간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

Summary

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

Abstract

포유동물 세포의 편평한 배양은 세포 생리학을 이해하기 위해 시험관내 접근법으로 널리 사용되지만, 이 시스템은 부자연스럽게 빠른 세포 복제로 인해 고체 조직을 모델링하는데 한계가 있다. 이것은 성숙한 크로마틴을 모델링 할 때 특히 도전적인데, 빠른 복제 세포는 종종 DNA 복제에 관여하고 이질적인 폴리 플로이드 집단을 가지고 있기 때문입니다. 아래는 3차원(3D) 세포 배양 시스템을 사용하여 정동작 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하기 위한 워크플로우입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 간세포 암종 세포주는 활성 영양소 확산 및 낮은 전단력을 제공하는 인큐베이터에서 재현 가능한 3D 구상체로 성장한다. 소듐 부티레이트와 소듐 숙시네이트에 의한 처리는 각각 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 증가를 유도하였다. 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화 수준의 증가는 보다 개방된 크로마틴 상태와 연관된다. 그런 다음 구상체는 세포 핵의 분리를 위해 수집되며, 히스톤 단백질은 번역 후 변형의 분석을 위해 추출됩니다. Histone 분석은 탠덤 질량 분광법과 온라인으로 결합 된 액체 크로마토그래피를 통해 수행되고 사내 계산 파이프 라인이 뒤 따릅니다. 마지막으로, 조합 히스톤 마크의 빈도 및 발생을 조사하기 위한 데이터 표현의 예가 도시된다.

Introduction

19^{세기 후반}부터 세포 배양^{시스템은 인체 1,2} 외부의 세포의 성장과 발달을 연구하기 위한 모델로 사용되어 왔다. 그들의 사용은 또한 조직과 기관이 건강한 상황과 병든 맥락에서 어떻게 기능하는지 연구하기 위해 확장되었습니다 ^1,3. 현탁액 세포 (예를 들어, 혈액 세포)는 페트리 접시 또는 플라스크에서 매끄럽고 상호 교환 가능하게 성장하며, 생체 내에서 3차원 (3D) 구조로 조립되지 않는다. 고체 기관으로부터 유래된 세포는 2차원(2D) 또는 3D 배양 시스템에서 성장할 수 있다. 2D 배양에서, 세포는 평평한 표면 ^2,4에 부착되는 단층에서 성장한다. 2D 세포 배양 시스템은 지수 성장 및 빠른 배가 시간, 전형적으로 24 h 내지 수일⁵를 특징으로 한다. 3D 시스템의 세포는 성장하여 조직과 유사한 대기업을 모델링하는 복잡한 세포 - 세포 상호 작용을 형성하며, 배가시키는 시간이 1 개월 또는 그 이상에 도달 할 수있는 동적 평형에 도달 할 수있는 능력을 특징으로합니다⁵.

이 논문에서 제시된 것은 감소된 중력을 시뮬레이션하는 회전 세포 배양 시스템에서 3D 구상체를 성장시키기 위한 혁신적인 방법론^이다6. 이것은 NASA가 1990 년대⁷에 도입 한 세포 배양 시스템의 단순화 된 유도체입니다. 이 접근법은 회전 플라스크와 같은 기존 방법에서 발생하는 전단력을 최소화하고 스페로이드 재현성을 증가^{시킵니다6.} 또한, 회전 생물반응기는 활성 영양소 확산을 증가시켜 배지 교환이 비실용적 인 매달린 방울 세포 배양과 같은 시스템에서 발생하는 괴사 형성을 최소화합니다⁶. 이런 식으로, 세포는 대부분 방해받지 않고 성장하여 조직에서 성장하는 세포와 관련된 구조적 및 생리적 특성의 형성을 허용합니다. 이러한 방식으로 배양된 C3A 간세포(HepG2/C3A)는 초구조적 소기관을 가졌을 뿐만 아니라 생체내^1,2에서 관찰된 수준에 필적하는 양의 ATP, 아데닐레이트 키나제^, 요소 및 콜레스테롤을 생성하였다. 또한, 2D 대 세포 배양 시스템에서 성장한 세포는 .3D이한 유전자 발현 패턴⁽⁸)을 나타낸다. 3D 구상체로 성장한 C3A 간세포의 유전자 발현 분석은 이들 세포가 간 기능을 조절하는 주요 경로에 관여하는 유전자뿐만 아니라 광범위한 간 특이적 단백질을 발현한다는 것을 보여주었다⁸. 이전의 간행물은 2D 배양물에서 기하급수적으로 성장하는 세포의 프로테옴과 3D 스페로이드 배양물에서 동적 평형을 이루는 세포 사이의 차이를 입증했다⁵. 이러한 차이에는 세포 신진 대사가 포함되며, 이는 차례로 세포의 구조, 기능 및 생리학에 영향을 미칩니다⁵. 2D 배양물에서 성장한 세포의 프로테옴은 세포 복제에 관여하는 단백질에서 더 풍부해진 반면, 3D 구상체의 프로테옴은 간 기능성에서 더욱 풍부해졌다⁵.

