레이저 미세 해부를 통해 인간 사후 흑질 관절 조직으로부터 뉴멜라닌 과립을 분리하기 위한 강력한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 이 개정 및 최적화된 프로토콜은 샘플 수집에 필요한 시간을 크게 최소화하고 필요한 샘플 양을 줄이며 LC-MS/MS 분석을 통해 단백질의 식별 및 정량을 향상시킵니다.
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방법 논문
뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜
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이 논문에서
요약
초록
뉴로멜라닌은 흑질의 도파민성 뉴런에 있는 소위 뉴로멜라닌 과립(NMG)에 존재하는 흑갈색 색소입니다. 뉴로멜라닌 외에도 NMG에는 다양한 단백질, 지질 및 금속이 포함되어 있습니다. NMG 함유 도파민 성 뉴런은 파킨슨 병 및 Lewy 시체가있는 치매와 같은 신경 퇴행성 질환에서 우선적으로 손실되지만 NMG 형성 메커니즘과 건강 및 질병에서 NMG의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 NMG의 분자 특성화에 대한 추가 연구가 필수적입니다. 불행하게도, 단백질 분리를 위한 표준 프로토콜은 밀도 구배 초원심분리를 기반으로 하므로 많은 양의 인간 조직이 필요합니다. 따라서 자동 레이저 미세 해부 (LMD) 기반 프로토콜이 여기에 설정되어 편향되지 않고 자동화 된 방식으로 최소량의 조직을 사용하여 NMG 및 주변 흑질 (SN) 조직을 수집 할 수 있습니다. 절제된 샘플은 이후 질량분석법으로 분석하여 단백질체 구성을 해독합니다. 이 워크플로우를 통해 2,079개의 단백질이 확인되었으며 그 중 514개의 단백질이 NMG에서, 181개의 단백질이 SN에서 독점적으로 확인되었습니다. 현재 결과는 두 프로테옴에 대해 87.6%의 중복에 도달하는 유사한 LMD 기반 접근 방식을 사용한 이전 연구와 비교하여 여기에 제시된 수정 및 최적화된 프로토콜의 적용 가능성을 검증했습니다. 현재 결과를 검증하기 위해 관심 단백질을 표적 질량 분석법(예: 병렬 반응 모니터링(PRM) 실험)으로 분석했습니다.
서론
모든 조직은 서로 다른 세포 유형의 이질적인 혼합물로 구성되지만 한 세포 유형의 특정 분리는 종종 보다 정확한 특성 분석을 위해 필수적입니다. 현미경과 레이저 응용 분야를 결합하는 레이저 미세 해부(LMD)는 복잡한 복합재에서 조직 영역, 단일 세포 또는 세포 하부 구조를 특이적으로 분리하기 위한 강력한 도구입니다. 질량분석법(LMD-MS)과 LMD의 조합의 적용은 DNA1, RNA2 및 단백질 3,4,5의 분리를 포함한 여러 연구 질문에 대해 이미 성공적으로 구현되었습니다. 이 프로토콜에서는 파킨슨병의 새로운 병리 메커니즘을 해독하기 위해 인간 사후 뇌 조직 및 세포 하위 구성 요소의 단백질체 분석을 위해 수정되고 최적화된 LMD-MS 프로토콜에 대해 설명합니다.
뉴로멜라닌은 흑질의 카테콜아민성, 도파민 생성 뉴런에서 발견되는 거의 녹지 않는 검은색 색소입니다. 단백질 및 지질과 함께 신경 멜라닌 과립 (NMG)이라고....
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프로토콜
인간의 뇌 조직의 사용은 독일 규정 및 지침에 따라 독일 보훔 루르 대학교 윤리위원회 (파일 번호 4760-13)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 상업적으로 입수된 흑질의 파스콤팩타 조직 절편에 적용되었다. 제시된 프로토콜의 그래픽 개요가 그림 1에 나와 있습니다.
1. 조직 절편
- 저온 유지 챔버를 미리 냉각하십시오.
