방법 논문

Aptamer 친화성 비드를 사용한 그람 음성 박테리아의 유류 분리를 위한 미세유체 Acoustophoresis

DOI:

10.3791/63300

⸱

2022년 10월 17일

 ,  ,  , 
1Department of Digital Anti-Aging Health Care, Inje University, 2Micro device Lab Co., Ltd, 3Biohealth Products Research Center (BPRC), Inje University, 4Department of Biomedical Engineering, Inje University

이 논문에서

요약

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이 논문은 배지로부터 그람 음성 박테리아의 빠르고 효율적인 분리를 위해 사용될 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 및 앱타머-개질된 마이크로비드를 사용하는 마이크로유체 acoustophoretic 칩의 제조 및 작동을 설명한다.

초록

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이 글에서는 배지로부터 그람 음성 박테리아를 빠르고 효율적으로 분리하는 데 사용할 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 및 앱타머-개질된 마이크로비드를 이용한 미세유체 acoustophoretic 칩의 제조 및 작동에 대해 설명한다. 이 방법은 긴 사각형 마이크로 채널의 혼합을 사용하여 분리 효율을 향상시킵니다. 이 시스템에서, 샘플과 버퍼는 유동 제어기를 통해 입구 포트로 주입된다. 비드 센터링 및 샘플 분리를 위해 AC 전력은 전력 증폭기가 있는 함수 발생기를 통해 압전 트랜스듀서에 인가되어 마이크로채널에서 음향 방사력을 생성합니다. 입구와 출구 모두에 분기 채널이 있어 분리, 정화 및 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 이 장치는 10x 용량 농도까지 >98 %의 회복률과 97.8 %의 순도를 가지고 있습니다. 이 연구는 박테리아를 분리하는 기존의 방법보다 높은 회수율과 순도를 입증했으며, 이는 장치가 박테리아를 효율적으로 분리 할 수 있음을 시사합니다.

서론

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유전체 전달, 자기 영동, 비드 추출, 필터링, 원심 미세 유체 공학 및 관성 효과, 표면 음향파 1,2에 기반한 방법 외에도 의료 및 환경 샘플에서 박테리아를 분리하기 위해 미세 유체 플랫폼이 개발되고 있습니다. 병원성 박테리아의 검출은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 계속되지만, 일반적으로 힘들고 복잡하며 시간이 많이 걸립니다 3,4. 미세유체 acoustophoresis 시스템은 합리적인 처리량 및 비접촉 세포 분리 5,6,7을 통해 이를 해결하기 위한 대안이다. Acoustophoresis는 음파를 통한 물질 이동 현상을 이용하여 비드를 분리하거나 농축하는 기술입니다. 음파가 마이크로채널에 들어갈 때, 이들은 비드의 크기, 밀도 등에 따라 분류되고, 세포는 현탁액 매질(7,8)의 생화학적 및 전기적 특성에 따라 분리될 수 있다. 이에 따라, 많은 acoustophoretic 연구가 활발히 추진되고 있으며, 최근에는 서표면 음향파 미세유체학에서 경계 구동 음향 스트리밍에 의해 유도되는 음향 영동 운동의 3D 수치 시뮬레이션(12)이 도입되었다.

다양한 분야의 연구는 항체 2,3을 대체하는 방법을 조사하고 있습니다. 압타머는 높은 선택성과 특이성을 갖는 표적 물질이며, 많은 연구가 2,9,10,13 진행되고 있다. Aptamers는 항체에 비해 작은 크기, 우수한 생물학적 안정성, 저렴한 비용 및 높은 재현성의 장점을 가지고 있으며 진단 및 치료 응용분야에서 연구되고 있습니다 2,3,14.

여기서, 본 글에서는 앱타머 변형된 마이크로비드를 사용하는 배지로부터 그람 음성(GN) 박테리아를 신속하고 효율적으로 분리하는데 사용될 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 프로토콜을 설명한다. 이 시스템은 긴 직사각형 마이크로채널 내에서 두 개의 직교 공진을 동시에 자극하여 단일 압전 작동을 통해 2차원(2D) 음향 스탠딩파를 생성하여 노드와 안티노드 포인트에서 압타머 부착 마이크로비드를 정렬하고 집중시켜 분리 효율 2,11,15,16 . 입구와 출구 모두에 분기 채널이 있어 분리, 정화 및 농축을 동시에 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 박테리아 전염병의 조기 진단 분야뿐만 아니라 실시간 물 모니터링을 통해 병원성 박테리아 감염에 대한 신속하고 선택적이며 민감한 반응에 도움이 될 수 있습니다.