3D 구상체로 성장한 세포의 느린 복제 속도는 크로마틴 상태 및 변형과 관련된 특정 현상을보다 정확하게 모델링합니다 (예 : 히스톤 클리핑⁹). 히스톤 클리핑은 히스톤 N 말단 꼬리의 일부의 단백질 분해 절단을 일으키는 비가역적 히스톤 번역 후 변형 (PTM)이다. 그것의 생물학적 기능은 여전히 논의 중이다^10,11,12,13, 일차 세포 및 간 조직에서의 그것의 존재는 구상체로 성장한 HepG2 / C3A 세포에 의해 모델링되지만 평평한 세포⁹는 아닙니다. 이것은 크로마틴 상태 및 변형이 주로 유전자에 대한 접근성을 조절함으로써 DNA 판독을 조절하고 따라서 발현¹⁴를 조절하기 때문에 중요합니다. 히스톤 PTM은 히스톤이 조립되는 뉴클레오솜의 순 전하에 영향을 미침으로써 크로마틴 상태에 직접적으로 영향을 미치거나, 크로마틴 작가, 독자 및 지우개(¹⁴)를 모집함으로써 간접적으로 영향을 미친다. 현재까지 수백 개의 히스톤 PTM이^{확인되어 염색}질이 DNA¹⁶을 해석하기 위해 세포에 의해 사용되는 "히스톤 코드"를 호스팅한다는 가설을 강화했습니다. 그러나, 무수한 PTM 조합(¹⁵)의 확인, 및 히스톤 PTM의 조합이 종종 단리된 상태로 존재하는 PTM으로부터 상이한 생물학적 기능을 갖는다는 발견(예를 들어, Fischle, et ^al.17)은 "히스톤 코드"를 해독하기 위해 더 많은 작업이 필요하다는 것을 강조한다.

현재, 히스톤 PTM 분석은 항체 (예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 또는 크로마틴 면역침전 후 시퀀싱 [ChIP-seq]) 또는 질량 분광법 (MS)을 이용하는 기술에 기초한다. 항체 기반 기술은 높은 감도를 가지며 히스톤 마크의 게놈 전체 국소화에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만 조합 ^18,19,20에 존재하는 희귀 한 PTM 또는 PTM을 연구하는 데 종종 제한적입니다. MS는 단일 및 공존하는 단백질 변형, 특히 히스톤 단백질 ^18,19,20의 고처리량 및 편향되지 않은 동정 및 정량화에 더 적합하다. 이러한 이유로, 이것 및 몇몇 다른 실험실은 히스톤 펩티드 (상향식 MS), 무손상 히스톤 꼬리 (중간 다운 MS) 및 전장 히스톤 단백질 (하향식 MS)^21,22,23의 분석을 위해 MS 파이프 라인을 최적화했습니다.

아래에 자세히 설명 된 것은 HepG2 / C3A 구상체를 재배하고 탠덤 질량 분광법 (nLC-MS / MS)과 온라인으로 결합 된 나노 액체 크로마토그래피를 통해 히스톤 펩티드 분석 (상향식 MS)을 준비하기위한 워크 플로입니다. 2D 세포 배양물을 성장시키고 세포를 수확하여 생물반응기로 옮겨 구상체를 형성하기 시작했습니다 (그림 1). 배양에서 18일 후, 구상체를 소듐 부티레이트 또는 소듐 숙시네이트로 처리하여 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 상대적 풍부도를 증가시켰다. 특히, 3D 배양물은 유전성 화합물뿐만 아니라 평평한 배양 등가물로 처리 될 수 있습니다. 사실, 최근의 간행물은 3D 배양물에서 세포의 독성학 반응이 2D 편평한 배양^24,25에서의 것보다 일차 조직과 더 유사하다는 것을 강조한다. 그런 다음 세포를 지정된 시점에서 수집하고 핵 분리를 수행했습니다. 그 후, 히스톤을 추출하고 트립신 소화 전후에 Garcia et ^al.26에 의해 처음 개발된 프로토콜에 따라 프로피온성 무수물로 유도체화하였다. 이 절차는 역상 크로마토그래피 (_C18)로 온라인 분리 및 MS로 검출하기에 적합한 크기의 펩티드를 생성한다. 마지막으로, 히스톤 펩티드가 확인되고 정량화되었고, 생성된 데이터는 보다 완전한 생물학적 해석을 위해 여러 가지 방법으로 표현되었다.

