방법 논문

질량 분광법에 앞서 강력한 프로테옴 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전

DOI:

10.3791/63503

⸱

2022년 2월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 질량 분광법 전에 프로테옴 샘플의 견고하고 신속한 회수 및 정제를 위한 조절된 조건 하에서의 용매-기반 단백질 침전을 기술한다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질량 분광법(MS) 장비의 여러 발전으로 정성 및 정량적 프로테옴 분석이 개선되었지만, MS보다 앞서 단백질을 분리, 농축 및 처리하기 위한 보다 신뢰할 수 있는 프런트 엔드 접근법은 성공적인 프로테옴 특성화를 위해 매우 중요합니다. 낮고 일관성 없는 단백질 회수 및 계면활성제와 같은 잔류 불순물은 MS 분석에 해롭다. 단백질 침전은 종종 다른 샘플 준비 전략에 비해 신뢰할 수 없고, 시간이 많이 걸리며, 기술적으로 수행하기가 어려운 것으로 간주됩니다. 이러한 우려는 최적의 단백질 침전 프로토콜을 사용하여 극복됩니다. 아세톤 침전의 경우 특정 염, 온도 조절, 용매 조성 및 침전 시간의 조합이 중요하지만 클로로포름 / 메탄올 / 물 침전의 효율은 적절한 피펫팅 및 바이알 조작에 달려 있습니다. 대안적으로, 이들 침전 프로토콜은 일회용 스핀 카트리지 내에서 간소화되고 반자동화된다. 용매 기반 단백질 침전의 예상된 결과를 통상적인 포맷으로 그리고 일회용, 이단계 여과 및 추출 카트리지를 사용하여 본 작업에 예시한다. 여기에는 상향식 LC-MS/MS 분석에 의한 프로테오믹 혼합물의 상세한 특성화가 포함됩니다. SDS 기반 워크플로우의 우수한 성능은 오염되지 않은 단백질에 비해 입증되었습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질량 분광법에 의한 프로테옴 분석은 현대 MS 기기의 향상된 감도, 해상도, 스캔 속도 및 다양성으로 인해 점점 더 엄격 해지고 있습니다. MS의 발전은 단백질 식별 효율을 높이고 1,2,3,4,5를 더 정밀하게 정량하는 데 기여합니다. 향상된 MS 계측을 통해 연구자들은 워크플로우 6,7,8,9,10,11의 모든 단계에서 최소한의 시간 내에 고순도 단백질을 정량적으로 회수할 수 있는 상응하는 일관된 프런트 엔드 샘플 준비 전략을 요구합니다. . 생물학적 시스템의 프로테옴 상태를 정확하게 반영하기 위해, 단백질은 효율적이고 편향되지 않은 방식으로 천....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 재료 고려 사항 및 샘플 사전 준비

  1. 과도한 수분이없는 고순도 용매 (아세톤, 클로로포름, 메탄올) (>99.5 %)와 화학 물질 만 사용하십시오.
  2. 물에 염화나트륨과 황산아연 용액 (1 M)을 준비하십시오.
    참고: 소금 용액은 오염물질이나 미생물 성장이 없는 한 실온에서 무기한으로 보관할 수 있습니다.
  3. 침전을 유도하기 위해 필요한 부피의 샘플 및 용매를 보유하기에 충분한 가장 작은 폴리프로필렌(PP) 마이크로원심분리 바이알을 사용하십시오.
  4. 침전될 샘플의 SDS 농도가 2%(w/v)를 넘지 않는지 확인하십시오. SDS가 더 높으면 샘플을 물로 희석하십시오.
  5. 최적의 침전 효율을 위해 단백질 농도를 0.01 ~ 10 g/L 사이로 유지하십시오.
    참고: 침전에 대한 최적의 질량은 단백질의 1-100 μg 사이입니다.
  6. 사용하기 전에 모든 용매와 용액에 미립자 물질이 없는지 확인하십시오. 여과 (<0.5 μm) 또는 원심분리 단계 (실온에서 1 분 동안 10,000 x g )를 수행하여 용해되지 않은 미립자를 제거하십시오.
  7. 디술피드 결합 환원 및 알킬화가 필요한 경우, 단백질 침전 전에 이러한 단계를 수행하십시오. 과량....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도 4 는 아세톤을 사용하는 일회용 필터 카트리지에서 바이알 기반 또는 카트리지-촉진된 단백질 침전에 따른 예상되는 SDS 고갈을 요약한 것이다. 아세톤에서의 종래의 밤새 인큐베이션(-20°C)은 CMW 침전뿐만 아니라 실온에서 신속한 아세톤 침전 프로토콜(단계 2)과 비교된다(단계 4). 잔류 SDS는 메틸렌 블루 활성 물질(MBAS) 분석29에 의해 정량화되었다. 간략하게, 100 μL 샘플을 100 μL MBAS 시약 (메틸렌 블루 250 mg, 황산나트륨 50 g, 황산 10 mL, 물에 희석 1.0 L)과 합한 다음, 400 μL 클로로포름을 첨가하고 UV/Vis 분광광도계 상에서 651 nm에서 유기층의 흡광도를 측정하였다. 모든 접근법은 SDS를 줄여 최적의 MS 분석을 가능하게 합니다.

