단백질체 조절 장애는 확산 침윤성 신경교종의 확산에 중요한 역할을 하지만 몇 가지 관련 단백질은 아직 확인되지 않았습니다. 디지털 공간 처리(DSP)는 침윤성 신경교종의 침습 및 이동에 기여할 수 있는 후보 단백질의 차등 발현을 특성화하기 위한 효율적인 고처리량 접근 방식을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
확산 침윤성 신경 교종은 종양 확산의 침윤성 특성으로 인해 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 그들은 형태학적으로 복잡한 종양으로, 종양 자체와 이질적인 미세 환경 모두에서 높은 수준의 단백질체 가변성을 가지고 있습니다. 이러한 종양의 악성 잠재력은 세포 안정성을 유지하고 미세 환경의 구조적 완전성을 보존하는 과정을 포함하여 여러 주요 경로에 관여하는 단백질의 조절 장애에 의해 향상됩니다. 수많은 벌크 및 단일 세포 신경교종 분석이 있었지만 이러한 단백질체 데이터의 공간적 계층화가 상대적으로 부족합니다. 내인성 종양, 침습성 가장자리 및 미세 환경 간의 종양 발생 인자와 면역 세포 집단의 공간적 분포의 차이를 이해하면 종양 증식 및 전파의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 디지털 공간 프로파일링(DSP)은 이러한 중요한 다층 분석의 토대를 형성할 수 있는 강력한 기술입니다.
DSP는 조직 표본의 사용자 지정 공간 영역 내에서 단백질 발현을 효율적으로 정량화하는 방법입니다. DSP는 구별 영역 내 및 여러 단백질의 차별적 발현을 연구하는 데 이상적이며 여러 수준의 정량적 및 정성 분석이 가능합니다. DSP 프로토콜은 체계적이고 사용자 친화적이어서 단백질체 데이터의 맞춤형 공간 분석이 가능합니다. 이 실험에서 조직 마이크로 어레이는 보관 된 교 모세포종 코어 생검으로 구성됩니다. 다음으로, 항체 패널이 선택되어 샘플 내에서 관심 단백질을 표적으로 합니다. UV 광절단 가능한 DNA 올리고뉴클레오티드에 전접합된 항체는 밤새 조직 샘플과 함께 배양됩니다. 항체의 형광 현미경 시각화에서 단백질 발현을 정량화할 관심 영역(ROI)이 샘플과 함께 정의됩니다. 그런 다음 UV 광선이 각 ROI로 향하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 절단합니다. 올리고뉴클레오티드는 각 ROI 내에서 미세 흡기 및 계수되어 공간 기준으로 해당 단백질을 정량화합니다.
서론
확산 성 신경 교종은 성인에서 가장 흔한 유형의 악성 뇌종양이며 항상 치명적입니다. 신경 교종 세포가 뇌에서 광범위하게 이동하는 경향은 주요 치료 과제입니다. 그들이 확산되는 메커니즘에는 직접 이주와 확인되지 않은 침략이 포함됩니다. 침습성 신경교종 세포는 백질 관1을 따라 향성과 이동을 나타내는 것으로 나타났으며, 최근 연구에서는 이러한 관의 탈수초화를 활성 원발성 특징2으로 암시합니다. 침습은 상피에서 중간엽으로의 전이에 의해 매개되며, 여기서 신경교종 세포는 세포외 기질 단백질 및 세포 부착 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키고, 이동을 증폭하고, 종양 미세 환경을 통한 전파를 촉진함으로써 중간엽 특성을 획득한다 3,4,5.
분자 수준에서 세포 안정성을 부여하고 면역 원성 성분과의 인터페이스를 부여하는 여러 단백질의 파괴가 입증되었습니다6. 침윤성 신경교종은 항-세포사멸(예를 들어, PTEN) 특성을 갖는 단백질의 억제를 겪는 것으로 알려져....
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프로토콜
아래에 설명 된 프로토콜은 Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee의 지침을 따릅니다. 이 연구에 조직 샘플이 포함 된 환자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표 섹션을 참조하십시오.
1. 슬라이드 준비17
- 인간 성인형 미만성 침윤성 신경교종에서 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직을 회수하거나 준비합니다.
