튜불린 중합체인 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격 구성 요소로서 중요한 역할을 하며 동적 불안정성으로 알려져 있습니다. 본 연구는 다양한 마우스 조직에서 미세소관의 안정성을 평가하기 위해 미세소관을 분류하여 안정 미세소관, 불안정한 미세소관, 유리 튜불린으로 분리하는 방법을 개발하였다.
방법 논문
튜불린 중합체인 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격 구성 요소로서 중요한 역할을 하며 동적 불안정성으로 알려져 있습니다. 본 연구는 다양한 마우스 조직에서 미세소관의 안정성을 평가하기 위해 미세소관을 분류하여 안정 미세소관, 불안정한 미세소관, 유리 튜불린으로 분리하는 방법을 개발하였다.
α/β-튜불린 이량체로 구성된 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 튜브형 중합체는 튜불린 헤테로다이머 소단위체가 반복적인 중합 및 해중합을 겪을 때 동적 불안정성을 나타냅니다. 튜불린 번역 후 변형(post-translational modification) 및 미세소관 관련 단백질을 통해 달성되는 미세소관 안정성 및 역학의 정밀한 제어는 다양한 세포 기능에 필수적입니다. 미세소관의 기능 장애는 신경 퇴행성 질환을 포함한 발병기전과 밀접한 관련이 있습니다. 진행 중인 연구는 안정성을 조절하는 미세소관 표적 치료제에 중점을 두고 있으며, 이러한 질병 및 암에 대한 잠재적인 치료 옵션을 제공합니다. 따라서 미세소관의 동적 상태를 이해하는 것은 질병 진행 및 치료 효과를 평가하는 데 매우 중요합니다.
전통적으로 미세소관 역학은 튜불린의 번역 후 변형을 표적으로 하는 항체를 사용하여 거친 분획 또는 면역분석을 통해 시험관 내 또는 배양된 세포에서 평가되었습니다. 그러나 이러한 절차를 사용하여 조직의 튜불린 상태를 정확하게 분석하는 것은 어려운 일입니다. 이 연구에서는 마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하는 간단하고 혁신적인 미세소관 분획 방법을 개발했습니다.
이 절차에는 19:1 부피 비율로 미세소관 안정화 완충액에서 절개된 마우스 조직을 균질화하는 작업이 포함되었습니다. 그런 다음 균질액을 초기 느린 원심분리(2,400× g)에 이어 2단계 초원심분리 공정을 통해 분획하여 파편을 제거했습니다. 제1 초원심분리 단계(100,000 × g)는 안정한 미세소관을 침전시킨 반면, 생성된 상층액은 불안정한 미세소관 및 용해성 튜불린 이량체를 분획하기 위해 제2 초원심분리 단계(500,000 × g)를 거쳤다. 이 방법은 쥐의 뇌에서 안정적이거나 불안정한 미세소관을 구성하는 튜불린의 비율을 측정했습니다. 또한, 구성 세포의 증식 능력과 상관 관계가 있는 미세소관 안정성의 뚜렷한 조직 변이가 관찰되었습니다. 이러한 발견은 생리학적 및 병리학적 조건에서 미세소관 안정성을 분석하기 위한 이 새로운 방법의 상당한 잠재력을 강조합니다.
미세소관(MT)은 α/β-튜불린 헤테로다이머 소단위로 구성된 프로토필라멘트로 구성된 길쭉한 관형 구조입니다. 이들은 세포 분열, 운동성, 형태 유지, 세포 내 수송과 같은 다양한 세포 과정에서 필수적인 역할을 하며, 진핵생물 세포골격의 필수 구성 요소가 된다1. α-튜불린 소단위체가 노출되는 MT의 마이너스 엔드는 비교적 안정적인 반면, β-튜불린 서브유닛이 노출되는 플러스 엔드는 동적 해중합 및 중합을 거친다2. 동적 불안정성(dynamic instability)이라고 하는 플러스 말단(plus-end)에서의 튜불린 이량체 첨가 및 해리의 연속적인 순환은 구조와 재앙의 반복적인 과정을 초래한다3. MT는 안정적 영역과 불안정한 영역을 포함하여 동적 불안정성의 국소적 변형이 있는 초점 영역을 나타낸다4.
