이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유동물 세포의 편평한 배양은 세포 생리학을 이해하기 위해 시험관내 접근법으로 널리 사용되지만, 이 시스템은 부자연스럽게 빠른 세포 복제로 인해 고체 조직을 모델링하는데 한계가 있다. 이것은 성숙한 크로마틴을 모델링 할 때 특히 도전적인데, 빠른 복제 세포는 종종 DNA 복제에 관여하고 이질적인 폴리 플로이드 집단을 가지고 있기 때문입니다. 아래는 3차원(3D) 세포 배양 시스템을 사용하여 정동작 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하기 위한 워크플로우입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 간세포 암종 세포주는 활성 영양소 확산 및 낮은 전단력을 제공하는 인큐베이터에서 재현 가능한 3D 구상체로 성장한다. 소듐 부티레이트와 소듐 숙시네이트에 의한 처리는 각각 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 증가를 유도하였다. 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화 수준의 증가는 보다 개방된 크로마틴 상태와 연관된다. 그런 다음 구상체는 세포 핵의 분리를 위해 수집되며, 히스톤 단백질은 번역 후 변형의 분석을 위해 추출됩니다. Histone 분석은 탠덤 질량 분광법과 온라인으로 결합 된 액체 크로마토그래피를 통해 수행되고 사내 계산 파이프 라인이 뒤 따릅니다. 마지막으로, 조합 히스톤 마크의 빈도 및 발생을 조사하기 위한 데이터 표현의 예가 도시된다.
서론
19세기 후반부터 세포 배양시스템은 인체 1,2 외부의 세포의 성장과 발달을 연구하기 위한 모델로 사용되어 왔다. 그들의 사용은 또한 조직과 기관이 건강한 상황과 병든 맥락에서 어떻게 기능하는지 연구하기 위해 확장되었습니다 1,3. 현탁액 세포 (예를 들어, 혈액 세포)는 페트리 접시 또는 플라스크에서 매끄럽고 상호 교환 가능하게 성장하며, 생체 내에서 3차원 (3D) 구조로 조립되지 않는다. 고체 기관으로부터 유래된 세포는 2차원(2D) 또는 3D 배양 시스템에서 성장할 수 있다. 2D 배양에서, 세포는 평평한 표면 2,4에 부착되는 단층에서 성장한다. 2D 세포 배양 시스템은 지수 성장 및 빠른 배가 시간, 전형적으로 24 h 내지 수일5를 특징으로 한다. 3D 시스템의 세포는 성장하여 조직과 유사한 대기업을 모델링하는 복잡한 세포 - 세포 상호 작용을 형성하며, 배가시키는 시간이 1 개월 또는 그 ....
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프로토콜
1. 완충제 및 시약의 제조
- 세포 성장 배지 (HepG2 / C3A 세포 용) : Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM, 4.5 g / L 포도당 포함)에 태아 소 혈청 (FBS) (10 % v / v), 비 필수 아미노산 (1 % v / v), L- 글루타민 보충제 (1 % v / v) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (0.5 % v / v)을 첨가하십시오. 성장 배지는 최대 2주 동안 4°C에서 저장된다.
- 200 mM 소듐 부티레이트(NaBut) 용액: 10 mL를 제조하기 위해, 220.18 mg의 NaHowever를 10 mL의ddH2O에 재현탁하여 -20°C에서 1 mL 분취량을 보관한다. 세포 처리 전에, 0.45 mm 시린지 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 여과된 용액 1 mL를 20 mM의 작동 농도에 대해 9 mL의 세포 성장 배지에 첨가한다.
- 100 mM 소듐 숙시네이트(NaSuc) 용액: 10 mL를 준비하기 위해, 10 mL의 ddH2O. 1 mL 분취량을 -20°C에서 보관하면서 162.05 mg의 NaSuc을 재현탁한다. 세포 처리 전에, 0.45 mm 시린지 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 여과된 용액 1 mL를 10 mM의 작동....
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결과
이 프로토콜에서, HepG2/C3A 구상체는 20 mM NaBut 및 10 mM NaSuc로 처리되었으며, 둘 다 히스톤 PTM의 글로벌 수준에 영향을 미쳤다 (도 3A). 그런 다음 히스톤 PTM을 MS/MS 수집을 통해 단일 잔기 수준에서 확인하고 정량화하였다(도 3B).
샘플이 반복실험에서 실행될 때, 통계적 분석을 수행하여 샘플 간의 PTM의 폴드 변화 농축과 관찰의 재현성을 평가할 수 있습니다. 표시된 데이터는 아세틸화로 변형된 펩티드가 NaBut 대 대조군으로 처리된 구상체에서 풍부하다는 것을 입증하는 반면(도 3C), NaSuc으로 처리된 샘플은 라이신 숙시닐화로 변형된 히스톤 펩티드의 상대적 풍부도가 더 높다는 것을 입증한다(도 3D). .......
