인간 탯줄 조직에서 중간엽 줄기 세포의 생성과 골격근 계보로의 분화

인간 탯줄은 강력한 증식 및 분화 속도, 면역 조절 특성 및 세 배아층 모두에서 세포를 생성하는 능력으로 인해 재생 요법을 위해 현재 탐구되고있는 중간엽 줄기 세포의 견고한 저장소를 보유하고있는 것으로 인정 받고 있습니다¹. 탯줄 조직은 탯줄 혈, 탯줄 정맥 내피 및 와튼 젤리 (WJ)와 같은 여러 구획으로 구성되며, 그 자체로 혈관 주위 영역, 혈관 간 영역 및 양막 하부 또는 코드 라이닝 (CL)²의 세 가지 불분명 한 영역을 포함합니다. uMSCs가 이러한 모든 상이한 영역으로부터 단리되고 주요 MSC 마커를 광범위하게 발현할 수 있지만, 이들 구획이 uMSCs의 동일한 집단을 포함하는지 또는 그들의 분화 효능에서 차이를 나타내는지에 대한 명확성은 없다³. 따라서 uMSC의 분리를 위한 프로토콜은 격리 모드 및 영역에서 더 높은 정밀도, 차별화 전위의 강력한 특성화, 그리고 마지막으로 코드의 다른 구획으로부터의 비교 분석이 필요합니다.

이러한 맥락에서, 탯줄의 다른 부분 사이의 uMSC 증식 및 분화 잠재력의 차이를 입증 한 연구는 거의 없습니다. 이들 중, CL 및 WJ 영역으로부터 분리된 uMSCs 사이의 비교 분석은 CL 유래 uMSCs ^3,4에서 더 큰 증식 가능성을 나타냈다. 별도의 연구에서, WJ 유래 uMSCs는 혈관주위 세포 (HUCPV)⁵에 비해 증식 분석에서 더 잘 수행되었다. 혈관 오염이 없는 제대혈 유래 uMSCs와 탯줄 조직 유래 uMSCs 사이의 차이를 조사함에 있어서, 주요 MSC 마커의 차등적 발현은 두 구획 사이에서 보고되었고, 탯줄 조직 유래 uMSCs⁶에서 증식 속도 증가가 보고되었다.

uMSCs의 분화 가능성을 주로 골형성, 지방형성 및 연골 혈통과 같은 중배엽 혈통의 조직으로 조사하는 여러 연구 중 극소수만이 근인성 분화 및 후속 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 다양한 탯줄 구획 간의 비교 분석을 제공했습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 강력한 근육 분화 프로토콜을 개발하여 탯줄 조직 유래 uMSC가 제대혈⁶에 비해 우수한 근형성 분화 능력을 나타낸다는 것을 관찰했다. 여기서, 단계적 프로토콜은 혈관구조와 관련된 세포가 결여된 전체 탯줄 조직으로부터 uMSCs의 단리, 이들의 특성화, 및 근인성 계보로의 이들의 분화에 대해 상세히 기술되어 있다.

이 연구에서 탯줄 조직의 사용은 줄기 세포 연구 기관위원회 (IC-SCR), 기관 윤리위원회, 번역 건강 과학 기술 연구소 (IEC-THSTI), 민간 병원의 기관 윤리위원회, Gurugram, Haryana 및 기관 생물 안전위원회, THSTI에 의해 승인되었습니다. 인간 탯줄 조직 샘플은 출생시의 용어 전달로부터 수확되었다. 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 탯줄 조직으로부터 MSC의 분리

