는 독립형 뿌리로, 전신 위치에 폐 동맥 이식 (PAG) 이식의 설치류 모형을 설치하기 위하여 노력했습니다.

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프로토콜

모든 절차는 파도바 대학 동물 관리위원회 (OPBA, 프로토콜 번호 n ° 55/2017)에 의해 승인되었으며 이탈리아 보건부 (승인 n ° 700/2018-PR)에 의해 승인되었으며, 유럽 연합 지침 2010/63 /UE 및 이탈리아 법률 26/2014 동물 치료 및 실험실에 대한 허가.

1. 동물 관리 및 실험 모델

  1. 모든 루이스 쥐가 단일 회사(재료 표)로부터 얻을 수 있는지 확인합니다. 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 기존의 시설에서 쥐를 유지합니다.
  2. 쥐의 무게가 받는 그룹의 경우 320-400 g, 기증자 그룹을 위한 200-250 g의 범위인지 확인합니다.

2. 수술 전 프로토콜

참고: 모든 작업은 깨끗한 조건에서 수행해야 합니다. 남성과 여성 성인 루이스 쥐를 수혜자 및 기증자로 사용 하 여 뿐만 아니라 syngeneic 이식을 수행 하기 위해.

  1. 트라마돌 (5 mg/kg)의 내 간 주사를 수행 15 수술 전에 분.
  2. 수술 직전에 근육 내 겐타미신(5 mg/kg)의 단일 용량을 투여하십시오.
  3. 마취 유도의 경우, 동물이 배치되는 폴리 (메틸 메타크릴레이트) 챔버에 산소의 1 L / 분에 4 % 세보플루란을 공급합니다. 마취 유지 보수의 경우 시술 내내 산소 1 L /min에 2.0-2.5 % 세보플루란을 사용하십시오.
  4. 흉골에서 1cm까지, 면도기로 생식기 부위 위로 2cm 너비로 중강을 따라 동물을 면도합니다. 그런 다음 요오드 용액으로 피부를 살균합니다.
  5. 동물이 젖지 않도록 하고 수술 중 열 분산을 방지하기 위해 투명 플라스틱 필름으로 동물을 덮습니다.
  6. 유해 자극에 대한 응답의 부재를 평가하여 절차를 수행하기 전에 마취 수준을 평가합니다.

3. 기증자 운영

  1. 동물 및 심장 준비:
    1. 마취된 동물을 코르크 트레이에 놓고 외과 의사를 마주보고 있는 코크말측을 놓습니다. 약 5-6cm의 시포 음모 절개를 수행하고 두 개의 근육 플랩을 측면으로 철회합니다.
    2. 복부 정맥 카바를 통해 헤파린500 IU를 함유하는 4°C에서 식염수 용액 1mL의 부피를 투여한다.
    3. 1분 후, 다이어프램을 왼쪽에서 오른쪽으로 자르고 전방 흉부 절제술을 수행하여 심장을 드러냅니다.
    4. 식염수 용액을 4 °C에서 떨어 뜨리면 박동 심장을 식힙니다.
    5. 대동맥 아치의 완전한 보기를 얻기 위해 pericardiectomy와 백리향절제술을 수행합니다. 대명사 주변의 나머지 지방 조직을 제거합니다.
    6. 아치에서 잘라, 바로 위에 지명 동맥의 기원; 후자의 것도 끊어.
    7. 흉부 열등한 베나 카바(IVC)를 자르고 22G 캐뉼라를 삽입하여 4°C에서 식염수 용액20-25mL로 심장에 주입하여 가벼운 압력을 가합니다. 심장박동을 멈추고 대어타에서 흘러나오면 관류를 중단한다.
  2. PAG 절제:
    참고: PAG의 정확한 수확과 섬세한 취급은 수령인에게 최적의 이식을 달성하기 위해 필수입니다. 악기로 직접 만지지 말고 면 봉면을 사용하십시오.
    1. 기본 위치에서 PA 직경을 평가하기 위해 초음파 연구를 수행하십시오.
    2. 혈관의 후방 벽 아래에 마이크로 펜치를 삽입하고 PAG의 길이를 최대화하기 위해 양면에 가능한 한 가까운 마이크로 가위를 사용하여 후자를 잘라냅니다.
    3. 고리 팁 마이크로 포셉으로 PA를 부드럽게 잡고 마이크로 스프링 가위로 오른쪽 심실과 분리합니다. 오른쪽 심실 근육을 포함하여 PAG를 수확하십시오.
  3. PAG 준비:
    1. 수술대에 차가운 식염수로 축화된 거즈위에 PAG를 놓고 작동 현미경하에서 혈관을 검사합니다.
    2. 풍부한 주변 조직을 잘라 내고 심실 근육은 1mm밖에 남기지 않습니다. 용기의 길이를 5mm로 설정합니다.