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프로토콜

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1. 미세 유체 acoustophoresis 칩 디자인

참고: 도 1 은 acoustophoresis에 의한 마이크로채널로부터 표적 마이크로비드의 분리 및 수집의 개략도를 도시한다. 미세유체 acoustophoresis 칩은 CAD 프로그램으로 설계되었습니다.

  1. 장치의 분리 성능을 연구하기 위해 박테리아의 크기에 해당하는 앱타머 변형 비드와 스트렙타비딘 코팅 폴리스티렌(PS) 비드의 혼합물을 사용하는 미세유체 acoustophoresis 칩을 설계하십시오.
  2. PS 비드를 표적 출구에 모으는 미세유체 acoustophoresis 칩을 설계하고, PS 샘플 혼합물을 샘플 입구에 주입한 후 출구를 통해 나머지를 버린다( 도 2 및 표 1 참조).
    참고: 이러한 목적을 위해 acoustofluidic 칩은 샘플과 버퍼를 주입하기 위한 두 개의 입구, 마이크로비드를 중앙에 정렬할 수 있도록 부착된 압전 트랜스듀서(PZT)가 부착된 주 채널, 시편을 수거하고 폐기물을 배출하는 두 개의 배출구로 구성되어 설계되었습니다(그림 3A).
  3. 마이크로비드, 버퍼, 박테리아 및 앱타머가 주 채널을 통과하는 미세유체 acoustophoresis 칩을 설계하고, 마이크로비드는 PZT에 의해 유도되는 인칩 acoustophoresis를 통해 중앙에 정렬됩니다(그림 3B,C).

2. 미세 유체 acoustophoresis 칩 제조

참고: 그림 3A,B와 같이 붕규산염 유리-실리콘 층, 실리콘 층, 붕규산염 유리 층 및 PZT 층의 순서로 네 개의 층을 조립하십시오.

  1. 폴리에테르에테르케톤(PEEK) 튜브를 연결하기 위한 입구와 출구에서 샌드블라스트(17 )에 의해 직경 2mm 구멍이 있는 붕규산염 유리(최상층)를 준비한다. 붕규산염 유리는 20 × 80 × 0.5 mm 3을 측정합니다.
  2. 딥 반응성 이온 에칭(RIE)을 통해 얻어진 포토레지스트와 실리콘 패턴을 이용하여 형성된 단면적이 0.2 ×0.2 mm2 인 마이크로채널을 갖는 200μm 두께의 실리콘 채널층을 제조하였다18. 반응성 이온 에칭 중에 샘플 및 버퍼 입구 채널과 수집 및 폐기물 배출구 채널을 위해 직경 1mm 구멍을 뚫습니다.
    참고: 여기서 이온 에칭은 RIE 공정을 사용하여 마이크로채널을 형성합니다. 포토레지스트를 실리콘 채널층용 실리콘 웨이퍼 상에 채널 형상으로 도포하였다. PR 코팅된 실리콘 웨이퍼를 불소(18)에 13.56 Mhz를 인가함으로써 생성된 플라즈마로 에칭하였다.
  3. 단계 2.2에서 제조된 실리콘층(20 × 80 × 0.5 mm3)을 상하층으로 하여 칩을 제조하고(20 × 80 × 0.5mm3) 단계 2.1에서 보로실리케이트 유리를 접합하고, 1,000 V 및 400°C에서 양극산화를 이용하여19번째 보로실리케이트 유리층을 제조하였다.
  4. 시아노아크릴레이트 접착제(10 μL 이하)를 사용하여 미세유체 채널을 따라 PZT(20 × 40mm2)를 보로실리케이트 유리층에 부착한다.
    참고: 높이 변화를 최소화하기 위해 면봉을 사용하여 채널에 매우 얇은 층으로 접착제를 바르십시오. 도 3C 는 장치의 사진이다.

3. 박테리아 균주 및 배양

참고: 실험을 위해 GN 및 그람 양성(GP) 박테리아를 선택하고 배양하기 위해 표 2 를 참조하십시오. 배양 방법에 대해서는 단계 3.1-3.4를 참조하십시오. 모든 박테리아는 600nm에서 0.4의 흡광도 (OD600)가 얻어질 때까지 호기성 조건 하에서 배양되어야 한다.

