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방법 논문

개선된 신장 탈신경은 안지오텐신 II 주입으로 유발된 고혈압을 완화했습니다.

4.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63719

⸱

2022년 5월 26일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 안지오텐신 II 주입으로 유도 된 고혈압이있는 마우스에서 신장 교감 신경 탈신경 (RDN)에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 반복 가능하고 편리하며 고혈압 및 심장 비대에 대한 RDN의 조절 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

초록

혈압에 대한 신장 교감 신경 탈신경 (RDN)의 이점은 최근 몇 년 동안 많은 임상 시험에서 입증되었습니다. 그러나 고혈압에 대한 RDN의 조절 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 따라서 마우스에서 더 간단한 RDN 모델을 설정하는 것이 필수적입니다. 이 연구에서는 안지오텐신 II로 채워진 삼투압 미니 펌프를 14주 된 C57BL/6 마우스에 이식했습니다. 미니 삼투압 펌프를 이식 한 지 1 주일 후, 페놀을 사용하여 마우스의 양측 신장 동맥에서 수정 된 RDN 절차를 수행했습니다. 연령-성별 일치 마우스에 식염수를 투여하고 가짜 그룹으로 봉사했습니다. 혈압은 기준선에서 측정되었고 이후 21일 동안 매주 측정되었습니다. 그런 다음 신장 동맥, 복부 대동맥 및 심장을 H & E 및 Masson 염색을 사용하여 조직 검사를 위해 수집했습니다. 이 연구에서는 고혈압을 조절하고 심장 비대를 완화할 수 있는 간단하고 실용적이며 반복 가능하고 표준화된 RDN 모델을 제시합니다. 이 기술은 신장 동맥 손상없이 말초 신장 교감 신경을 제거 할 수 있습니다. 이전 모델과 비교하여 수정 된 RDN은 고혈압의 병리 생물학 및 병태 생리학에 대한 연구를 용이하게합니다.

서론

고혈압은 전 세계적으로 주요 만성 심혈관 질환입니다. 조절되지 않는 고혈압은 표적 장기를 손상시키고 심부전, 뇌졸중 및 만성 신장 질환에 기여할 수 있습니다 1,2,3. 고혈압의 유병률은 중국에서 1991 년과 2007 년 사이에 20 %에서 31 %로 증가했습니다. 중국의 고혈압 성인 수는 최근 고혈압 진단 기준(130/80mmHg)이 개정됨에 따라 두 배가 될 수 있습니다.4. 고혈압은 약으로 조절할 수 있지만, 환자의 약 20 %는 최대 내약으로 적어도 3 개의 항 고혈압제 (이뇨제 1 개 포함)를 투여 받아도 고혈압을 조절할 수 없어 약물 내성 고혈압이 발생할 수 있습니다5.

신장 교감 신경 탈신경(RDN)은 고혈압에 대한 잠재적인 치료법으로 입증되었습니다. 2009 년 Krum과 동료들은 RDN을 처음으로 사용한 저항성 고혈압 치료를보고했습니다. 경피적 신장 동맥 절제술은 환자의 지속적인 혈압 강하를 효과적으로 유발할 수 있음이 밝혀졌습니다6. 그러나 Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) 시험의 실패는 RDN7의 적용을 방해하여 RDN을 논란의 여지가있는 치료법으로 만들었습니다. 그럼에도 불구하고 RDN의 전망은 아직 배제되지 않았습니다. RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED 및 SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal을 포함한 최근 임상 시험에서 고혈압 8,9,10,11,12에 대한 RDN의 효능이 확인되었습니다. 따라서 RDN의 효과를 탐구하기 위해보다 상세한 기계 론적 연구가 수행되어야합니다.

이 연구의 전반적인 목적은 마우스의 RDN이 어떻게 변형되어 더 간단하고 안정적인 수술을 생성 할 수 있는지 입증하는 것입니다. 많은 실험이 혈관 내 냉동 절제술, 체외 초음파 및 다른 동물 모델에서 화학 물질 또는 신경독의 국소 적용과 같은 RDN의 다양한 접근법을 연구했습니다 13,14,15,16,17. 페놀을 사용한 화학적 제거를 사용하여 생성 된 RDN 모델은 고혈압에 대한 교감 신경 활성화의 발병 기전을 연구하기위한 잘 정립 된 실험 모델입니다. 이 모델은 면봉18을 사용하여 10 % 페놀 / 에탄올 용액으로 신장 교감 신경의 화학적 부식에 의해 생성됩니다. 한편으로, 종래의 RDN은 잠재적으로 신장 교감 신경 활성을 억제하여 레닌 분비 및 나트륨 재 흡수를 감소시키고 신장 혈류를 증가시킨다. 한편, 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템19를 억제합니다. 따라서 RDN은 고혈압에 유익한 효과가 있습니다. 그러나 화학적 절제 생성 RDN 모델에는 절제 기준과 절제 시간이 부족하고 실험 절차의 세부 사항은 아직 명확하지 않습니다. 또한 사용 가능한 기술 보고서가 없습니다. 이 보고서에서는 C57BL/6 마우스에서 안지오텐신 II(Ang II) 유도 고혈압에서 계량 논문을 사용하여 페놀을 사용한 RDN 모델 생성을 위한 수술 프로토콜을 설명합니다. 우리는 페놀이 함유 된 칭량지로 신장 동맥을 감싸고 절제 시간을 통합하여 재현 가능하고 신뢰할 수있는 RDN 모델을 수립하는 데 도움이됩니다. 이 실험 모델은 고혈압에 대한 RDN의 효과를 평가하는 것을 목표로합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 관련 윤리 가이드 (NIH 간행물 번호 85-23, 2011 년 개정)를 준수했으며 푸단 대학 산하 화동 병원 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다. 14주령의 수컷 C57BL/6 마우스(28-30g)를 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다: 가짜 그룹, Sham+Ang II 그룹, RDN 그룹, RDN+Ang II 그룹, 각 그룹에서 n=6. 모든 동물은 24 ± 1 ° C의 온도 조절 실에서 12 시간의 명암 주기와 표준 설치류 차우 및 물 adlibitum에 대한 자유로운 접근으로 특정 폐쇄 된 병원체가없는 조건에서 유지되었습니다.