Protocol

1. 완충제 및 시약의 제조

1. 세포 성장 배지 (HepG2 / C3A 세포 용) : Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM, 4.5 g / L 포도당 포함)에 태아 소 혈청 (FBS) (10 % v / v), 비 필수 아미노산 (1 % v / v), L- 글루타민 보충제 (1 % v / v) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (0.5 % v / v)을 첨가하십시오. 성장 배지는 최대 2주 동안 4°C에서 저장된다.
2. 200 mM 소듐 부티레이트(NaBut) 용액: 10 mL를 제조하기 위해, 220.18 mg의 NaHowever를 10 mL의_ddH2O에 재현탁하여 -20°C에서 1 mL 분취량을 보관한다. 세포 처리 전에, 0.45 mm 시린지 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 여과된 용액 1 mL를 20 mM의 작동 농도에 대해 9 mL의 세포 성장 배지에 첨가한다.
3. 100 mM 소듐 숙시네이트(NaSuc) 용액: 10 mL를 준비하기 위해, 10 mL의 ddH2O. 1 mL 분취량을 -₂₀°C에서 보관하면서 162.05 mg의 NaSuc을 재현탁한다. 세포 처리 전에, 0.45 mm 시린지 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 여과된 용액 1 mL를 10 mM의 작동 농도에 대해 9 mL의 세포 성장 배지에 첨가한다.
4. 차가운 0.2 M H2SO4: 1 L를 제조하기 위해, HPLC 등급 물 990 mL에 농축된_H2SO4 10 mL를 첨가한다. 4°C에서 보관한다.
5. 차가운 아세톤 + 0.1 % 염산 (HCl) : 아세톤에 진한 HCl (0.1 % v / v)을 첨가하십시오. 4°C에서 보관한다.
6. 100 mM NH4HCO3 용액, pH 8.0: 1 L를 제조하기 위해, HPLC 등급의 물 1 L에 7.91 g의_NH4HCO3를 재현탁시켰다. 50 mL 분취량을 -20°C에서 보관하십시오.
7. 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 용액 : HPLC 등급 물에 농축 TFA (0.1 % v / v)를 첨가하십시오. 4°C에서 보관한다.
8. 60% 아세토니트릴/0.1% TFA 용액: HPLC 등급 물에 HPLC 등급 아세토니트릴(60% v/v)을 첨가합니다. 그런 다음이 솔루션에 농축 TFA (0.1 % v / v)를 첨가하십시오. 4°C에서 보관한다.
9. 2% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산: HPLC 등급 물에 HPLC 등급 아세토니트릴(2% v/v)을 첨가합니다. 그런 다음이 용액에 농축 된 포름산 (0.1 % v / v)을 첨가하십시오.
10. 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산: HPLC 등급 물에 HPLC 등급 아세토니트릴(80% v/v)을 첨가합니다. 그런 다음이 용액에 농축 된 포름산 (0.1 % v / v)을 첨가하십시오.

2. 3D 배양 시스템의 제조

참고 : 일차 또는 불멸화 된 다른 세포는 다른 배양 특성을 가지므로 구상체의 형성은 세포 유형마다 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 생물 반응기와 혁신적인 3D 세포 배양 시스템을 사용하여 HepG2 / C3A 스페로이드 형성을 위해 확립되었습니다.

1. 표준 성장 배지를 사용하여 세포가 80% 합류할 때까지 단층으로 성장시킨다.
2. 세포를 HBSS (75^cm2 플라스크의 경우 5 mL)로 세척하고, 세포를 5% CO2로 37oC에서 5분 동안 HBSS (1:2 희석액)에 희석된 0.05% 트립신-EDTA 5 mL로 인큐베이션_한다.
3. 현미경으로 세포 분리를 확인하고 3 mL의 태아 소 혈청 (FBS) 또는 성장 배지 (5 % -10 % FBS 함유)를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다.
4. 세포 수를 계수하고 세포 현탁액을 희석하여 1 x 10⁶ 세포를 최대 부피 1.5 mL로 얻었다.
5. 웰을 0.5 mL의 성장 매질로 세척함으로써 초저 부착 24-웰 둥근 바닥 플레이트 (웰 당 다중 마이크로웰 포함)를 평형화시킨다. 플레이트를 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 웰 표면으로부터 기포를 제거하였다.
6. 세포 현탁액을 플레이트 내로 옮기고 120 x g에서 3분 동안 원심분리한다 .
7. 플레이트를 스페로이드 형성을 위해 5% CO2와 함께 ^37oC에서₂₄ 시간 동안 인큐베이션한다. 한편, 습도 챔버를 25 mL의 멸균수로 채우고 세포 챔버를 9 mL의 성장 배지로 채워 생물반응기를 평형화시킨다.
8. 클리노스타트 인큐베이터에서 회전하는 생물반응기를 5% CO2로 ^37oC에서₂₄시간 동안 인큐베이션한다.

3. 생물반응기에서 구상체의 성장

참고: 구상체의 구조를 보존하기 위해 3D 구조물을 취급하는 데 넓은 보어 팁이 사용됩니다.