1. 분만시, 탯줄 5cm 이상, 바람직하게는 태반에 더 가깝게 자르고 70 % 에탄올로 외부 표면을 면도하여 코드를 살균하십시오. 탯줄 조직 조각을 인산염 완충 식염수(PBS)를 함유하는 하나의 50 mL 수집 튜브로부터 이를 함유하는 다른 50 mL 수집 튜브로 순차적으로 옮긴다. 얼음 위에 피사체의 이름이 새겨진 수집 튜브를 1 시간 이내에 실험실로 운반하십시오.
   참고: 더 큰 연구의 경우, 연구 전반에 걸쳐 샘플을 추적할 수 있도록 바코드를 작성하는 것이 유용할 수 있습니다. 중요한 것은 인간 조직을 다루는 모든 인원에게 B 형 간염 백신의 완전한 처방을 제공해야한다는 것입니다.
2. 실험실에서는 사용하기 전에 BSL-2 후드에서 25분 동안 UV를 켜서 오토클레이브 기기와 피펫을 멸균합니다.
3. 탯줄 조직 조각을 수집 튜브에서 5 g/L 글루코스, 50 μg/mL 겐타마이신,^2.5 μg/mL 암포테리신 B, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 풍부한 PBS를 함유하는 10 cm2 조직 배양 처리 접시로 옮깁니다( 그림 1의 개략도).
4. 메스를 사용하여 탯줄 조직을 세로 축을 따라 수직으로 슬라이스하여 두 개의 반 원통형 조각을 얻습니다. 코드 비틀림과 점액 표면으로 인해 다른 손에 한 쌍의 포셉으로 조직을 고정하십시오.
5. 이 시점에서 탯줄 동맥과 정맥을 관찰하고 메스를 사용하여 혈관을 제거하여 표면에서 한 방향으로 긁어냅니다. 탯줄 조직을 PBS로 다시 한번 헹구어 조직과 관련된 모든 잔류 혈액을 제거한다. 혈관을 둘러싸고 있는 WJ에서 세포의 무결성을 보존하기 위해 스크래핑이 부드럽도록 하십시오.
6. 탯줄 조직의 각 절반을 0.5cm³ 크기의 조각으로 다듬고 발광 표면이 접시 위에 아래로 향하게하는 조각을 놓습니다. 접시를 5%_CO2를 함유하는 37°C 가습된 챔버에서 10분 동안 간략하게 인큐베이션한다.
7. 인큐베이션 후, 탯줄 조직 조각이 들어있는 접시에 L-글루타민, 리보 및 데옥시리보뉴클레오시드가 없는 MEM 알파 변형, 15% 소 태아 혈청(열 불활성화되지 않음) 및 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 배지 20mL를 플러시합니다. 조직 외식편이 그들의 배향에서 벗어나는 것을 방지하기 위해 측면을 따라 부드럽게 성장 배지를 첨가하십시오. 인큐베이션 동안 조직 외식편에 의해 흡수될 분획을 설명하기 위해 과량의 배지를 첨가한다.
8. 배양 3일 후, 배양물에 신선한 배지를 첨가한다. 접시를 다루는 동안 문화가 충격과 외식의 움직임으로부터 보호되도록하십시오.
9. 1 주 후, 멸균 포셉을 사용하여 조직 파편을 개별적으로 제거하고 폐기를 위해 적절한 생체 위험 백을 사용하여 폐기하십시오. 기존 배지를 유지하고 10mL의 신선한 성장 배지를 첨가한다. 개별 콜로니가 70%의 합류점에 도달할 때까지 4일마다 성장 배지를 교체한다.
   참고 : 시간이 지남에 따라 합류를 모니터링해야하는 개별 증식 콜로니가있을 것이므로 세포가 접시 전체에 균일하게 분포되지 않을 가능성이 큽니다. 일반적으로 한 달 안에 10cm² 접시는 별도의 접시로 분할하기에 충분한 세포를 생성합니다.
10. 트립신 / EDTA 용액 (행크스 밸런스 솔트 솔루션 [HBSS]의 1x 0.25 % 트립신 및 0.02 % EDTA)을 사용하여 부착성 세포를 수확하십시오. 세포 현탁액을 470 × g 에서 25°C에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 성장 배지에 재현탁시킨다.

2. uMSCS의 면역 표현 및 전파

1. 부착 세포가 50 % -60 % 합류에 도달하고 잘 퍼지면 면역 표현형으로 진행하십시오. 완전히 합류한 배양물에 대해 MSC 마커 분석을 수행하지 마십시오, 이는 주요 MSC 마커의 하향조절을 야기하는 경향이 있기 때문입니다.
2. 트립신화 후, FACS 튜브 (1 × 10⁵ 세포 / 튜브)에 1 × 10⁶ 세포 / mL의 세포 현탁액을 분배하고 적절한 형광단 결합 항체 (모든 1:50 희석)로 염색하십시오 : 염색되지 않은; CD105+CD90; CD105+CD73; CD105; CD90; CD73; CD34+ CD45 (일반적인 형광단); 각 형광단에 대한 이소타입 조절. 추가 분석을 위해 유세포 분석기에 적어도 10,000 건의 총 사건 수를 기록하십시오.
   참고: 셀은 각 표면 마커에 대해 개별적으로 분석되므로 셀 하위 집합에 대한 게이팅이 필요하지 않습니다.
3. 상기 마커 이외에, 개별 탯줄 조직 샘플로부터 생성된 uMSC 라인에서 양성 및 음성 표면 마커의 존재를 확인하였다(표 1).
4. 유세포 분석기에 의해 표지된 세포를 분석하고 CD105⁺CD90+ 및 CD105⁺CD73⁺ 세포의 백분율을 결정한다. CD105⁺ 및 CD34-CD45^- 세포를 개별적으로 분석한다.