참고: 이 실험에서는 교모세포종 환자 3명의 파라핀 포매 생검 블록을 사용했습니다. - 조직 마이크로어레이(TMA) 블록을 만듭니다. 각 생검에서 여러 개의 2mm 코어를 가져와 단일 TMA 블록에 넣습니다(그림 1, 상단). TMA 블록에서 4μm의 섹션을 절단하고 유리 슬라이드에 장착합니다. 각 슬라이드를 슬라이드 홀더 개스킷 안에 놓습니다. 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
2. 반자동 IHC 시스템 준비 및 소프....
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결과
도 4 는 교모세포종의 샘플에 대해 수행된 DSP 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. DSP 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각적으로 캡처하는 방법 중 하나를 보여주는 히트 맵이 제공됩니다. 행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 파란색에서 빨간색의 색상 범위는 각각 낮은 표현에서 높은 표현을 나타냅니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단백질 이질성을 반영하고 차등 단백질 발현과의 가능한 공간적 연관성을 시사합니다. 예를 들어, 본 실험에서 S100 및 CD56은 신경 마커이기 때문에 보편적으로 높습니다.
변동성이 가장 큰 마커에는 B7-H3, Ki-67, CD44 및 피브로넥틴이 포함되었습니다. 이러한 마커는 각각 종양 증식, 이동 및 전이와 중요한 연관성을 가지고 있습니다. 따라서 악성 코어, 악성 침범 및 비 악성 조직의 샘플 사이에 지역적 변동성을 나타내는 것이 합리적입니다. 수치 데이터 표현.......
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토론
신경교종의 공격성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단백질의 다양성과 이러한 단백질 중 일부가 발견되지 않은 상태로 남아 있다는 개념을 감안할 때 고처리량 단백질 정량 방법은 이상적인 기술적 접근 방식입니다. 또한 종양학 샘플의 공간 데이터가 종종 차등 발현18과 상관 관계가 있다는 점을 감안할 때 공간 프로파일링을 단백질 정량화 접근 방식에 통합하면 보다 효과적인 분석이 가능합니다.
DSP의 고처리량 접근 방식은 또한 산탄총과 같은 접근 방식으로 사용할 수 있으며, 이는 질병의 잠재적인 새로운 바이오마커 및 치료에 대한 반응을 발견하는 데 이상적입니다. 흑색종에 대한 두 연구에서 DSP는 이필리무맙 및 니볼루맙 대 니볼루맙 단독 요법19 과의 병용 요법과 이필리무맙 및 니볼루맙을 사용한 신보조 병용 요법과 표준 보조 요법20에 대한 반응을 평가하는 데.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 다트머스 히치콕 건강 시스템의 병리학 및 실험실 의학과에서 임상 유전체학 및 첨단 기술 연구소의 지원을 인정합니다. 저자는 또한 NCI 암 센터 지원 보조금 5P30 CA023108-37과 함께 다트머스 암 센터의 병리학 공유 리소스를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BOND 연구 검출 시스템 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | 시약 트레이에 열린 용기를 포함하는 개방형 검출 시스템 |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 고정 조직 세척용 10X 농축 완충액 |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | 연락처 회사 | 차단 시약 |
| Cy3 접합 키트 | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 형광 항체 접합 키트 |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | 연락처 회사 | 단백질 및 RNA 표적 이미징 및 특성화 시스템 |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | GeoMX DSP용 버퍼 키트(샘플 처리 및 준비용 버퍼 포함) |
| GeoMx Hyb 코드 Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | GeoMX DSP experiemtns 실행을 위한 컨트롤 |
| GeoMx 면역 세포 패널(Imm 세포 Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | 인간 면역 세포 및 면역 종양 표적을 대상으로 하는 단백질 모듈 |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | 여러 인간 종양 유형 및 상피-중간엽 전이 마커를 대상으로 하는 단백질 모듈 |
| GeoMx 단백질 슬라이드 준비 FFPE | NanoString, 시애틀, 워싱턴 | 121300308 | GeoMX DSP 단백질 분석을 위한 시료 전처리 시약 |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 연락처 회사 | 완전 자동화된 IHC 염색기 |
| Master Kit--12 반응 | NanoString, Seattle, WA | 100052 nCounter 분석 시스템과 함께 사용하기 위한 재료 및 시약 | |
| nCounter 분석 시스템 | NanoString, Seattle, WA | 연락처 회사 | 다중 표적 발현 정량화를 위한 자동화 시스템(GeoMx DSP와 함께 사용) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | 조직 마이크로어레이 블록을 생성하기 위해 |
참고문헌
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white ....
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