알림: 모든 조직에는 서로 다른 저온 유지 온도가 필요하며 이는 해당 공급업체 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. - 스테인리스 스틸 나이프를 70% 에탄올로 청소하고 블레이드 홀더에 설치합니다.
- 아이스박스를 사용하여 -80°C 냉동고에서 저온유지장치로 티슈트를 옮기고 15분 동안 저온유지 챔버 온도에 맞게 조정합니다.
- 연필을 사용하여 멤브레인 슬라이드에 명확하게 레이블을 지정합니다.
참고: LMD 기반 시료 수집에는 PET/PEN 멤브레인 슬라이드가 필요합니다. PET/PEN 멤브레인 슬라이드는 매우 깨지기 쉬우므로 주의해서 다루십시오. - 티슈 홀더에 상업용 냉동 섹션 배지 한 방울을 바릅니다. 완전히 얼기 전에 티슈를 얼린 단면 배지....
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결과
NMG와 SN 조직의 특이적 분리는 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 가장 중요한 단계입니다. LMD의 공급업체 제공 소프트웨어에서 시야 분석 기능을 사용하면 NMG를 색상에 따라 자동으로 선택할 수 있습니다. 따라서 NMG가 포함 된 조직 영역 (그림 2A)을 식별하고 조정 된 색상 임계 값으로 시야 분석을 수행해야하므로 NMG (그림 2B)가 표시됩니다. 100μm² 미만의 영역을 덮는 물체를 필터링한 후에는 NMG만 격리를 위해 레이블이 지정된 상태로 유지해야 합니다(그림 2C). 라벨링된 NMG의 정밀한 분리는 레이저 설정을 조정한 후에 달성됩니다(그림 2D). NMG의 분리 (그림 2E) 후, SN 조직은 단백질체 프로파일의 비교를 위해 50 배 배율 (그림 2F) 및 분리 (.......
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토론
LMD는 특정 조직 영역, 단일 세포 또는 세포 내 구조의 분리에 널리 적용 가능한 기술입니다. 여기에 제시된 개정되고 자동화 된 프로토콜에서이 기술은 신경 멜라닌 과립 (NMG) 및 NMG 주변 조직 (SN)의 특정 분리에 적용됩니다. 지금까지 인간 사후 뇌 조직에서 NMG를 분리하기위한 두 가지 접근법이 발표되어 널리 사용되었습니다.
a) 흑질 질 조직 1g을 소비하는 불연속 자당 구배20. 인간 사후 흑질 조직은 드물고 여러 연구 질문에 대한 관심이 높기 때문에 불행히도 환자 당 많은 양의 조직이 필요한 경우 대규모 코호트 연구를 설정하는 것이 매우 어렵습니다. 따라서, 이러한 접근법은 NMGs26의 충분한 단리를 위해 필요한 조직 양을 0.15 g으로 감소시키는 것을 더욱 개선하였다. 그러나 여전히 완전한 실질적 흑질 의 절.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 de에 의해 지원되었습니다. NBI, 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) (보조금 번호 FKZ 031 A 534A) 및 P.U.R.E. (유럽 내 단백질 연구 단위 Ruhr) 및 단백질 진단 센터 (ProDi) 보조금, 둘 다 독일 노르트라인 베스트팔렌의 혁신, 과학 및 연구부.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,4-디티오트레이톨 | AppliChem | A1101 | |
| 아세토니트릴 | Merck | 1.00029.2500 | |
| 암모늄 바이카보네이 | 시그마-알드리치 | A6141 | |
| 포름산 | 시그마-알드리치 | 56302 | |
| 요오드아세트아미드 | AppliChem | A1666,0100 | |
| 마이크로 튜브 500 | 칼 자이스 | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량분석기 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPfadbmbhq | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN 멤브레인 슬라이드 | Carl Zeiss | 415190-9041-000< | |
| em>substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| 트리플루오로아세트산 | Merck | 91707 | |
| 트립신 염기서열분석 등급 | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC 시스템 | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| 소프트웨어 이름 | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view 20.2.0.343 | ||
| XCalibur | 써모 피셔 사이언티픽 | 4.3 |
참고문헌
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and....
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