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Summary

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

Abstract

단백질성 섬유소 내포물은 다수의 신경 퇴행성 질환의 주요 병리학적 특징이다. 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 아밀로이드 베타 펩티드는 세포외 공간에서 프로토 피브릴을 형성하며, 이는 점차 성장하고 큰 아밀로이드 플라크로 성숙하는 씨앗 역할을합니다. 이러한 기본적인 이해에도 불구하고, 뇌의 아밀로이드 피브릴 구조, 조성 및 증착 패턴에 대한 현재의 지식은 제한적입니다. 한 가지 주요 장벽은 뇌 추출물에서 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리 할 수 없다는 것입니다. 친화성 정제 및 레이저 포획 미세해부-기반 접근법은 이전에 아밀로이드를 분리하기 위해 사용되어 왔지만 회수될 수 있는 소량의 물질에 의해 제한된다. 이 새롭고 강력한 프로토콜은 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 및 초음파처리를 통한 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 가용화를 사용하여 아밀로이드 플라크 코어의 생화학 적 정제를 설명하고 AD 환자 및 AD 모델 뇌 조직으로부터 고순도 피브릴을 산출합니다. 질량 분광법 (MS)-기반 정제된 물질의 상향식 프로테오믹 분석은 아밀로이드 피브릴의 거의 모든 일차 단백질 성분을 확인하기 위한 강력한 전략을 나타낸다. 아밀로이드 코로나에서 단백질에 대한 이전의 프로테오믹 연구는 예기치 않게 크고 기능적으로 다양한 단백질 모음을 밝혀 냈습니다. 주목할 만하게, 정제 전략을 정제한 후, 공동정제 단백질의 수가 10배 이상 감소하였고, 이는 단리된 SDS 불용성 물질의 고순도를 나타낸다. 음성 염색 및 면역-금 전자 현미경 검사는 이들 제제의 순도의 확인을 허용하였다. 이들 단백질을 아밀로이드 내포물로의 침착에 기여하는 공간적, 생물학적 특성을 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다. 종합하면,이 분석 전략은 아밀로이드 생물학에 대한 이해를 높이기 위해 좋은 위치에 있습니다.

Introduction

아밀로이드는 단백질의 다양한 패널에서 발견되는 매우 안정적인 초분자 배열이며, 그 중 일부는 병리학 적 변화를 일으 킵니다¹. 세포내 또는 세포외 아밀로이드 응집체의 축적은 몇몇 신경퇴^{행성 질환2}에서 관찰된다. 아밀로이드 응집체는 이질적이며 많은 수의 단백질 및 지질로 풍부합니다³. 최근 몇 년 동안, 아밀로이드 프로테옴에 대한 관심은 기초 및 번역 신경 과학자들 사이에서 상당한 관심을 불러 일으켰습니다. 마우스 및 사후 인간 뇌 조직에서 아밀로이드 응집체를 추출하고 정제하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 레이저-포획 미세해부, 면역침전, 탈세포화 및 아밀로이드 응집체의 생화학적 분리는 아밀로이드 플라크, 피브릴 및 올리고머 ^4,5,6,7을 추출하고 정제하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이러한 연구의 대부분은 반 정량적 MS를 사용하여 이러한 단단히 포장 된 피브릴라 침전물의 단백질 조성을 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 이용가능한 결과는 일관성이 없으며, 이전에 보고된 놀랍게도 많은 수의 공동-정제 단백질들은 해석하기 어렵다.

AD 및 AD 마우스 모델 뇌에서 아밀로이드 코어 프로테옴을 기술하는 기존 문헌의 주요 한계는 정제된 물질이 관리불가능한 수의 공동정제 단백질을 함유한다는 것이다. 이 방법의 전반적인 목표는 이러한 한계를 극복하고 아밀로이드 피브릴 코어를 분리하기위한 강력한 생화학 적 정제를 개발하는 것입니다. 이 전략은 사후 AD 인간 및 마우스 뇌 조직으로부터 SDS 불용성 농축 아밀로이드 분획을 단리하기 위해 이전에 기술된 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 기반 생화학적 방법을 이용한다^(8,9). 이 방법은 기존 문헌을 기반으로하지만 초음파 처리 및 SDS 세척을 통해 느슨하게 결합 된 아밀로이드 관련 단백질의 대부분을 제거하여 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리합니다 (그림 1). 이 프로토콜에 의해 정제 된 피브릴은 뇌 추출물에서 분리 된 아밀로이드 피브릴의 구조 연구에서 자주 발생하는 몇 가지 기존 문제를 극복합니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 이러한 피브릴의 시각화는 정제 된 물질의 무결성과 순도를 확인합니다 (그림 2). 이 연구에서, 분리된 피브릴은 트립신을 갖는 펩티드로 가용화되고 소화되고, 표지가 없는 MS 분석은 피브릴 코어를 형성하는 단백질의 동일성을 용이하게 밝힐 수 있다. 특히, 이들 단백질 중 일부는 비막 결합 소기관에서 초분자 어셈블리를 형성하는 고유 한 경향을 가지고 있습니다. 또한, 아밀로이드 베타 (Aβ) 피브릴의 분석에서 확인 된 많은 단백질은 다른 신경 퇴행성 질환과도 관련이 있으며, 이는 이러한 단백질이 다중 단백질 병증에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

이 SDS / 초음파 처리 방법은 피브릴 코어의 구조를 변경하거나 방해하지 않을 것입니다. 정제된 물질은 또한 광범위한 하향식 및 상향식 프로테오믹 분석 접근법 및 추가적인 MS 기반 구조 분석 전략, 예컨대 화학적 가교결합 또는 수소-중수소 교환에 적합하다. 이 방법을 사용하는 전체 회수율은 상대적으로 높기 때문에 정제 된 물질의 마이크로 그램 ~ 밀리그램이 필요한 상세한 구조 연구에 적합합니다. 정제된 물질은 또한 cryoEM 및 원자력 현미경을 이용한 구조 연구에 적합하다. 이 프로토콜은, 포유동물의 안정한 동위원소 표지와 조합하여, 아밀로이드 구조(¹⁰)의 고체 핵 자기 공명(NMR) 연구를 촉진할 수 있다.