3. uMSC를 골격근으로 분화

1. PBS 중 0.01% 콜라겐 및 20 μg/mL 라미닌으로 조직 배양 플레이트를 코팅합니다. 이 플레이트를 실온에서 최소 4 시간 동안 코팅하십시오.
2. 성장 배지에서 10,000 세포/^cm2 의 밀도로 uMSCs를 플레이트화한다.
3. 세포가 70% 합류하면, 성장 배지를 흡인하고 배양물을 PBS로 2x 헹구었다. uMSCs에 DMEM + 5% 말 혈청 + 0.1 μM 덱사메타손 + 50 μM 하이드로코르티손을 포함하는 근인성 분화 배지 (M1)를 첨가한다. 근인성 진행의 동역학을 결정하기 위해, 배양물에 격일로 M1 배지를 첨가하십시오.
4. 근인성 진행의 동역학을 결정하기 위해, 각각 2일, 4-5일, 6-7일 및 10-14일에서 Pax7, MyoD, Myogenin 및 MyHC 발현에 대한 uMSCs를 분석한다.

탯줄 조직에서 uMSCs의 분리의 성공은 전체 제대혈에서 성공의 가난한 비율과 달리 >95 %입니다. uMSCs의 성공적인 단리시, FACS 분석은 모든 세포가 CD34-CD45-CD105+CD90+임을 밝혀내었다. 그러나, 비교 분석에서, 제대혈로부터 분리된 uMSCs는 이종 집단을 표시하며, 여기서 세포의 비율은 CD34+CD45+CD105+(~15%)를 나타낸다. 추가적으로, 이중 양성 CD105+CD90+는 수가 적다(~5%)(보충 그림 S1). 이것은 제대혈로부터 uMSC들 사이에서 감소된 수준의 근인성 분화를 초래하는데, 이는 CD105 및 CD90 발현 둘 모두가 근형성의 유도를 위해 요구되기 때문이다. uMSCs는 또한 표 1에 열거된 마커의 발현을 표시한다. 제대혈 유래 uMSCs의 오염이 있는 경우에, CD34+CD45+ 세포의 존재도 있을 것이다. 이로 인해 근인성 분화를 위한 도금에 대한 잘못된 세포 카운트가 발생합니다. 세포의 >90%가 CD105 및 CD90 발현에 대해 이중 양성이라는 표시는 CD105 및 CD90 발현이 분화시 하향 조절되기 때문에 uMSCs가 어떠한 중배엽 혈통에도 전념하지 않고 다분화능을 계속 유지한다는 것이다. 단일 확정적 uMSC 마커가 없기 때문에 uMSC 표현형의 확인을 위해 여러 마커를 사용하는 것이 필수적입니다. 이 분석에서, 우리는 실험실에서 확립된 각각의 uMSC 라인에 대해 표 1에 열거된 모든 마커의 존재를 평가하였다. 추가적으로, 우리는 CD105 및 CD90 (도 2A), 뿐만 아니라 CD105 및 CD73 (도 2B)의 이중 양성 상태를 결정하여, uMSCs가 다수의 키 마커를 발현하는지 확인하였다. 이것은 0.05 % 미만의 숫자로 존재하는 단일 양성 세포를 오염시키는 것을 피하기 위해 필요합니다.

그림 1: 탯줄 조직으로부터 uMSCs의 단계적 분리 및 특성화를 보여주는 개략도. 약어 : uMSCs = 인간 탯줄 조직의 중간엽 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 탯줄 조직 유래 uMSCs에서의 MSC 마커 분석 . (A) uMSCs는 CD105 및 CD90의 발현을 표시하고 조혈 마커, CD34 및 CD45를 발현하지 않는다. 세 개의 uMSC 라인(UCT15, UCT18, 및 UCT26)의 대표적인 FACS 플롯이 도시되어 있다(N=16). 패널의 상단 행은 Q2 사분면의 세 uMSC 라인 모두에서 CD105 및 CD90 발현에 대해 양성인 세포를 보여준다. 패널의 하단 행은 Q1 사분면의 세포를 CD105 발현에 대해 양성이고 CD34 및 CD45 발현에 대해 음성으로 보여준다. (b) uMSCs는 MSC 마커인 CD73(N=16)의 발현을 표시한다. 약어 : uMSCs = 인간 탯줄 조직의 중간엽 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: uMSCs에 대한 양성 및 음성 마커의 목록. 약어 : uMSCs = 인간 탯줄 조직의 중간엽 줄기 세포.