4. 폐 동맥 이식편 (PAG) 이식

  1. 수령인 동물의 준비:
    1. 마취된 동물을 코르크 트레이에 놓고 외과 의사를 마주보고 있는 코크말측을 놓습니다.
    2. 중앙값 세로 절개를 수행하고 두 개의 미니 리트랙터를 사용하여 복부를 열어 두십시오.
    3. 2개의 면봉으로 내장을 추출하고 39°C 식염수로 담근 거즈로 덮어 적외선 복부(AA)의 노출로 레트로페리톤 영역의 시각화를 허용합니다.
      참고: 수술 중, 설치류에서 흔히 볼 수 있는 저체온증을 방지하기 위해 39°C 식염수함유 주사기를 사용하여 내장을 식히면 때때로 습하는 것이 중요합니다.
    4. 두 개의 신장 동맥과 두 개의 면 봉면을 사용하여 흉막 분기 사이의 후방 정수리 복리를 제거하고 frarenal AA 주변의 지방 조직을 제거합니다. AA 위에 지방의 작은 부분만 두고 용기에 대한 취급을 용이하게 하십시오.
    5. AA를 IVC에서 분리합니다. 이 절차를 수행하려면 먼저 후방 대동맥 벽 뒤에 곡선 된 집게를 전달하고 AA와 IVC 사이의 통로를 여는 데 사용합니다. 그런 다음 2-0 실크 봉합사를 사용하여 AA 주위에 루프를 생성하여 선박을 들어 올리고 AA를 IVC에서 분리하십시오. 6/0 실크 봉합사를 가진 frarenal AA에서 생기는 모든 요추 동맥을 리게이트하고 분할하십시오.
    6. 동물을 시계 반대 방향으로 회전하여 머리를 작업자의 왼쪽에 놓습니다. AA는 이제 현미경 필드에 수평으로 누워.
    7. 두 개의 야사르길 클립을 사용하여 frarenal AA를 고정하고 서로 1.5cm의 거리에 놓습니다. 두 클립 사이의 중간점에서 AA를 변환합니다.
    8. 식염수 용액에 헤파린(1 UI/mL)으로 선박의 두 끝을 관개하여 혈전을 제거합니다. 선박에서 모험 파편을 제거합니다.
  2. PAG 이식:
    1. 심실 끝이 동물의 두개골 부분을 향해 PAG를 두 끝 사이에 놓습니다.
    2. 10-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 PG를 AA에 연결하는 두 개의 랜드마크 싱글 스티치를 수행합니다. 배 주위의 반대쪽에 봉합사를 배치하여 PAG의 양쪽 끝에서 절차를 수행합니다.
    3. PAG와 AA 사이에 종단 간 해부학을 수행하며, 말단 끝으로 시작합니다. 후부 해부학에 대 한 단상 랜드마크 봉합사의 두 끝 중 하나를 사용 하 여 받는 사람-접목 아웃/인-아웃 시퀀스를 사용 하 여 약 6 바늘의 실행 봉합사를 수행.
    4. 봉합사가 근근의 랜드마크에 도달하면 봉합사와 근근 의대 합사의 두 끝 중 하나를 사용하여 사각형 매듭으로 완성된 반쪽 히치를 수행합니다. 고무 밀드 모기 집게를 봉합사에 바르면 견인력을 제공합니다.
    5. 전방 벽에 동일한 해부학을 수행합니다. PAG의 근해 끝에 전체 절차를 수행합니다. 봉합사 선에 전단지를 포함하지 않도록 근위 해부학을 수행 할 때 특별한주의를 기울이십시오.
    6. 해부학을 확인하기 위해 PAG가 역행 혈액 (저압 흐름)으로 채워질 수 있도록 먼저 말단 클립을 놓습니다. 단일 봉합사로 혈액 누출을 복구합니다. 말단 해부학이 평가되면 근위 쪽 끝에서 동일한 절차를 수행하십시오.
  3. 받는 사람에서 작업의 최종 단계:
    1. PAG의 친자성을 평가하고 PAG의 양쪽에 있는 봉합사 선 위에 젤라틴 스폰지의 두 스트립을 적용합니다(필요한 경우). 두 면 봉면으로 몇 초 동안 부드러운 압력을 가하여 헤모스티스를 돕습니다.
    2. 내장을 복강으로 옮기고 4/0 폴리프로필렌 실행 봉합사로 벽을 닫습니다.