  1. 에스케리치아 콜리 DH5α, 에스케리치아 콜리 KCTC2571, 스핑고모나스 인슐라, 슈도모나스 픽토럼 및 스타필로코커스 표피미디스 및 스타필로코커스 파스타우리와 같은 GP 박테리아와 같은 GN 박테리아의 경우, 루리아-베르타니 배지에서 37°C 및 220 rpm에서 16시간 동안 배양한다.
  2. 엔테로박터(GN) 및 바실러스 메가테리움(GP; KCTC 1021), 37°C 및 220 rpm에서 16시간 동안 영양배지에서 배양한다.
  3. 엔테로코커스 타이란디쿠스(GP)의 경우, 16시간 동안 37°C 및 220 rpm에서 드만, 로고사 및 샤프(MRS) 배지에서 인큐베이션한다.
  4. 리스테리아 그레이이(GP)의 경우, 37°C 및 220 rpm에서 16시간 동안 뇌 심장 주입 배지에서 인큐베이션한다.
  5. 배양된 박테리아를 실온(RT)에서 1분 동안 원심분리(9056 x g)한 다음, 1x 인산완충식염수(PBS) 완충액으로 2회 세척한다.
  6. PBS 버퍼에 재현탁하여 분석을 위해 선택된 GN 및 GP 박테리아를 준비한다.

4. 마이크로비드 및 마이크로비드에 앱타머의 고정화

  1. 사용 전에 스트렙타비딘 코팅된 마이크로비드(10 μm) 혼합물(표 재료)을 재현탁(20초 동안 볼텍싱을 통해 혼합).
  2. 95°C에서 3분 동안 변성시킨 다음 0°C에서 2분 동안 재접어서 앱타머를 제조하였다.
  3. 재현탁된 스트렙타비딘-코팅된 마이크로비드 혼합물 250 μL를 1.5 mL 튜브로 옮기고, RT에서 Tris-HCl 완충액 (50 mM 트리스, pH 7.4, 1 mMMgCl2, 5 mM KCL, 100 mM NaCl)으로 세척하였다. 그런 다음 100 μL의 비오티닐화 DNA 앱타머를 튜브에 첨가한다.
  4. 혼합물을 회전시키면서 30분 동안 RT에서 인큐베이션한다(25 rpm).
  5. 원심분리 후 (9056 x g), RT에서 200 μL의 Tris-HCl 완충액으로 튜브를 두 번 세척한다.
  6. 세척된 샘플 튜브에 10 μL의 BSA (100 mg/mL)를 첨가하고, 회전(25 rpm)으로 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다.
  7. 마지막으로, 앱타머-개질된 마이크로비드를 RT의 Tris-HCl 완충액에서 원심분리(9056 x g)하여 두 번 세척한다.

5. Acoustophoresis 설정 및 작동

  1. PEEK 튜브를 두 개의 입구에 연결하여 두 개의 시료와 버퍼를 주입하고 폐기물을 수거하고 배출하기 위한 두 개의 콘센트를 연결합니다(그림 4).
  2. 미세유체 acoustophoresis 채널을 10 mL 주사기를 사용하여 기포가 없는 탈염수로 수동으로 채운다.
  3. 유체 흐름을 제어하기 위해 둘 이상의 출력 채널이 있는 정밀 압력 컨트롤러를 준비합니다. 그런 다음 바이알을 각각 캡에 두 개의 구멍이있는 샘플과 버퍼로 반쯤 채우고 칩 입구에 연결하십시오.
    주: 두 개 이상의 출력 채널이 있는 정밀 압력 컨트롤러는 여러 정밀 압력 컨트롤러로 교체할 수 있습니다. 버퍼 입구에서, 샘플 주입 동안 샘플이 중앙으로 이동하는 것을 방지하는 층류를 생성할 수 있는 버퍼가 유동 제어기를 통해 주입된다.
  4. 장치를 준비한 후, 정밀 압력 제어 장치를 사용하여 버퍼 입구에 2 kPa 및 버퍼 입구에 4 kPa의 압력을 가하여 샘플 및 버퍼를 주입합니다.
    참고 : 이 때, 원활한 층류를 위해, 버퍼의 사출 압력은 샘플의 사출 압력보다 높아야합니다. 흐름은 유입 채널에 연결된 흡인기에 고정된 흐름 제어기에 의해 제어됩니다.
  5. 비드에 초점을 맞추어 현미경을 통해 확인하면서 PZT를 사용하여 미세유체 채널의 중심으로 이동시킨다.
    참고: 비드가 클수록 파형에 미치는 영향이 커지므로 노드 점과 정렬하는 것이 더 쉽습니다. 증폭기가 있는 함수 생성기는 PZT에 전력을 인가하여 마이크로채널에서 사인파를 생성합니다. 마이크로채널의 상부 및 하부 부분이 유리로 제조되기 때문에, 생성된 사인파는 반사되어 노드 포인트(7)를 생성한다.
  6. 단일 채널 함수 발생기를 사용하여 3.66MHz의 공진 주파수를 생성하고 전력 증폭기를 사용하여 일반 신호를 16dB(약 9배)만큼 증폭합니다(그림 4).
    참고: 액추에이터의 공진 주파수는 채널 크기와 일치해야 합니다. 채널이 정사각형이기 때문에 PZT는 정확한 주파수에서 작동하여 단일 노드를 생성합니다.
  7. 형광 현미경과 1,200fps로 작동하는 고속 카메라로 acoustofluidic 칩의 분리 및 농축 과정을 관찰하십시오.
  8. 수집 및 폐기물 배출구 샘플을 통해 배출되는 박테리아 결합 비드 및 박테리아의 형광 현미경 카메라로 촬영한 이미지를 확인하여 GN 박테리아 및 GP 박테리아의 유무를 정량화 및 분석한다.
    참고: 버퍼, 박테리아 및 앱타머가 있는 마이크로비드는 주 채널을 통과하며, 마이크로비드는 PZT에 의해 유도되는 인칩 acoustophoresis를 통해 중앙에 정렬됩니다. 마지막으로, GN 박테리아와 결합 된 마이크로 비드는 수집 출구에서 수집되고 수집되지 않은 박테리아는 폐기물 배출구를 통해 배출됩니다.