uMSCs를 근인성 혈통으로 분화시키기 위해, uMSCs는 전형적으로 M1의 첨가 후 처음 2일 이내에 전구체 세포에 대한 마커인 Pax7을 발현하고, 이어서 M1 첨가 후 처음 4일 이내에 MyoD를 발현한다(도 3). 분화 6일째에, 세포는 미오게닌 단백질을 발현하고, 이어서 분화 유도의 10일에서 14일 사이에 Myosin 중쇄(MyHC)를 발현시킨다. 우리는 RNA 시퀀싱, 유세포 분석, 면역 세포 화학, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 근형성 마커의 단계적 발현을 문서화하여 이 프로토콜의 견고성을 확인하는 근인성 발현의 동역학을 보다 자세히 특성화했습니다. 골격근으로 분화되었던 미분화된 uMSCs와 uMSCs 사이의 전체 게놈 전사체 시퀀싱은 근인성 분화의 유도에 반응하여 907개의 유전자의 상향조절을 밝혀냈다(도 4).

도 3: uMSCs를 골격근으로 분화. uMSCs를 M1 배지에서 2일, 4일, 7일 및 10일 동안 배양하고, (A) Pax7 2일 후, (B) MyoD 4일 후, (C) 7일 후 T8, T12, T14, 및 T25로 표기된 상이한 uMSC 라인으로부터의 미오게닌 발현, 및 (D) 10일 후 MyHC에 대해 평가하였다. 스케일 바 = (B, D) 50 μm. 약어: uMSCs = 인간 탯줄 조직으로부터의 중간엽 줄기 세포; GAPDH = 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소; MyoD = 근원세포 결정 단백질 1; MyHC = 미오신 중쇄; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; Mb = 근모세포; MT = 미오튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 골격근으로 분화된 제대혈 및 제대조직으로부터 유래된 uMSCs의 비교 전사체 프로파일링. 대조군 uMSCs와 uMSCs 사이의 907 유전자의 정규화 된 카운트의 히트 맵은 제대혈 및 제대혈 조직으로부터 7 일 동안 골격근으로 분화되었다. Venn 다이어그램 (왼쪽)은 제대혈 유래 uMSCs에 비해 탯줄 조직 유래 uMSCs에서 상향조절된 더 많은 수의 근인성 유전자를 보여준다. 아래의 표는 제대조직 및 제대혈 둘 다에서 상향조절되는 일반적인 근인성 유전자를 나타낸다. 이 수치는 Mishra et al.6에서 나온 것입니다. 약어: 1, 2 = 생물학적 반복실험; CB1,2 = 제대혈의 uMSCs로부터 유래된 근형성 세포; CT1, 2 = 탯줄 조직의 uMSCs로부터 유래된 근형성 세포; coB1,2 = 제대혈로부터 미분화된 uMSCs를 조절하고; coT1, 2 = 탯줄 조직으로부터 미분화된 uMSCs를 조절한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비교 분석을 수행하기 위해 제대혈과 제대혈 조직에서 분리 된 uMSC를 비교했습니다. RNA 시퀀싱 데이터는 제대혈에서 유래된 것보다 탯줄 조직 유래 근인성 세포로부터 uMSCs에서 상향조절된 근인성 유전자가 더 많다는 것을 밝혀냈다(도 4). 이 연구를 지원하기 위해 사용된 RNA 시퀀싱 데이터는 NCBI에 업로드된다(SRA 수탁은 GSE147114이다). 간략하게, PANTHER GO-slim 데이터베이스를 이용한 조직특이적 전사체 분석은 액틴 결합 및 사르코머 조립과 관련된 세포골격 단백질(TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) 수축 기능과 관련된 수송체(RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), 근육 질량 유지( FBXO32, TRIM16L, GHR), 칼슘 신호전달(FKBP5) 및 효소 기능(COX7A1, PDK4)(그림 4). 전체적으로, 이들 데이터는 탯줄 조직 유래 uMSC가 강력한 근형성 잠재력을 나타내는 구획을 나타낸다는 것을 입증한다.

격리의 효율성, uMSC 구획 내의 이질성, 어머니의 나이 및 영양 수준을 포함한 어머니의 건강 상태에서 발생할 수있는 uMSC 라인 간의 개별적인 변화로 인해 확립 된 uMSC 라인 간의 증식 속도와 근형성 잠재력의 차이가있을 수 있습니다. 그러나, 발현의 동역학의 차이에도 불구하고, 근원성 마커의 단계적 발현과 함께 근원성을 증가시키는 전반적인 경향은 유지된다.

보충 도표 S1: 제대혈 유래 uMSCs에서의 MSC 마커 분석. uMSCs는 CD105 및 조혈 마커, CD34 및 CD45의 발현을 표시한다. CD105+ 집단의 분석은 이들 세포의 단지 작은 비율만이 CD90을 공동발현한다는 것을 보여준다 (N=5). 약어 : uMSCs = 인간 탯줄 조직의 중간엽 줄기 세포. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.