5. 샴 운영 절차

  1. 이전에 수신자 쥐에 대해 설명한 것과 동일한 동물 제제를 수행합니다.
  2. 신장과 장악 동맥의 기원 사이의 중간 적외선 AA를 잘라.
  3. 이전에 설명한 대로 종단 간 해부학을 사용하여 AA의 두 끝을 다시 상종합니다. 두 클립을 제거하고 정확한 hemostasis 절차를 수행합니다.
  4. 창자를 재배치하고 받는 동물과 마찬가지로 복벽을 층으로 닫습니다.

6. 수술 후 치료 및 후속 조치

  1. 수분을 공급하기 위해 동물의 등피 조직에 따뜻한 식염수 용액(5mL)을 투여한다. 가열 램프 아래에 쥐를 놓고 마취가 중지 된 후 일반적으로 최대 5 분 이내의 각성 때까지 시각적으로 모니터링하십시오. 22-24°C의 실온에서 동물을 케이지에 넣고 음식과 물에 즉각적이고 무제한으로 접근할 수 있습니다.
  2. 수술 후 진통제를 위해 근육 질항제 (5 mg/kg)를 수술 후 첫 48 시간 동안 매일 두 번 투여하십시오. 그 후, 정기적으로, 매일 받는 사람의 건강 상태 와 체중을 모니터링.
  3. 후속 조치: 후속 조치 중 PAG 기능을 평가하기 위해 1주일, 1개월, 2개월에 세리에이트 초음파 검사를 수행합니다. 이러한 연구 기간 동안, 혈관 직경, 피크 수축속도(PSV) 및 최종 확장기 속도를 측정합니다. PAG 내부와 근위 및 단층 AA 수준에서 이러한 매개 변수를 측정합니다.
  4. 몇 분 동안 CO2 의 응용 프로그램에 의해 후속의 두 달 후 동물을 안락사, 다음 조직 병리학 분석을 받게됩니다 PAG를 축출.

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결과

이 연구에는 총 39마리의 성인 루이스 쥐가 포함되었습니다: 17마리의 동물이 PAG 기증자로 사용되었고, 17마리는 수령인으로, 5마리는 가짜 조작(대조군)(표 1)으로 사용되었다. 수컷 쥐는 22명(56%) 및 암컷 17(44%)이었다; 후자는 기증자 그룹에서만 사용되었다.

100% 생존을 가진 수술 도중 치명적인 사건이 일어나지 않았습니다. 후속 기간 동안, 이식 그룹의 두 동물은 각각 12 일과 51 일에서 치명적인 결과를 보였습니다. 연구 끝에 생존율은 91%였다(표 1).

쥐의 중앙값은 387g(중간 사수 범위, IQR, 358-394 g)였으며, 기증자 군을 위한 328g(IQR=304-337 g)이었다. 수술 후 1주일 동안 중간 체중은 363g(IQR=350-376g)으로 수술 전 체중대비 6% 감소하였다. 동물은 후속 의 첫 달 이내에 자신의 무게를 회...

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토론

자가 폐 뿌리 (Ross 작동)를 가진 대동맥 판막 교체는 자동 이식10의 유리한 프로파일 및 잠재적 인 성장으로 인해 선천성 대동맥 판막 협착 수리를위한 매력적인 옵션을 나타냅니다. 이 절차의 주요 제한은 장기 역류의 개발에 걸리기 쉬운 대동맥 네오 밸브의 잠재적 확장입니다. 전신 압력에 노출 된 후 폐 동맥에 대한 수정을 특성화 할 가능성은 폐 자동 이식 실패의 원인을 이해하는 기초를 나타낼 수 있습니다. 이러한 이유로, 설치류 모델의 전신 위치에서 심제닉 PAG 이식의 실험 모델을 개발했습니다.

