앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.
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이 논문에서
요약
초록
형광 및 기계화학적 원리에 기반한 단일 분자 기술은 생물학적 감지에서 우수한 감도를 제공합니다. 그러나 높은 처리량 기능이 없기 때문에 이러한 기술의 적용은 생물 물리학에서 제한적입니다. 앙상블 힘 분광법(EFS)은 개별 분자의 기계화학적 연구를 분자 앙상블의 연구로 변환하여 방대한 분자 구조 세트의 조사에서 높은 처리량을 입증했습니다. 이 프로토콜에서 DNA 2차 구조(i-모티프)는 최대 77796/s의 전단 속도로 균질화기 팁의 회전자와 고정자 사이의 전단 흐름에서 펼쳐졌습니다. 유속과 분자 크기가 i-모티프가 경험하는 전단력에 미치는 영향이 입증되었습니다. EFS 기술은 또한 DNA i- 모티프와 리간드 사이의 결합 친화도를 밝혀 냈습니다. 또한, 우리는 전단력(즉, 기계-클릭 화학)에 의해 작동될 수 있는 클릭 화학 반응을 시연했습니다. 이러한 결과는 분자 구조의 형태를 제어하기 위해 전단력을 사용하는 효과를 입증합니다.
서론
단일 분자 힘 분광법1(SMFS)에서 개별 분자 구조의 기계적 특성은 원자력 현미경, 광학 핀셋 및 자기 핀셋 2,3,4와 같은 정교한 도구에 의해 연구되었습니다. 힘 생성/검출 설정에서 분자의 동일한 방향성 요구 사항 또는 자기 핀셋 및 소형 원심분리기 힘 현미경(MCF)5,6,7,8의 작은 시야로 인해 제한되므로 SMFS를 사용하여 제한된 수의 분자만 동시에 조사할 수 있습니다. SMFS의 낮은 처리량은 많은 분자 세트의 개입을 필요로하는 분자 인식 분야에서의 광범위한 적용을 방해합니다.
전단 흐름은 거대한 분자 세트에 힘을 가하는 잠재적 솔루션을 제공합니다9. 채널 내부의 액체 흐름에서, 채널 표면에 가까울수록, 유량(10
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프로토콜
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 완충액과 화학 시약은 표 재료에 나열되어 있습니다.
1. 전단력 현미경의 제조
참고: 전단력 현미경은 반응 장치(균질화기)와 검출 장치(형광 현미경)의 두 부분으로 구성됩니다. 접안 렌즈의 배율은 10 배이고 대물 렌즈 (공기)의 배율은 4 배입니다.
- 균질화기와 현미경을 장착 테이블에 조립합니다. 고글을 착용하고 형광 현미경을 켠 다음 균질화를 조정하여 적절한 파장(여기서는 488nm가 사용됨)의 여기 광선이 균질화기의 분산 팁 중심을 통과하는지 확인합니다.
- 높이가 5cm이고 단면적이 1.5cm2 x 1.5cm2인 평평한 바닥 반응 챔버를 준비합니다. 배경을 줄이려면 선택한 챔버 재료가 유리와 같이 형광을 발하지 않는지 확인하십시오 (일부 플라스틱에는 형광이 있음).
- 원하는 전단력을 제공할 수 있는 적절한 균질화기 분산 팁을 선택하십시오.
참고: 전단 속도는 다음 방정식에 따라 고정 회전 속도11 에서 회전자와 고정자 사이의 거리에 따라 달라집니다.
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결과
그림 1은 EFS에서 앙상블 분자의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 간략하게 설명합니다. 도 1B에서, i-모티프 DNA의 형광 강도는 pH 5.5 MES 완충액에서 9,724 s-1 내지 97,245 s-1 범위의 전단 속도에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. 대조군으로서, 동일한 i-모티프 DNA를 pH 7.4 MES 완충액에서 63,209 s-1의 속도로 전단했을 때 형광 강도는 증가하지 않았다. 이는 i-모티프가 pH 7.414에서 접히지 않기 때문이다. 이전 연구에서 우리는 전단 속도가 높을수록 i- 모티프11의 전개가 더 많다는 것을 발견했습니다. 광학 핀셋(11)에서 i-모티프의 전개에 기초하여, 우리.......
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토론
이 원고에 설명 된 프로토콜을 사용하면 전단력에 의한 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 전개를 실시간으로 조사 할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 DNA i- 모티프 구조가 전단력에 의해 펼쳐질 수 있음을 강조합니다. 리간드 결합 i-모티프의 풀림과 전단력 작동 클릭 반응은 이 앙상블 힘 분광법의 개념 증명 응용 분야였습니다.
그림 1 은 기기 설정을 보여줍니다. 균질화기 발생기 팁과 반응 챔버는 서로 접촉해서는 안 되며, 이는 기포 형성 없이 회전자와 고정자 사이의 안정적인 전단 흐름을 허용하는 데 중요합니다. 상업용 균질화기 팁의 경우 기포 형성을 줄이기 위해 공기 구멍이 있는 팁을 선택하는 것이 좋습니다. 또한, 큰 챔버는 더 많은 샘플 용액을 필요로하기 때문에 반응 챔버의 크기가 너무 커서는 안됩니다. 반대로, 균질화기 팁의 본체를 덮기 위해 전단 챔버의 특정 높이가 필요합니다. 체계적인 오류를 줄이려면 모든 관련 실.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구 작업은 국립 과학 재단 [CBET-1904921] 및 국립 보건원 [NIH R01CA236350]의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 | azide Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ||
| 분산 팁 | 스위스 | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA 올리고 | IDT | ||
| 염료 | IDT | /5Cy5/ | |
| 형광 현미경 | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| 균질화기 | 스위스 | PT 3100D | |
| HPG | 산타크루즈 생명공학 | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| 담금질 | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | 도쿄 화학 공업 | T2993 | |
| 트리스 | VWR | VWRCE133-100G |
참고문헌
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al.
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