1. 작업 분야의 준비

  1. 수술 테이블을 70 % 에탄올로 소독하십시오. 가열 패드 온도를 37 ° C로 조정합니다.
  2. 수술 전에 모든 수술 기구를 121°C에서 30분 동안 또는 다른 방법으로 멸균했는지 확인하십시오. 이 절차에는 마이크로 수술 용 가위, 두 개의 미세한 직선 집게, 두 개의 미세한 곡선 집게, 지혈 집게, 멸균 거즈 및 계량 용지가 필요합니다.

2. 안지오텐신 II 유발 고혈압

  1. 마취 유도 직전에 C57BL/6 마우스에 멜록시캄(0.5mg/kg, SC)을 제공합니다. 이어서, 앞서 기술한 바와 같이 나트륨 펜토바르비탈 주사를 사용하여 마우스를 마취시킨다20,21. 이소플루란은 또한 바람직한 경우에 사용될 수 있다. 부정적인 발가락 핀치 반사로 마취 깊이를 확인하십시오.
  2. 면도기로 뒷면의 머리카락을 제거하십시오. 마취 중 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
  3. 동물을 등 지느러미 위치의 수술대 위에 놓습니다. 면도한 부위를 포비돈-요오드로 닦고 닦은 다음 70% 에탄올로 세 번 닦습니다.
  4. 앞다리의 견갑골 위의 귀 뒤에 꼬리에 수직 인 멸균 메스 블레이드를 사용하여 1cm 절개를하십시오.
  5. 멸균 지혈제를 사용하여 피부 아래에 피하 터널을 만들고 펌프(22)를 위한 포켓을 생성한다. 안지오텐신 II(1,000ng/kg/min)로 채워진 삼투압 펌프를 주머니에 부드럽게 삽입합니다. 피부를 스트레칭하지 않고 상처를 봉합 할 수있는 충분한 여유 공간이 있는지 확인하십시오.
  6. 중단 된 6-0 Vicryl 봉합사로 근육을 봉합하고 중단 된 4-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다. 면봉으로 상처 부위를 포비돈 요오드로 닦으십시오. 대조군에 대해 동일한 양의 식염수로 동일한 수술을 수행하십시오.
  7. 모든 수술 도구를 멸균기에 10초 동안 넣고 수술 사이에 멸균 장갑을 교체합니다. 완전히 회복 될 때까지 모든 마우스를 모니터링하십시오.
  8. 첫 주에는 적어도 하루에 두 번, 이후 매일 한 번(발적, 부기 및 감염을 포함하여) 생쥐의 상처 치유를 면밀히 모니터링하고 관찰합니다. Ang II 주입 중에 마우스가 사망하면 즉시 해부를 수행하십시오.
  9. 기준선에서 혈압을 측정하고 의식이있는 마우스에서 꼬리 커프 혈량 측정 방법23으로 Ang II 주입 후 매주 혈압을 측정합니다. 혈압 측정 실험이 실험이 시작되기 전에 마우스가 1시간 동안 순응하는 22 ± 2°C의 조용한 지역에서 수행되는지 확인하십시오. 기준 혈압 측정 전에 적어도 5 일 연속 마우스를 습관화하십시오23,24.