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토론
히스톤 PTM의 분석은 일반적인 프로테오믹스 분석 파이프라인과 근본적으로 다릅니다. 대부분의 히스톤 PTM은 여전히 수수께끼 같은 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 결과적으로 Gene Ontology 또는 pathway 데이터베이스와 같은 주석을 사용할 수 없습니다. 히스톤 변형을 그들의 촉매작용을 담당하는 효소 또는 이들 PTM에 결합하는 도메인을 함유하는 단백질과 연관시키는 몇몇 자원이 존재한다(예를 들어, HISTome36). 뿐만 아니라, 히스톤 PTM의 글로벌 수준이 조절될 때 크로마틴의 전반적인 상태를 추측할 수 있다. 예를 들어, 히스톤 아세틸화 또는 숙시닐화와 같은 다른 아실화의 전반적인 증가는 일반적으로 크로마틴 탈축합37,38과 연관된다.
MS 분석은 아미노산 서열에 대한 이들의 정확한 국소화와 같은 이러한 변형에 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.
감사의 글
Sidoli 연구소는 백혈병 연구 재단 (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck 및 NIH Office of Director (1S10OD030286-01)를 감사하게 생각합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 트립신-EDTA 용액 | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µ L 피펫 팁 | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µ L 멀티채널 피펫 | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL 주사기 | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | 루어 락 팁, 12 mL |
| 눈금 10, 20, 200, 1000 &마이크로; L 싱글채널 피펫 | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µ L 피펫 팁 | Rainin | 30389164 | |
| 18 G 주사기 바늘 | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" 길이, 0.05" 직경 |
| 200 &마이크로; L 멀티 채널 피펫 | Corning | 4082 | |
| 2-200 µ L 피펫 팁 | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U자형 세포 배양 플라스크 | Corning | 461464U | 미처리, 벤트 캡 포함 |
| 96웰 스커트 플레이트 | Axygen | PCR-96-FS-C(Corning) | |
| Acetone Fisher Scientific | A949-1 | 아세톤은 차갑게 사용해야 합니다 | |
| 중탄산암모늄(NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| 수산화암모늄 솔루션 | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| 세포 배양 등급 물 | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | 3D 세포 배양용 바이오리액터 |
| ClinoStar CelVivo | N/A | Clinostat CO2 인큐베이터 3D 세포 배양용 | |
| 제어 장치 | CelVivo | N/A | 정제 ClinoStar용 설정 |
| Dulbecco의 Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X 용액, 4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨, L-글루타민 및 페놀 레드 |
| 소태아 혈청(FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| 포름산 | Thermo Scientific | 28905 | |
| 흄 후드 | Mott | N/A | 모델 7121000 |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", 면 플러그, 붕규산 유리, 비멸균 |
| 글루타그로 보충제 | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank' s 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) | Corning | 21-022-CV | 칼슘, 마그네슘 및 페놀이 없는 1X 용액 |
| 적색 HPLC 등급 아세토니트릴 | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC 등급 물 | Fisher Scientific | W6-1 | |
| 염산(HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| 얼음 | N/A | N/A | |
| MEM 비필수 아미노산 | Corning | 25-025-CI | 100X 용액 |
| 오아시스 HLB 수지 | Waters | 186007549 | 친수성-친유성-평형(HLB) 수지(30µ); m 입자 크기 |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPfadbmbhq | 고해상도 질량 분석기 |
| Oro-Flex I 폴리프로필렌 필터 플레이트 | Orochem | OF1100 | 96-well 폴리프로필렌 필터 플레이트 w/ 10 µ M PE frit |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Corning | 30-002-CI | 100X 용액 |
| pH 종이 | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH 시험지 |
| 피펫 건 | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | 폴리아미드 코팅이 된 유연한 용융 실리카 모세관 튜브, 75 µ M ID x 363 & 마이크로; M OD |
| 폴리스티렌 10mL 혈청학적 피펫, 멸균 | Fisher Scientific | 1367549 | |
| 프로피온 무수물 | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| 냉장 원심분리기 | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur 수지 | MSWIL | R13. AQ.0003 | 120 Å 기공 크기, C18-AQ 상, 3 &마이크로; M 비드 크기 |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| 염기서열분석 등급 변형 트립신 | Promega | V5111 | |
| 부티르산나트륨 | Thermo Scientific | A11079 | |
| 석신산나트륨 이염기 | 성 Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac 진공 농축기(1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac 진공 농축기(96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| 멸균 후드 | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker ACS 시약 분석 |
| 조직 배양 처리 된 100mm x 20mm 접시 | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| 트리클로로 아세트산 (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | HPLC 등급 물에서 100 % w / v 재현탁 |
| 트리 플루오로 아세트산 (TFA)Fisher | Scientific | PI28904 | 염기서열 분석 등급 |
| 진공 매니 폴드 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| 수조 | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| 와이드 보어 피펫 팁 1000 &마이크로; L | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| 와이드 보어 피펫 팁 200 &마이크로; L | 액시젠 | 14-222-730 (피셔 사이언티픽) |
참고문헌
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing lin....
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재인쇄 및 허가