1. 1mL 너비의 보어 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 초저 부착 플레이트에서 구상체를 분리하고 조직 배양 처리 접시로 옮깁니다.
2. 0.5 mL의 미리 가온된 성장 배지로 플레이트를 세척하고 동일한 접시로 옮긴다.
3. 현미경으로 구상체의 품질을 평가하고 충분히 형성된 구상체를 선택하십시오. 좋은 품질의 구상체는 균일 한 크기, 컴팩트 함 및 원형도를 가지고 있습니다.
4. 구상체를 5mL의 신선한 성장 배지로 채워진 평형화된 생물반응기로 옮깁니다. 구상체를 옮긴 후 생물 반응기를 신선한 성장 배지로 완전히 채 웁니다.
5. 생물반응기를 클리노스타트 인큐베이터에 넣고 회전 속도를 10-11 rpm으로 조절한다.
6. 2-3 일마다 10 mL의 오래된 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 배지로 교체하여 성장 배지를 교환하십시오.
7. 스페로이드 성장에 따라 회전 속도를 조정하여 구상체의 크기와 수가 증가함에 따라 증가합니다.
8. 배양에서 18 일 후, 구상체는 치료 및 / 또는 수집 할 준비가되었습니다.

4. 스페로이드 처리 및 수집

참고: 이 프로토콜에서 HepG2/C3A 구상체는 아세틸화 및 숙시닐화를 각각 포함하는 히스톤 마크의 수준을 평가하기 위해 소듐 부티레이트(NaBut) 및 소듐 숙시네이트(NaSuc)로 처리됩니다.

1. 화합물의 적절한 작동 농도 (예를 들어, 20 mM의 NaBut 또는 10 mM NaSuc)로 성장 배지를 준비한다. 생물반응기의 배지를 처리된 배지와 교환한다.
   참고 : 제어 조건을 수립하려면 치료를 추가하기 전에 실험을 위해 충분한 구상체를 수집하거나 처리되지 않은 구상체에 대한 생물 반응기를 지정하십시오.
2. 충분한 치료 시간 (예를 들어, NaSuc 치료의 경우 48 h 내지 1 주일 또는 NaBut 치료의 경우 48-72 h) 후에 프로테오믹 분석을 위해 구상체를 수집한다.
   참고: 이 프로토콜을 사용한 히스톤 추출을 위해, 대략 1 x 10 6개의 세포를 함유하는⁶ 내지 여덟 개의 구상체가 수집되었다.
   1. 상단 포트를 통해 생물반응기에서 3-5 mL의 배지를 제거하십시오.
   2. 전면 포트를 열고 1mL 너비의 보어 팁을 사용하여 구상체를 제거하고 마이크로 원심분리 튜브에 넣으십시오.
   3. 구상체를 100 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 매체를 폐기한다.
      참고: 생물반응기의 배지는 변경될 수 있으며 생물반응기는 추가적인 치료 시간 또는 회수를 위해 인큐베이터로 복귀될 수 있습니다.
   4. 구상체를 200 μL의 HBSS로 세척하여 FBS를 제거하였다. 100 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
      참고 : 구상체는 처리 될 때까지 -80 ^oC에서 저장할 수 있습니다.

5. 히스톤 추출

참고 : 히스톤에 존재하는 많은 염기성 아미노산 잔기는 인산 골격을 가진 DNA와 밀접하게 상호 작용할 수있게합니다. 히스톤은 핵에서 가장 기본적인 단백질 중 일부이기 때문에 얼음처럼 차가운 황산 (0.2 M_H2SO4)으로 추출하면 오염이 최소화됩니다. 비 히스톤 단백질은 강산에서 침전됩니다. 최종 농도 33%로 희석된 고농축 트리클로로아세트산(TCA)은 황산으로부터 히스톤을 침전시키기 위해 이후에 사용된다. 전체 히스톤 추출을 위해 모든 샘플, 튜브 및 시약을 얼음 위에 보관하십시오.

