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방법 논문

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

4.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63269

⸱

2022년 3월 22일

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

초록

미생물 세포 공장은 재생 가능한 공급 원료에서 화학 물질 및 재조합 단백질을 생산하기위한 지속 가능한 대안을 제공합니다. 그러나 유전자 변형으로 미생물에게 과도한 부담을 주면 숙주 적합성과 생산성이 떨어질 수 있습니다. 이 문제는 동적 조절을 사용하여 극복 할 수 있습니다 : 효소 및 경로의 유도 가능한 발현, 일반적으로 화학 물질 또는 영양소 기반 첨가제를 사용하여 세포 성장과 생산의 균형을 유지합니다. 광유전학은 유전자 발현을 동적으로 조절하는 비침습적이고, 고도로 조정가능하며, 가역적인 방법을 제공한다. 여기에서는 화학 물질 또는 재조합 단백질 생산을 위해 조작 된 에스케리치아 콜리 및 사카로 마이스 세레 비시아 (Saccharomyces cerevisiae )의 광 조절 발효를 설정하는 방법을 설명합니다. 우리는 발효 제어 및 생산성 향상을 위해 미생물 성장과 생산을 분리하기 위해 선택된 시간과 복용량에 빛을 적용하는 방법과 최상의 결과를 위한 주요 최적화 고려 사항에 대해 논의합니다. 또한, 우리는 실험실 규모의 생물 반응기 실험을위한 조명 제어를 구현하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 향상된 발효 성능을 위해 조작된 미생물에서 광유전학적 제어의 채택을 용이하게 합니다.

서론

광유전학은 광반응 단백질로 생물학적 과정을 제어하며, 화학 및 단백질 생산을 위한 미생물 발효를 동적으로 제어하는 새로운 전략을 제공합니다1,2. 조작된 대사 경로의 부담과 일부 중간체 및 제품의 독성은 종종 세포 성장을 손상시킵니다3. 이러한 스트레스는 바이오매스 축적을 저하시키고 생산성을 저하시킬 수 있습니다3. 이 과제는 발효를 일시적으로 성장 및 생산 단계로 나눠서 해결할 수 있으며, 이는 각각 바이오 매스 축적 또는 제품 합성에 대사 자원을 바칩니다4. 우리는 최근에이 두 단계 발효에서 성장에서 생산으로의 전환이 조명 조건의 변화에 따라 유도 될 수 있음을 보여주었습니다5,6,7. 광 입력의 높은 튜닝성, 가역성 및 직교성8은 기존의 2상 발효의 동적 제어에 사용되는 화학 유도제와 복제하기가 어렵거나 불가능한 광 제어 발효에 고유한 이점을 제공합....

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프로토콜

1. S. cerevisiae OptoINVRT7 회로를 사용한 광 제어 화학 생산

  1. 스트레인 건설
    1. his3 영양위축을 갖는 균주를 얻고, 이 마커는 대부분의 현존하는 OptoINVRT 플라스미드5에 필요하기 때문이다. S. cerevisiae에 자생하는 유전자의 광유전학적 조절을 추구하는 경우, 유전자의 내인성 사본이 결실되는 균주를 구축한다.
    2. EZ-L4395와 같은 OptoINVRT7 회로를 포함하는 플라스미드를 선형화하고, 표준 리튬-아세테이트 변환 방법을 사용하여 영양영양 균주의 his3-유전자좌 내로 통합시킨다15. PGAL1을 빛에서 억누르고 어둠 속에서 활성화시키는 성분들을 포함하고 있는 EZ-L439 플라스미드를 사용하는 경우, PmeI 제한 부위에서 선형화한다.
    3. 형질전환 후, 세포를 1분 동안 150 x g 에서 원심분리하고, 200 μL의 신선한 히스티딘-드롭아웃 합성 완전 배지 (SC-His) 배지에 부드럽게 재현탁시킨다.
    4. 전체....

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결과

미생물 대사의 광유전학적 조절은 바이오 연료, 벌크 화학물질, 단백질 및 천연물을 포함한 다양한 제품을 생산하기 위해 성공적으로 구현되었습니다5,6,7,12,13. 이러한 과정의 대부분은 세포 성장이 빛에서 일어나도록 설계되어 있으며(낮은 세포 밀도가 빛 침투로 최소한의 도전을 야기할 때), 세포가 성장하면 어둠에 의해 유도되는 생산을 위해 설계되었다. 이 접근법을 사용하여 효모로부터 생산 된 다양한 화학 물질, 젖산, 귀중한 고분자 전구체 및 식품 첨가물뿐만 아니라 차세대 바이오 연료 인 아이소 부탄올을 포함합니다. 두 화학 물질 모두에 대해 공통적 인 도전은 관심있는 생성물이 아닌 에탄올 생산으로 포도당을 대사하려는 S. cer.......