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결과

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도 5는 PZT 전압(OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V)의 함수로서 비드 유동의 이미지를 도시한다. 본 연구에 도입된 acoustophoretic 칩의 경우, PZT의 전압이 증가함에 따라, 10 μm 크기의 비드의 중심 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 10 μm 크기의 비드의 대부분은 PZT 전압의 5 V에서 중앙에 농축되었다. 이 결과를 통해 단일 채널 함수 발생기에서 3.66MHz의 공진 주파수가 생성되었고, 전력 증폭기를 사용하여 일반 신호가 16dB(약 9배)만큼 증폭되었습니다.

표 3 은 본 연구에 사용된 음향 유체 칩에 1 μm(세포 크기)와 10 μm(압타머 부착 비드)의 마이크로비드 혼합물을 주입한 결과를 나타낸 것으로, 유출 유량(400, 450 및 475 μL/min)에 따른 칩 분리 성능을 평가한 결과이다. 회수율은 10 μm 크기의 비드에 대한 주입된 비드의 총 수...

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토론

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배양 시료로부터 GN 박테리아를 포획하여 그 크기와 종류에 따른 연속 실행 방법 및 앱타머 변형 마이크로비드를 기반으로 고속으로 포획하고 이송하기 위한 음파 부양 미세유체 장치를 개발하였다. 긴 정사각형 마이크로채널은 이전에 보고된 20,21,22,23,24,25,26보다 더 간단한 설계와 2D acoustophoresis에 대한 더 큰 비용 효율성을 가능하게 합니다. 이 장치는 10x 용량 농도까지 >98 %의 회복률을 보입니다. 본 연구는 박테리아를 분리하기 위한 기존의 라벨 프리 방법 20,21,22,23,24 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 사업은 한국연구재단(NRF) 한국 정부(과학기술정보통신부)가 후원하는 보조금의 지원을 받았다. (아니요. NRF-2021R1A2C1011380)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 &마이크로; m 폴리스티렌 마이크로비즈Bang LaboratoriesPS04001셀 크기 비즈
10 &마이크로; m Streptavidin-coated microbeadsBang LaboratoriesCP01007Aptamer 친화성 비드
4인치 실리콘 웨이퍼/SU-8 금형4science29-03573-01칩의 구성 요소
AptamerIntegrated DNA TechnologiesGN3-6'RNAfor bacteria conjugation
붕규산 유리SchottBOROFLOAT 33
원심분리기DaihanCF-10Wasing 입자
Cyanoacrylate 접착제3MAD100PZT를 마이크로 칩
대장균 DH5 및 알파KCTCKCTC2571표적 세균
기능성 발전기GW InstekAFG-2225생성 주파수
고속 카메라PhotronFASTCAM Mini분리 관찰
핫 플레이트As oneHI-1000액체 경화용 가열판 PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL 주사기Koreavaccine22G-10ML미세유체 음향 영동 채널을 기포가 없는 탈염수로 채웁니다.
액상 폴리디메틸실록산, PDMS다우코닝 Inc.Sylgard 184칩의 구성 요소
LB Broth MillerBD Difco244620세포 배양 (Luria-Bertani 매체)
현미경Olympus Corp.IX-81분리
관찰 PBS 완충액염소자리 과학PBS-1AWasing 박테리아
PEEK 튜브Saint-Gobain Ppl Corp.AAD04103입자 주입 또는 수집
압전 변환기Fuji CeramicsC-213채널에서 특정 파동 생성
전력 증폭기증폭기 연구75A250A증폭
주파수 압력 컨트롤러/μ 플루콘AMEDAMED-μ flucon공기압/유량 제어 컨트롤러
Tris-HCl bufferinvitrogen15567027Wasing 입자
튜브 로테이터SeouLin BioscienceSLRM-3수정 압타머 및 비드
칩 의 구성 요소에 부착하십시오.

참고문헌

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