1. 세포 펠릿 (∼10-20 μL)에 차가운_{0.2 M H2SO4}의 다섯 부피 (∼100 μL)를 첨가하고, 피펫을 위아래로 피펫하여 펠릿을 파괴하고 히스톤을 방출한다.
2. 튜브를 일정한 회전으로 최대 4시간 동안 인큐베이션하거나 ^4oC에서 진탕한다.
   참고: 부피가 500μL를 초과하는 재현탁 샘플의 경우, 2시간 인큐베이션으로 히스톤을 추출하기에 충분합니다(더 긴 인큐베이션은 다른 기본 핵 단백질의 추출을 초래할 수 있음). 부피가 200 μL 미만인 재현탁 샘플의 경우, 더 나은 수율을 위해 4시간 인큐베이션이 필요합니다.
3. 4°C에서 5분 동안 3,400 x g 에서 원심분리한다. 새로운 튜브에 상층액을 수집하고 나중에 펠렛을 버리십시오.
4. 최종 25 % -33 % v / v (예 : 차가운 TCA 40-60 μL : 상청액 120 μL)를 구성하도록 냉간 농축 TCA를 추가하고 튜브를 몇 번 뒤집어 혼합하십시오.
5. 튜브를 일정한 회전에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하거나 ^4oC에서 진탕시킨다.
   참고 : 더 작은 시작 펠렛 크기의 경우 하룻밤 동안 배양하는 것이 좋습니다.
6. 3,400 x g 에서 ^4oC에서 5분 동안 원심분리하여 피펫팅하여 상층액을 버린다. 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 튜브 또는 펠릿의 측면을 만지지 마십시오.
   참고 : 히스톤은 튜브의 측면과 하단 양쪽에 침착됩니다. 튜브의 맨 아래에 형성된 백색 불용성 펠릿은 대부분 비 히스톤 단백질 및 기타 생체 분자를 포함합니다.
7. 유리 파스퇴르 피펫 (~ 500 μL / 튜브)을 사용하여 차가운 아세톤 + 0.1 % HCl로 튜브 (벽 및 펠렛)를 씻으십시오.
8. 3,400 x g 에서 ^4oC에서 5분 동안 원심분리하여 튜브를 뒤집어 상층액을 버린다.
9. 유리 파스퇴르 피펫 (~ 500 μL / 튜브)을 사용하여 튜브 (벽 및 펠렛)를 100 % 차가운 아세톤으로 씻으십시오. ^4oC에서 5분 동안 3,400 x g에서 원심분리한다.
10. 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 나머지 아세톤을 피펫으로 꺼냅니다. 뚜껑을 열고 샘플을 벤치에서 ~ 20 분 동안 공기 건조시킵니다.
11. 프로피오닐화를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - ^80oC에저장한다.

6. 파생화의 첫 번째 라운드

참고: 히스톤 단백질을 소화하기 위해 트립신을 사용하면 기존의 프로테오믹스 설정을 사용하여 식별하기 어려운 지나치게 작은 펩티드가 생깁니다. 이러한 이유로, 프로피온성 무수물은 변형되지 않은 모노메틸리신 잔기의 ɛ-아미노기를 화학적으로 유도체화하는데 사용된다. 이것은 트립신 단백질 분해를 C 말단 아르기닌 잔기로 제한합니다. 96웰 플레이트의 샘플의 경우 시약 픽업을 위해 다중 채널 피펫 및 저장소를 사용하는 것이 좋습니다(그림 2A). 유도체화는 또한 펩티드의 유리 N-테르미니를 표지하기 위해 소화 후에 수행되어 펩티드 소수성을 증가시키고, 따라서 역상 크로마토그래피 보유를 증가시킨다.

1. 샘플을 100 mM 중탄산암모늄 (pH 8.0) 중의 15%-20% 아세토니트릴의 20 μL에 재현탁시킨다. 15 초 동안 소용돌이 치고, 30 초 동안 1,000 x g 로 회전합니다.
2. 여덟 개 이상의 샘플이 있는 경우, 재현탁된 각 샘플을 96웰 플레이트로 옮깁니다.
   참고: 샘플이 96웰 플레이트로 전송되지 않은 경우 6.3-6.7, 7.1-7.5 및 8.1-8.5단계에서 단일 채널 파이펫을 사용할 수 있습니다.
3. 후드 아래에 다채널 피펫을 사용하여 2 μL의 프로피온성 무수물을 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
4. 다채널 피펫을 사용하여 수산화암모늄 10μL를 빠르게 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
   참고: 프로피온산은 펩타이드로부터 프로피온산 무수물과 유리 아민 사이의 반응의 산물이며 샘플 pH를 감소시킬 수 있습니다. pH 8은 수산화암모늄을 1:5(v/v)의 비율로 샘플에 첨가하여 재확립할 수 있다.
5. pH 시험지를 사용하여 pH가 8인지 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다. pH가 8> 경우, 1 μL 포름산 또는 아세트산을 첨가하여 조정한다. pH > 10일 때, 더 높은 pKa를 갖는 다른 아미노산 잔기의 표지가 가능하다.
6. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
7. 6.3-6.6단계를 반복합니다. 히스톤 프로피오닐화의 이중 라운드는 거의 완전한 반응 효율을 보장합니다.
8. 모든 웰이 완전히 건조 될 때까지 속도 진공에서 플레이트를 건조시킵니다 (~ 9 시간).
9. 트립신 소화를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - ^80oC에서저장한다.

7. 히스톤 소화

참고: 히스톤은 트립신을 사용하여 펩타이드로 소화되며, 이는 아르기닌과 리신 잔기의 카르복실 쪽에서 절단됩니다. 그러나, 프로피오닐화는 리신 잔기를 변형시키기 때문에, 아르기닌 잔기만이 절단된다(도 2B).