MT의 동적 불안정성을 정밀하게 제어하는 것은 특히 복잡한 형태를 특징으로 하는 뉴런에서 수많은 세포 기능에 매우 중요합니다. MT의 적응성과 내구성은 신경 세포의 발달과 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다 5,6,7
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1. MT 분획법
참고: 본 연구에서 수행된 모든 실험은 도시샤 대학 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6J 생후 3-4개월 된 남녀 마우스를 여기에 사용하였다. 이 프로토콜에서 절개된 조직(예: 뇌, 간 또는 흉선)은 해중합뿐만 아니라 MT의 재중합을 방지하는 농도로 탁솔(MT 안정제)을 함유한 얼음처럼 차가운 미세소관 안정화 완충액(MSB)에서 즉시 균질화되었습니다. 균질액은 2단계 초원심분리 공정에 의해 3개의 분획으로 분리되었습니다(그림 1). 이 프로토콜의 모든 단계는 저온 환경에서 중단 없이 완료되었으며, 조직 및 분획은 소듐 도데실 설페이트(SDS)-샘플 완충액에 용해될 때까지 동결되지 않았습니다.
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MT 분획 방법에 의한 마우스 뇌의 P2, P3 및 S3 분획에서 튜불린의 정량화
마우스 조직의 튜불린을 MT 분획법에 의해 P2, P3 및 S3 분획으로 분리하고 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 정량화했습니다(그림 1A). 20분 동안 100,000× g 에서 초원심분리에 의해 P2 분획에 남아 있는 MT의 침전물은 마우스 뇌에서 총 튜불린의 34.86% ± 1.68%를 차지했습니다. 상층액(S2)을 60분 동안 500,000× g 에서 추가로 원심분리하였다. 침전물(P3 분획)과 상층액(S3 분획)을 얻었는데, 이는 각각 마우스 뇌에서 총 튜불린의 56.13% ± 2.12% 또는 9.01% ± 0.68%를 차지했습니다(그림 1B).
이 연구에 사용된 대뇌 피질에는 신경교세포와 같은 신경.......
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살아있는 유기체의 조직 내 튜불린 상태를 조사할 때 가장 중요한 작업은 준비 중 우발적인 MT 중합 또는 해중합을 방지하는 것입니다. 샘플에서 MT의 안정성은 MSB의 탁솔 농도, 완충액에 대한 조직 양의 비율, 조직 제거에서 균질화 및 원심분리에 이르는 과정 중 온도와 같은 요인의 영향을 받습니다. 따라서, 조건은 20배 부피의 균질액으로 마우스 조직을 분석하기 위한 프로토콜의 각 단계에서 최적화되었습니다. 탁솔의 농도가 높을수록 생체외에서 MT 중합을 유도할 수 있습니다25. 튜불린 농도가 현저히 다른 조직을 분석하거나 프로토콜을 크게 수정할 때 각 작업자는 실험의 특정 목표에 따라 단계를 최적화해야 합니다.
수행된 연구에서, P3라고 하는 새로운 MT 집단은 500,000 ×g20에서 초원심분리를 사용하여 종래의 "용해성 분획"으로부터 얻어졌다. 로터의 K .......
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저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.
이 작업은 JST의 과학기술 혁신 창출을 위한 대학 펠로우십 설립(A.HT; JPMJFS2145), JST 스프링(A.HT.; JPMJSP2129), JSPS 펠로우를 위한 보조금(A.HT.; 23KJ2078), 과학 연구 보조금(B) JSPS KAKENHI(TM의 경우 22H02946), 문부과학성(TM; 26117004)의 "뇌 단백질 노화 및 치매 제어"라는 제목의 혁신적인 분야에 대한 과학 연구 보조금 및 우에하라 기념 재단(TM; 202020027)의 우에하라 연구 펠로우십. 저자는 재정적 이익이 상충되지 않는다고 선언합니다.
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