보고된 외과 기술은 안전하고 효과적이며 재현가능합니다. 사용된 동물의 작은 크기는 수술 및 수술 후 관리를 단순화합니다. 이를 통해 재료와 동물비가 제한된 유용한 모델을 얻을 수 있었습니다. 루이스 쥐는 근친 변형으로, 이 쥐는 동종, 이상 99% 그들의 진상계고정 때문에 선택되었습니다. 따라서, 그들은 동물 들 사이 폐 판막의 이식의 연구...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 2019년 부서 간 연구(BIRD)를 위한 통합 예산에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨Monico SpAAIC 030805105100mL 2병. 차가운 것(4° C) 수확 기관을 세척하기 위해; 따뜻한 것(39° C) 수혜자의 보습 및 재수화를 위해
7.5 % 포비돈 - 요오드B BraunAIC 032151211
BarraquerAesculapFD 232R혈관 문합 용 스트레이트 마이크로 바늘
홀더 Castroviejo 바늘 홀더사용할 수 없음J 4065동물 클립을 닫으려면
겸자Rudolf MedicalRU 3994-05클립 응용 프로그램
면봉Johnson & Johnson Medical SpAN/A슈퍼마켓 제품. 멸균
된 곡선 마이크로 보석 집게Rudolf MedicalRU 4240-06꽃병 아래에 봉합사를 통과시키는 데 사용됩니다.
탈모 크림RB 헬스케어N/A슈퍼마켓 제품
전기 소작기LED SpASurton 200
파인 가위Rudolf MedicalRU 2422-11복부 개방용(수신자)
팁 곡선 Vannas 마이크로 가위AesculapOC 497R폐근 준비 전용, 요추 꽃병 절단 및 10/0 Prolene
Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unitHarvard Apparatus LtdK 017041흡수 필터가 있는 마취기, 마취 튜브, 유도 챔버 및 청소부 장치 완료
GentamycinMSD Italia SrlAIC 020891014항생제. 단일 용량, 5mg/kg 근육 주사, 수술 중 투여
HeparinPharmatex Italia SrlAIC 034692044500IU를 수혜자에게 복부 대정맥
IV 카테터Smiths Medical Ltd403620G
인슐린 주사기, 1mLFisher Scientific14-841-33수확 동물에 헤파린을 주입하고 수혜
자의 절편된 대동맥을 세척합니다.보석상 양극성 집게GIMA SpA306650.25 mm 팁 매우 작은 꽃병
Lewis rats (LEW/HanHsd)Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy86104M수컷 또는 암컷, 무게 200-250g(폐근 수확 동물) 및 320-400g(수혜자)
Micro-MosquitoRudolf MedicalRU 3121-104개, 팁은 실리콘 튜브로 덮여 있습니다. 문합 중 Prolene 봉합사의 견인력을 유지하기 위해
작동 현미경Leica MicrosystemsM 400-E6x, 10x 및 16x 절차 내 교체 가능한 배율과 함께 사용
Perma-Hand silk 2-0Johnson & 존슨 메디컬 스파C026D대동맥
바셀린 안과 연고DechraNDC 17033-211-38
Prolene 10-0Johnson & Johnson Medical SpAW2790BV75-3 원형 바늘이 있는 매우 미세한 비흡수성 봉합사 혈관 문합
견인N/A2개의 집에서 만든 견인기
링 팁 마이크로 집게 RudolfMedicalRU 4079-14섬세한 조작용
SevofluraneAbbVie SrlAIC 031841036산소와 혼합, 흡입 마취용
스프링 타입 마이크로 가위루돌프 메디컬RU 2380-14스트레이트; 14cm 길이
표준 동맥류 클립루돌프 메디RU 3980-12대동맥을 닫는 두 개의 클립 (7.5 mm, 180 g, 1.77 N)
부직포 소재의 멸균 거즈루이지 살바도리 스파26161V7.5x7.5 cm, 4 레이어
스트레이트 도옌 가위루돌프 메디컬RU / 1428-16기증자에게 사용
마이크로 주얼러 겸루돌프 메디컬RU 4240-0410.5 cm 롱 문합 전반에 걸쳐 사용
주사기:Artsana SpA,N/A20mL(수확 동물용) 및 5mL(수혜자용). 식염수 세척 및 침지를 위해
TiCron 4-0CovidienCV-331근육 및 피부 폐쇄 조직
V. MuellerMcKessonCH 6950-009피부 및 근육에 사용
TramadolSALF SpAAIC 044718029진통제. 단일 용량, 5 mg/kg 근육 내
버진 실크 8-0Johnson & Johnson Medical SpAW818동맥 분지 결찰술용
파인 의 전기 소작용 기 컬 자 : : 겸자용

참고문헌

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로스 수술의 설치류 모델: 전신 위치에 있는 합성 폐 동맥 이식 이식
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