1. 트립신 용액 (50 mM_NH4HCO3, pH 8.0 중 25 ng/μL)을 준비한다. 20 μL의 트립신 (500 ng)을 각 샘플에 첨가하십시오.
   1. 50 mM_NH4HCO3 용액을 준비하기 위해, HPLC 등급의 물로 100 mM_NH4HCO3용액을 1:1 v/v로 희석한다.
2. pH 시험지를 사용하여 pH가 8인지 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다. pH가 8>면, 1 μL의 포름산 또는 아세트산을 첨가하여 조정한다.
3. 실온에서 밤새 소화하거나 ^37oC에서 6-8시간 동안 배양한다.
4. 가능하다면 소화 후 ~ 3 시간 후에 pH가 감소했을 수 있으므로 pH를 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다.
5. 50 ng/μL 트립신 용액 (250 ng)의 추가 5 μL를 첨가하고 소화를 계속하십시오.
6. 프로피오닐화의 두 번째 라운드를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - ^80oC에서저장한다.

8. 펩티드 N-테르미니의 유도체화

참고: 그들의 N 말단에서 히스톤 펩티드의 프로피오닐화는 프로피오닐 그룹이 펩티드 소수성을 증가시킴에 따라 역상 액체 크로마토그래피 (예를 들어, 히스톤 H3의 아미노산 3-8)에 의해 가장 짧은 펩티드의 보유를 향상시킨다.

1. 후드 아래에 다채널 피펫을 사용하여 2 μL의 프로피온성 무수물을 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
2. 다채널 피펫을 사용하여 수산화암모늄 10μL를 빠르게 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
   참고: 프로피온산은 펩티드로부터 프로피온산 무수물과 유리 아민 사이의 반응의 산물이며, 샘플 pH를 감소시킬 수 있다. pH 8은 수산화암모늄을 1:5(v/v)의 비율로 샘플에 첨가하여 재확립할 수 있다.
3. pH 시험지를 사용하여 pH가 8인지 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다. pH가 8> 경우, 1 μL 포름산 또는 아세트산을 첨가하여 조정한다. pH > 10일 때, 더 높은 pKa를 갖는 다른 아미노산 잔기의 표지가 가능하다.
4. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
5. 8.1-8.4단계를 반복합니다. 히스톤 프로피오닐화의 이중 라운드는 거의 완전한 반응 효율을 보장합니다.
6. 모든 웰이 완전히 건조 될 때까지 속도 진공에서 플레이트를 건조시킵니다 (~ 9 시간).
7. 탈염 단계를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - ^80oC에서저장한다.

9. 탈염 및 샘플 정리

참고: 샘플에 존재하는 염은 질량 분광법 분석을 방해합니다. 염은 또한 전기 분무 중에 이온화되며 펩티드로부터의 신호를 억제 할 수 있습니다. 염은 펩티드 상에 이온성 부가물을 형성할 수 있으며, 이는 부가된 펩티드가 상이한 질량을 갖도록 한다. 이것은 펩티드의 신호 강도를 감소시키고 적절한 식별 및 정량화를 방해한다. 탈염에 대한 설정은 그림 2C에 설명되어 있습니다.

1. HLB 수지 (100 % 아세토니트릴 중 50 mg / mL)를 자기 교반 플레이트에 혼합하기 시작하십시오.
2. 유동을 수집하기 위해 96웰 폴리프로필렌 필터 플레이트 아래에 96웰 수집 플레이트가 놓여 있는지 확인하십시오.
3. 웰 당 70 μL의 HLB 현탁액을 필터 플레이트에 첨가한다. 튀는 것을 방지하기 위해 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
4. 수지를 0.1% TFA의 100 μL로 세척한다. 튀는 것을 방지하기 위해 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
5. 각 샘플을 0.1% TFA의 100 μL에 재현탁시킨다. pH를 확인; ~ 2-3이어야합니다.
6. 각 샘플을 각 웰에 로드합니다. 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
7. 100 μL 0.1% TFA로 세척한다. 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
8. 수집 플레이트를 새로운 96웰 수집 플레이트로 교체합니다.
9. 웰 당 60% 아세토니트릴/0.1% TFA의 60 μL를 첨가한다. 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 유동 스루를 수집하고 속도 진공에서 건조하십시오.
10. LC-MS/MS로 진행하거나 사용 전까지 샘플을 -80 o C ^에보관하십시오.