3. 양측 신장 탈모

  1. Ang II 주입 후 1 주일 후에 혈압 상승 (BP) ≥140 / 90mmHg 또는 수축기 혈압 / 이완기 혈압이 25 % 증가한 마우스를 선택하십시오.
  2. 수술 전에 동물의 체중을 기록하고 신장 탈모 수술을 위해 최소 체중이 24g 인 동물을 선택하십시오.
  3. 펜토 바르 비탈 나트륨을 사용하여 마우스를 마취하십시오. 부정적인 발가락 핀치 반사로 마취 깊이를 확인하십시오.
  4. 면도기로 복부의 머리카락을 제거하십시오. 외과 적 오염을 피하기 위해이 절차를 신중하고 철저하게 수행하십시오.
  5. 마우스를 수술대에 놓고 복부를 위로 유지하고 팔다리를 테이프로 고정하십시오. 포비돈 요오드로 복부 피부를 소독 한 다음 70 % 에탄올로 3 회 닦으십시오.
  6. 메스 블레이드를 사용하여 2cm 복부 정중선 복부 절개를하십시오. 37°C 식염수에 적신 거즈로 장을 뒤로 당겨 왼쪽 신장 동맥을 노출시킵니다. 구부러진 핀셋을 사용하여 신장 동맥에서 지방을 조심스럽게 그러나 무뚝뚝하게 해부하십시오. (그림 1A-C).
  7. 멸균 된 날카로운 가위로 신장 동맥과 같은 크기의 직사각형으로 계량 용지를 자릅니다. 참고로 칭량 용지를 그림 1C의 점선과 동일한 크기로 자릅니다.
    알림: 그것은 수술의 중요한 부분이므로 동일한 모양을 유지하기 위해 한 번에 여러 장의 칭량 용지를 자르십시오.
  8. 칭량 용지를 10% 페놀/에탄올 용액에 최소 30초 동안 담그십시오. 왼쪽 신장 동맥의 표면을 덮고 칭량 종이로 혈관을 감싸고 2 분 동안 유지하십시오 (그림 1D). 거즈를 사용하여 주변 조직을 보호하여 칭량지가 주변 신장과 장에 닿지 않도록 하십시오.
    알림: 페놀 용액은 플라스틱 튜브에서는 안정적이지만 유리 바이알에서는 안정하지 않습니다. 따라서, 용액은 모든 실험(18)에 대해 신선하게 준비되어야 한다.
  9. 오른쪽 신장 동맥에 대해 동일한 절차를 수행하십시오. 식염수에 적신 칭량 용지로 가짜 수술을 수행하십시오.
  10. 근육을 초기 위치로 재배치하고 중단 된 봉합사에서 6-0 Vicryl 봉합사로 복막을 닫습니다. 그런 다음 중단 된 4-0 나일론 봉합사로 피부를 닫으십시오. 완전히 회복 될 때까지 모든 마우스를 모니터링하십시오.

4. 수술 후 관리

  1. 절개 부위에 포비돈 요오드를 바르고 회복 및 수술 후 모니터링을 위해 동물을 따뜻하게 전기 담요에 넣으십시오.
  2. 하루에 두 번 마우스를 모니터링하여 발적, 부기, 통증 또는 복부 감염을 평가합니다. RDN 절차 약 1 시간 전과 24 시간 후에 모든 마우스에 멜 록시 캄 (0.5 mg / kg, SC)을 제공하십시오.

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결과

통계
모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 일원 분산 분석은 3 개 이상의 조건을 가진 실험에 사용되었으며 개별 그룹 간의 비교를위한 Bonferroni 사후 테스트가 뒤 따랐습니다. 0.05보다 작거나 같은 p-값을 유의한 것으로 간주합니다. 상용 소프트웨어는 모든 통계 분석을 수행하는 데 사용되었습니다.

Ang II에 의해 유도 된 혈압의 증가는 RDN 후에 약화되었습니다.
수축기 혈압 (SBP)의 유의 한 증가는 Ang II 주입 후 1 주일에 관찰되었다. RDN + Ang II 그룹은 RDN 절차 후 21 일에 Sham + Ang II 그룹과 비교할 때 SBP에서 상당한 감소를 보였다 (143.50 ± 5.43 대 196.67 ± 14.26 mmHg, p < 0.01). RDN 후 2주에 Sham 그룹과 RDN 그룹 간에 차이가 없었습니다(113.33 ± 9.35 대 113.17 ± 8.47m...

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토론

RDN이 혈압을 낮출 수 있는지 여부는 symplicity HTN-3 시험 7,25의 부정적인 결과가 발표 된 이후 논란이되고있다. 그러나, 다수의 임상 시험 및 동물 실험은 고혈압 인간 및 동물 9,10,11,12,13,14,15,16,17에 대한 RDN의 긍정적이고 효과적인 결과를 입증하였다.

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공개 사항

저자가 선언 한 재정적 또는 기타 이해 상충은 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81770420), 상하이시 과학 기술위원회 (20140900600), 상하이 임상 노인 의학 핵심 연구소 (13dz2260700), 상하이 시립 핵심 임상 전문 (shslczdzk02801) 및 노인 관상 동맥 질환 센터, 푸단 대학 부속 화동 병원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Angiotensin IISangon BiotechCAS : 4474-91-3고혈압 animol 모델을 만들기 위해
안티 티로신 하이드록실라제 항체Abcamab137869신장 신경의 TH 발현을 평가하기 위해
혈압 분석Visitech SystemsBP-2000마우스의 혈압 측정
미니 삼투압 펌프DURECT CorporationCA 95014안지오텐신 II
노르에피네프린 ELISA 키트Abcamab287789신장 노르에피네프린 수치를 측정하기 위해
페놀Sangon BiotechCAS : 108-95-2신장 교감 신경 손상
량 종이Sangon BiotechF512112페놀로 담근 종이로 신장 신경을 파괴하기 위해; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. 
를 채우려면 계

참고문헌

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