질량 분광법에 앞서 강력한 프로테옴 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전

요약

본 프로토콜은 질량 분광법 전에 프로테옴 샘플의 견고하고 신속한 회수 및 정제를 위한 조절된 조건 하에서의 용매-기반 단백질 침전을 기술한다.

초록

질량 분광법(MS) 장비의 여러 발전으로 정성 및 정량적 프로테옴 분석이 개선되었지만, MS보다 앞서 단백질을 분리, 농축 및 처리하기 위한 보다 신뢰할 수 있는 프런트 엔드 접근법은 성공적인 프로테옴 특성화를 위해 매우 중요합니다. 낮고 일관성 없는 단백질 회수 및 계면활성제와 같은 잔류 불순물은 MS 분석에 해롭다. 단백질 침전은 종종 다른 샘플 준비 전략에 비해 신뢰할 수 없고, 시간이 많이 걸리며, 기술적으로 수행하기가 어려운 것으로 간주됩니다. 이러한 우려는 최적의 단백질 침전 프로토콜을 사용하여 극복됩니다. 아세톤 침전의 경우 특정 염, 온도 조절, 용매 조성 및 침전 시간의 조합이 중요하지만 클로로포름 / 메탄올 / 물 침전의 효율은 적절한 피펫팅 및 바이알 조작에 달려 있습니다. 대안적으로, 이들 침전 프로토콜은 일회용 스핀 카트리지 내에서 간소화되고 반자동화된다. 용매 기반 단백질 침전의 예상된 결과를 통상적인 포맷으로 그리고 일회용, 이단계 여과 및 추출 카트리지를 사용하여 본 작업에 예시한다. 여기에는 상향식 LC-MS/MS 분석에 의한 프로테오믹 혼합물의 상세한 특성화가 포함됩니다. SDS 기반 워크플로우의 우수한 성능은 오염되지 않은 단백질에 비해 입증되었습니다.

서론

질량 분광법에 의한 프로테옴 분석은 현대 MS 기기의 향상된 감도, 해상도, 스캔 속도 및 다양성으로 인해 점점 더 엄격 해지고 있습니다. MS의 발전은 단백질 식별 효율을 높이고 1,2,3,4,5를 더 정밀하게 정량하는 데 기여합니다. 향상된 MS 계측을 통해 연구자들은 워크플로우 6,7,8,9,10,11의 모든 단계에서 최소한의 시간 내에 고순도 단백질을 정량적으로 회수할 수 있는 상응하는 일관된 프런트 엔드 샘플 준비 전략을 요구합니다. . 생물학적 시스템의 프로테옴 상태를 정확하게 반영하기 위해, 단백질은 효율적이고 편향되지 않은 방식으로 천....

프로토콜

1. 재료 고려 사항 및 샘플 사전 준비

1. 과도한 수분이없는 고순도 용매 (아세톤, 클로로포름, 메탄올) (>99.5 %)와 화학 물질 만 사용하십시오.
2. 물에 염화나트륨과 황산아연 용액 (1 M)을 준비하십시오.
   참고: 소금 용액은 오염물질이나 미생물 성장이 없는 한 실온에서 무기한으로 보관할 수 있습니다.
3. 침전을 유도하기 위해 필요한 부피의 샘플 및 용매를 보유하기에 충분한 가장 작은 폴리프로필렌(PP) 마이크로원심분리 바이알을 사용하십시오.
4. 침전될 샘플의 SDS 농도가 2%(w/v)를 넘지 않는지 확인하십시오. SDS가 더 높으면 샘플을 물로 희석하십시오.
5. 최적의 침전 효율을 위해 단백질 농도를 0.01 ~ 10 g/L 사이로 유지하십시오.
   참고: 침전에 대한 최적의 질량은 단백질의 1-100 μg 사이입니다.
6. 사용하기 전에 모든 용매와 용액에 미립자 물질이 없는지 확인하십시오. 여과 (<0.5 μm) 또는 원심분리 단계 (실온에서 1 분 동안 10,000 x g )를 수행하여 용해되지 않은 미립자를 제거하십시오.
7. 디술피드 결합 환원 및 알킬화가 필요한 경우, 단백질 침전 전에 이러한 단계를 수행하십시오. 과량....