10. 질량 분광법과 결합 된 액체 크로마토그래피를 통한 히스톤 펩티드 분석

1. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 실행되도록 이동상을 준비한다. 이동상 A (MPA): 2% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 이동상 B (MPB): 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산.
2. HPLC 방법을 다음과 같이 프로그램한다: (1) 30분에 걸쳐 4%-34% MPB; (2) 5 분 이상 34 % -90 % MPB; 및 (3) 5분 동안 등용매 90% MPB를 포함한다. C₁₈ 3 μm 패킹 재료, 75 μm 내부 직경, 20-25 cm 길이의 권장 컬럼 특성을 사용하십시오. 내부 직경이 75μm인 나노 컬럼의 경우 유량을 250-300nL/min으로 설정합니다.
   1. HPLC가 샘플 로딩 전에 컬럼 평형화를 자동화하도록 프로그래밍되지 않은 경우에, 1분에 걸쳐 (4) 90%-4% MPB 및 (5) 10분에 걸쳐 등용매 4% MPB를 포함한다.
3. MS 획득 방법을 프로그래밍한다.
   1. 계측기가 각 듀티 사이클의 시작 부분에서 하나의 전체 MS 스캔을 수행하는지 확인하십시오. 고분해능 계측(예: orbitrap 또는 비행 시간 분석기)이 권장되는데, 이는 신호 추출 중에 활용될 수 있는 질량 정확도 때문입니다. 그러나, 저분해능 계측기는 또한 앞서 설명된 바와 같이 활용될 수 있다^(27,28).
   2. 전체 MS 스캔 다음에 16개의 MS/MS 스캔 이벤트가 발생하는지, 각 이벤트에는 300-1100의 m/z 범위에 걸쳐 50m/z의 분리 폭이 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 첫 번째 스캔은 300-350 m/z, 두 번째 스캔은 350-400 m/z 등에서 신호를 분리해야 합니다. 가능하다면 고해상도로 MS/MS 스캔을 획득하지만, 전체 MS 스캔에 비해 낮은 분해능으로 충분하다(손상되지 않은 이온에 비해 단편 이온의 질량이 작기 때문에).
   3. HPLC 방법은 ∼3-40 s의 피크 폭을 갖는 크로마토그래피 신호를 생성할 것이다; 적절한 신호 정량화를 보장하기 위해, 질량 분석기가 크로마토그래피 피크당 적어도 10개의 듀티 사이클(즉, 3초 이상의 듀티 사이클)을 수행하는지 확인하십시오.
   4. 트래핑 스타일 질량 분석기(orbitrap, ion trap)를 사용하는 경우 이온 주입 시간 제한이 <200ms로 설정되어 있는지 확인하십시오. 다른 분석기 (사중극자, 비행 시간)의 경우 스캔 시간이 빠르기 때문에 문제가되지 않습니다. 예비 테스트가 필요할 수 있습니다.
      참고: 히스톤 펩티드 분석을 위한 MS 방법에 대한 더 자세한 내용은 하기 참고문헌^27,28,29에서 찾을 수 있다.
4. 소화된 히스톤 샘플의 ~1μg/μL에 해당하는 10μL의 MPA에 샘플을 재현탁합니다. 배치의 모든 샘플이 유사한 희석 및 부피를 사용하여로드되는 경우 정확한 로딩량은 중요하지 않습니다 (평가하기가 쉽지 않음).
5. 1 μL의 샘플을 HPLC 컬럼 상에 로딩한다.
6. 10.1-10.3단계에서 프로그래밍된 LC-MS/MS 메서드를 실행합니다.

11. 데이터 분석

1. MS 원시 데이터 파일을 피크 영역 통합을 수행하도록 설계된 소프트웨어로 가져옵니다.
   참고: EpiProfile^30,31은 현재 연구에서 사용되며 알려진 히스톤 펩티드의 신뢰할 수 있는 피크 면적 추출에 최적화되어 있으므로 일반적으로 권장됩니다. 그러나, 스카이라인^32,33과 같은 추출된 이온 크로마토그래피를 위해 자유롭게 이용가능한 다른 소프트웨어가 ^{적합하다.}
2. 주어진 (un) 변형된 펩티드의 상대적 풍부도를 그의 모든 변형된 형태에서 펩티드의 전체 영역으로 나눈 단일 펩티드의 면적으로서 계산한다. EpiProfile^30,31과 같은 소프트웨어에는 이미 신호 추출을 위한 펩타이드 라이브러리가 포함되어 있습니다. 그렇지 않으면, 수동으로 또는 일상적인 프로테오믹스 파이프라인을 사용하는 펩티드 식별을 통해 관심있는 펩티드의 라이브러리를 생성한다.

Results

이 프로토콜에서, HepG2/C3A 구상체는 20 mM NaBut 및 10 mM NaSuc로 처리되었으며, 둘 다 히스톤 PTM의 글로벌 수준에 영향을 미쳤다 (도 3A). 그런 다음 히스톤 PTM을 MS/MS 수집을 통해 단일 잔기 수준에서 확인하고 정량화하였다(도 3B).

샘플이 반복실험에서 실행될 때, 통계적 분석을 수행하여 샘플 간의 PTM의 폴드 변화 농축과 관찰의 재현성을 평가할 수 있습니다. 표시된 데이터는 아세틸화로 변형된 펩티드가 NaBut 대 대조군으로 처리된 구상체에서 풍부하다는 것을 입증하는 반면(도 3C), NaSuc으로 처리된 샘플은 라이신 숙시닐화로 변형된 히스톤 펩티드의 상대적 풍부도가 더 높다는 것을 입증한다(도 3D). ...