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토론

동적 조절은 대사 공학 및 재조합 단백질 생산을 위한 수율을 향상시키기 위해 오랫동안 적용되어 왔다4. 효소 발현의 이동은 가장 일반적으로 IPTG21, 갈락토오스22 및 테트라사이클린23과 같은 화학 유도제를 사용하여 구현되지만 온도 및 pH와 같은 공정 조건을 사용하여 매개되었습니다. 유전자 발현의 광유전학적 조절은 발효 파라미터 또는 배지 조성에 대한 변경의 필요성을 제거하여, 전통적인 유도 전략에 쉽게 적용할 수 있는 대안이 된다. 빛을 켜거나 끌 수있는 용이성은 유전자 복용량의 신속하고 가역적 인 조정과 같은 새로운 기능을 제공합니다. 또한, 이러한 프로토콜은 청색광 반응 시스템에 초점을 맞추는 반면, 기존의 광 반응24을 반전시키거나 다른 파장의 빛25,26,27,28,29

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공개 사항

저자는이 기사에서 설명 된 광유전학 회로 및 방법에 대한 여러 특허를 신청했습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 에너지부, 과학 사무소, 생물 및 환경 연구 사무소 상 번호 DE-SC0019363, NSF CAREER Award CBET-1751840, 퓨 자선 신탁 및 카밀 드레퓌스 교사 - 학자 상이 지원했습니다.

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재료

Light-controlled Chemical ProductionBP97235당
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
S. cerevisiae
USA ScientificCC7672-7524
Agar powderThermo Fisher Scientific303991049
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer with μ 큐벳Eppendorf6135000923
파란색 LED 패널HQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 플라스미드해당 없음참고 문헌 1
참조 GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
오비탈 셰이커야마토 사이언티픽 아메리카SOU-300
페트리 접시Celltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
양자 미터Apogee InstrumentsMQ-510
복제 도금 장치Thomas ScientificF37848-0000
복제 도금 패드Sunrise Science Products3005-012
SC-His 분말Sunrise Science Products1303-030
SC 완전 분말Sunrise Science Products1459-100
멸균 밀봉 필름Excel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD 한천 플레이트VWR100217-054
Thermo Fisher ScientificR25005
>e. coli
6X SDS Sample BufferCepham Life Sciences10502
12% 아크릴아미드 단백질 겔Thermo Fisher ScientificNP0341BOX
24웰 배양 플레이트USA ScientificCC7672-7524
알루미늄 호일ReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer with μ 큐벳Eppendorf6135000923
블루 LED 패널HQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
전기영동 셀Bio-Rad1658004
전기영동 전원 공급 장치Bio-Rad1645050
LB broth (Miller)Fisher Scientific
마이크로 원심분리기Thermo Fisher Scientific75002403
마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC 플라스미드해당 없음참고 문헌 2
참조 Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
페트리 접시Celltreat229656
양자 측정기Apogee InstrumentsMQ-510
SOC 매체Thermo Fisher Scientific15544034
ThermomixerEppendorf5382000015
Tris baseFisher ScientificBP1521
S를 사용한 삼상 발효. cerevisiae
"S. cerevisiae를 이용한 광 제어 화학 물질 생산" 프로토콜과 동일한 재료 및 다음 사항 추가:
EZ-L580 OptoAMP4 플라스미드해당 없음참고 자료 10 참조
: 10광 제어 생물 반응기에서의 화학 생산
알루미늄 호일ReynoldsB004NG90YO
AntifoamSigma-AldrichA8311
Bioreactor with control stationEppendorfB120110001
BioSpectrometer with μ 큐벳Eppendorf6135000923
표백제VWR Scientific89501-620 (CS)
파란색 LED 패널HQRP884667106091218
BPT 튜빙Fisher Scientific14-170-15
포도열 Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
염산(HCl)Fisher Scientific7647-01-0
M9 최소 염Thermo Fisher ScientificA1374401
마이크로 원심분리기Thermo Fisher Scientific75002403
마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5510
NH4OH 솔루션Sigma-AldrichI0503-1VL
오비탈 셰이커Yamato Scientific AmericaSOU-300
양자 미터Apogee InstrumentsMQ-510
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100
24-well 배양 플레이트를 사용한

참고문헌

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengi....

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