정량적 및 재현성 단백질 회수는 처리된 효모 총 세포 용해물의 SDS PAGE 분석을.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최적의 MS 특성화는 잔류 SDS가 10ppm 미만으로 고갈될 때 달성된다. FASP 및 온비드 소화와 같은 대안적인 접근법은 가변 회수31,32,33으로 정량적 SDS 고갈을 제공하지만, 침전의 주요 목적은 순도와 수율을 동시에 극대화하는 것입니다. 이는 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상청액(SDS 함유)을 효과적으로 단리하는 것에 의존한다. 바이알 기반 침전의 경우, 일단 상청액의 대부분이 피펫팅에 의해 제거되면, 응집 된 펠릿 중 일부가 실수로 손실 될 가능성이 점점 커지고 있습니다. 이러한 이유로, 잔류 용매(∼20 μL)의 보다 중요한 분획을 뒤에 남겨두고 세척 단계(34)를 추가하는 것이 필수적이다. 세척 단계는 바이알로부터 잔류 용매를 희석하고 제거한다. 특히 CMW의 경우, 펠릿이 형성되면 샘플 바이알을 와류.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doucette 실험실은이 연구에 사용 된 ProTrap XG를 구상하고 특허를 취득했습니다. AAD는 또한 샘플 준비 카트리지를 상용화한 Proteoform Scientific의 창립 파트너이기도 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)가 자금을 지원했습니다. 저자들은 MS 데이터 수집에 기여한 Bioinformatics Solutions Inc. (캐나다 워털루)와 SPARC BioCentre (Molecular Analysis)에게 아픈 어린이 병원 (캐나다 토론토)에 감사드립니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세톤피셔 사이언티브AC177170010≤ 0.002% 알데히드
아세토니트릴피셔 사이언티브A998-4HPLC 등급
중탄산암모늄밀리포어 시그마A6141-1KG고단하다
베타 머캅토에탄올밀리포어 시그마M3148-25ML분자생물학 등급
브로모페놀 블루밀리포어 시그마B8026-5G브로모페놀 블루 나트륨 소금
클로로포름피셔 사이언티브C298-400클로로포름
개미산허니웰56302LC-MS용 용출물 첨가제
융합 루모스 질량분석기서모피셔 사이언티픽표준 단백질 혼합물 분석을 위해
글리세롤밀리포어 시그마356352-1L-M분자생물학의 경우, > 99%
이소프로판올피셔 사이언티브A4641HPLC 등급
메탄올피셔 사이언티브A452SK-4HPLC 등급
마이크로 원심분리기피셔 사이언티브75-400-102최대 21,000 xg
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)피셔 사이언티브05-408-130테이퍼드 바텀
마이크로 원심분리기 튜브   그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (2 mL)피셔 사이언티브02-681-321둥근 바닥
마이크로피펫 팁  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (0.1-10 & mu; L)피셔 사이언티브21-197-28범용 피펫 팁, 비멸균
마이크로피펫 팁  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (1-200 & mu; L)피셔 사이언티브07-200-302범용 피펫 팁, 비멸균
마이크로피펫 팁  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; (200-1000 & mu; L)피셔 사이언티브07-200-303범용 피펫 팁, 비멸균
마이크로피펫피셔 사이언티브13-710-903마이크로피펫 트리오 팩
펩신밀리포어 시그마P0525000용하 분말, 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; >3200 단위/mg
프로트랩 XG프로테오폼 사이언티픽PXG-0002박스당 50개의 완성된 유닛
염화나트륨밀리포어 시그마S9888-1KGACS 시약, >99%
도데실 설페이트 나트륨서모피셔 사이언티픽28312분말 고체
timsTOF 프로 질량분석기브루커간 단백질체 추출물 분석을 위해
트리플루오로아세트산서모피셔 사이언티픽L06374. AP99%
트리스피셔 사이언티브BP152-500분자생물학 등급
트립신밀리포어 시그마9002-07-7소 췌장에서 TPCK 처리를 거쳤습니다
요소바이오-래드1610731고단하다
물(탈이온)사토리우스 아리움 미니 정수 시스템76307-662타입 1 울트라퓨어 (18.2 MΩ cm)
아연 설페이트밀리포어 시그마307491-100G고단하다

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

SDS

관련 논문