Discussion

히스톤 PTM의 분석은 일반적인 프로테오믹스 분석 파이프라인과 근본적으로 다릅니다. 대부분의 히스톤 PTM은 여전히 수수께끼 같은 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 결과적으로 Gene Ontology 또는 pathway 데이터베이스와 같은 주석을 사용할 수 없습니다. 히스톤 변형을 그들의 촉매작용을 담당하는 효소 또는 이들 PTM에 결합하는 도메인을 함유하는 단백질과 연관시키는 몇몇 자원이 존재한다(예를 들어, HISTome³⁶). 뿐만 아니라, 히스톤 PTM의 글로벌 수준이 조절될 때 크로마틴의 전반적인 상태를 추측할 수 있다. 예를 들어, 히스톤 아세틸화 또는 숙시닐화와 같은 다른 아실화의 전반적인 증가는 일반적으로 크로마틴 탈축합^37,38과 연관된다.

MS 분석은 아미노산 서열에 대한 이들의 정확한 국소화와 같은 이러한 변형에 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% 트립신-EDTA 용액	Gibco	25300054
0.5-20 µ L 피펫 팁	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Bio-Rad	2239480
10 µ L 멀티채널 피펫	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL 주사기	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	루어 락 팁, 12 mL
눈금 10, 20, 200, 1000 &마이크로; L 싱글채널 피펫	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µ L 피펫 팁	Rainin	30389164
18 G 주사기 바늘	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" 길이, 0.05" 직경
200 &마이크로; L 멀티 채널 피펫	Corning	4082
2-200 µ L 피펫 팁	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate	Corning	07-200-602
75 cm2  U자형 세포 배양 플라스크	Corning	461464U	미처리, 벤트 캡 포함
96웰 스커트 플레이트	Axygen	PCR-96-FS-C(Corning)
	Acetone Fisher Scientific	A949-1	아세톤은 차갑게 사용해야 합니다
중탄산암모늄(NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
수산화암모늄 솔루션	Fisher Scientific	AC423300250
세포 배양 등급 물	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	3D 세포 배양용 바이오리액터
ClinoStar CelVivo		N/A	Clinostat CO2 인큐베이터 3D 세포 배양용
제어 장치	CelVivo	N/A	정제 ClinoStar용 설정
Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM)	Corning	17-205-CV	1X 용액, 4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨, L-글루타민 및 페놀 레드
소태아 혈청(FBS)	Corning	35-010-CV
포름산	Thermo Scientific	28905
흄 후드	Mott	N/A	모델 7121000
유리 파스퇴르 피펫	Fisher Scientific	13-678-8B	9", 면 플러그, 붕규산 유리, 비멸균
글루타그로 보충제	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank' s 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	Corning	21-022-CV	칼슘, 마그네슘 및 페놀이 없는 1X 용액
적색 HPLC 등급 아세토니트릴	Fisher Scientific	A955-4
HPLC 등급 물	Fisher Scientific	W6-1
염산(HCl)	Fisher Scientific	A481-212
얼음	N/A	N/A
MEM 비필수 아미노산	Corning	25-025-CI	100X 용액
오아시스 HLB 수지	Waters	186007549	친수성-친유성-평형(HLB) 수지(30µ); m 입자 크기
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPfadbmbhq	고해상도 질량 분석기
Oro-Flex I 폴리프로필렌 필터 플레이트	Orochem	OF1100	96-well 폴리프로필렌 필터 플레이트 w/ 10 µ M PE frit
페니실린-스트렙토마이신	Corning	30-002-CI	100X 용액
pH 종이	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH 시험지
피펫 건	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	폴리아미드 코팅이 된 유연한 용융 실리카 모세관 튜브, 75 µ M ID x 363 & 마이크로; M OD
폴리스티렌 10mL 혈청학적 피펫, 멸균	Fisher Scientific	1367549
프로피온 무수물	Sigma-Aldrich	240311-50G
냉장 원심분리기	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur 수지	MSWIL	R13. AQ.0003	120 Å 기공 크기, C18-AQ 상, 3 &마이크로; M 비드 크기
Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
염기서열분석 등급 변형 트립신	Promega	V5111
부티르산나트륨	Thermo Scientific	A11079
석신산나트륨 이염기	성 Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac 진공 농축기(1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac 진공 농축기(96-well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
멸균 후드	Thermo Scientific	1375	Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker ACS 시약 분석
조직 배양 처리 된 100mm x 20mm 접시	Fisher Scientific	08-772-23
트리클로로 아세트산 (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	HPLC 등급 물에서 100 % w / v 재현탁
트리 플루오로 아세트산 (TFA)Fisher	Scientific	PI28904	염기서열 분석 등급
진공 매니 폴드 96-well	Millipore	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
수조	Fisher Scientific	FSGPD10
와이드 보어 피펫 팁 1000 &마이크로; L	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
와이드 보어 피펫 팁 200 &마이크로; L	액시젠	14-222-730 (피셔 사이언티픽)