결과

도 4 는 아세톤을 사용하는 일회용 필터 카트리지에서 바이알 기반 또는 카트리지-촉진된 단백질 침전에 따른 예상되는 SDS 고갈을 요약한 것이다. 아세톤에서의 종래의 밤새 인큐베이션(-20°C)은 CMW 침전뿐만 아니라 실온에서 신속한 아세톤 침전 프로토콜(단계 2)과 비교된다(단계 4). 잔류 SDS는 메틸렌 블루 활성 물질(MBAS) 분석²⁹에 의해 정량화되었다. 간략하게, 100 μL 샘플을 100 μL MBAS 시약 (메틸렌 블루 250 mg, 황산나트륨 50 g, 황산 10 mL, 물에 희석 1.0 L)과 합한 다음, 400 μL 클로로포름을 첨가하고 UV/Vis 분광광도계 상에서 651 nm에서 유기층의 흡광도를 측정하였다. 모든 접근법은 SDS를 줄여 최적의 MS 분석을 가능하게 합니다.

정량적 및 재현성 단백질 회수는 처리된 효모 총 세포 용해물의 SDS PAGE 분석을.......

토론

최적의 MS 특성화는 잔류 SDS가 10ppm 미만으로 고갈될 때 달성된다. FASP 및 온비드 소화와 같은 대안적인 접근법은 가변 회수^31,32,33으로 정량적 SDS 고갈을 제공하지만^, 침전의 주요 목적은 순도와 수율을 동시에 극대화하는 것입니다. 이는 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상청액(SDS 함유)을 효과적으로 단리하는 것에 의존한다. 바이알 기반 침전의 경우, 일단 상청액의 대부분이 피펫팅에 의해 제거되면, 응집 된 펠릿 중 일부가 실수로 손실 될 가능성이 점점 커지고 있습니다. 이러한 이유로, 잔류 용매(∼20 μL)의 보다 중요한 분획을 뒤에 남겨두고 세척 단계(³⁴)를 추가하는 것이 필수적이다. 세척 단계는 바이알로부터 잔류 용매를 희석하고 제거한다. 특히 CMW의 경우, 펠릿이 형성되면 샘플 바이알을 와류.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세톤	피셔 사이언티브	AC177170010	≤ 0.002% 알데히드
아세토니트릴	피셔 사이언티브	A998-4	HPLC 등급
중탄산암모늄	밀리포어 시그마	A6141-1KG	고단하다
베타 머캅토에탄올	밀리포어 시그마	M3148-25ML	분자생물학 등급
브로모페놀 블루	밀리포어 시그마	B8026-5G	브로모페놀 블루 나트륨 소금
클로로포름	피셔 사이언티브	C298-400	클로로포름
개미산	허니웰	56302	LC-MS용 용출물 첨가제
융합 루모스 질량분석기	서모피셔 사이언티픽		표준 단백질 혼합물 분석을 위해
글리세롤	밀리포어 시그마	356352-1L-M	분자생물학의 경우, > 99%
이소프로판올	피셔 사이언티브	A4641	HPLC 등급
메탄올	피셔 사이언티브	A452SK-4	HPLC 등급
마이크로 원심분리기	피셔 사이언티브	75-400-102	최대 21,000 xg
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)	피셔 사이언티브	05-408-130	테이퍼드 바텀
마이크로 원심분리기 튜브   그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (2 mL)	피셔 사이언티브	02-681-321	둥근 바닥
마이크로피펫 팁  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (0.1-10 & mu; L)	피셔 사이언티브	21-197-28	범용 피펫 팁, 비멸균
마이크로피펫 팁  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (1-200 & mu; L)	피셔 사이언티브	07-200-302	범용 피펫 팁, 비멸균
마이크로피펫 팁  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (200-1000 & mu; L)	피셔 사이언티브	07-200-303	범용 피펫 팁, 비멸균
마이크로피펫	피셔 사이언티브	13-710-903	마이크로피펫 트리오 팩
펩신	밀리포어 시그마	P0525000	용하 분말, 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; >3200 단위/mg
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트리스	피셔 사이언티브	BP152-500	분자생물학 등급
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요소	바이오-래드	1610731	고단하다
물(탈이온)	사토리우스 아리움 미니 정수 시스템	76307-662	타입 1 울트라퓨어 (18.2 MΩ cm)
아연 설페이트	밀리포어 시그마	307491-100G	고단하다