Protocol

이 프로토콜은 인간 또는 척추 동물 뇌 조직의 사용을 포함합니다. 모든 연구는 노스 웨스턴 대학의 승인 된 제도적 지침을 준수하여 수행되었습니다. 현재의 워크플로우는 APP-knock in (App NL-G-F^/NL-G-F) 마우스 뇌 피질 및 해마 뇌 영역 추출물¹¹을 사용하여 표준화되었습니다. 이 프로토콜은 생후 6-9 개월에 생쥐의 뇌 추출물에 최적화되어 있으며 남성과 여성 동물 모두에서 아밀로이드를 효과적으로 정제 할 수 있습니다.

참고: 전체 실험 절차를 더 잘 이해하려면 워크플로의 개략도에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.

1. 조직 수확 및 아밀로이드 정제

참고 : 이상적으로, 아밀로이드 피브릴은 갓 해부 된 뇌 영역으로부터 분리되어야합니다. 그러나이 방법은 스냅 또는 플래시 냉동 뇌 조직에서도 잘 작동합니다. 아래는 나중에 사용하기 위해 저장을위한 스냅 냉동 뇌 조직에 대한 간략한 개요입니다.

1. 뇌 조직 수확 및 저장: 마우스 뇌를 해부하고 아밀로이드가 함유 된 영역 (즉, 피질 및 해마)을 신속하게 수확 한 다음 액체 질소 또는 드라이 아이스 알코올 욕조에서 스냅 냉동합니다.
   참고: 스냅 동결은 조직 구성 요소의 구조적 특성을 보존하는 데 도움이 됩니다. 마우스는 이소플루란 및 자궁경부 탈구^12,13에 의해 안락사된다. CO2는 뇌 프로테옴 완전성을 손상시킬 수 있기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다.
2. 해부 후, 신선한 조직을 작은 블록 (예를 들어, 5 mm x 5 mm)으로 절단하고 저장하며, 이는 아밀로이드 추출 전에보다 효율적인 균질화를 용이하게하기 때문입니다. 조직을 멸균 극저온 바이알로 옮기고 뚜껑을 조이고 빠르게 물에 잠깁니다.
3. 조직을 초저온 조건(즉, -80°C 또는 액체 질소)에서 동결 유지한다. 추출이 며칠 후에 수행되어야 하는 경우, 조직을 -20°C에서 보관하고 동결 및 해동 사이클을 피한다. 추출 및 정제를 위해 준비되었을 때 젖은 얼음 위에 동결된 조직을 해동시킨다.
   참고: 조직을 액체 질소와 직접 접촉하면 조직 및 단백질 손상이 발생할 수 있습니다. 알코올 목욕은 튜브 라벨에서 영구 마커를 제거 할 수 있습니다.

2. SDS 불용성 물질의 농축

참고: 달리 명시되지 않는 한 얼음과 원심분리기의 모든 단계를 4°C에서 수행하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 모든 버퍼 및 솔루션에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됩니다. 화학 물질 및 장비의 제조업체 및 카탈로그 번호는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 갓 해부되거나 스냅-냉동된 뇌 조직 영역(얼음 위에서 해동)으로 시작하여 6-8개의 세라믹 비드와 신선하게 준비된 빙냉 균질화 완충액(습윤 조직 덩어리 0.25-1g에 대해 1 mL)이 들어있는 2 mL 튜브에 넣었다.
2. 튜브를 비드 밀 호모게나이저로 옮기고 조직 내용물을 4000 rpm으로 분쇄하고, 각각 30 초의 두 사이클과 그 사이에 30 초 간격으로 분쇄하십시오.
   참고: 또는 전동 교반기 또는 호모게나이저 시스템을 사용하여 조직을 분쇄하고 균질화할 수 있습니다.
3. 15 mL 튜브의 뇌 전체 조직 균질액 1 mL에 빙냉 균질화 완충액 9 mL를 첨가하고, 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉하고, 4°C에서 하룻밤 동안 종단 간 회전시켜 견고한 가용화를 보장한다.
   참고: 원치 않는 큰 세포 파편과 지질을 제거하기 위해, 다음날 아침에, 튜브를 4°C에서 800 x g 에서 10분 동안 회전시키고 신선한 튜브에 상청액을 수집한다. 나머지 펠렛을 빙냉 균질화 완충액 2 mL에 재현탁시키고, 잘 섞고, 4°C에서 10분 동안 다시 스핀하고, 두 상청액을 합한다.
4. 조직 추출물 현탁액에 고체 수크로스를 최종 농도 1.2 M로 천천히 첨가하고, 잘 혼합하고, 4°C에서 45분 동안 250,000 x g 에서 원심분리한다.
5. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 펠렛을 1.9 M 수크로스를 함유하는 균질화 완충액 2 mL에 재현탁시켜 트리투레이션하고, 이어서 4°C에서 45분 동안 125,000 x g 에서 원심분리하였다.
   참고: 버퍼 볼륨은 이전 단계에서 회수된 재료의 양에 따라 조정할 수 있습니다. 일반적으로 10 부피의 균질화 버퍼 (V / V)가이 단계에 이상적입니다.
6. 피펫을 사용하여 상단 흰색 고체층을 수집하여 신선한 튜브로 옮기고 기포를 도입하지 않고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 1mL에 가용화하십시오.
7. 최상층 외에도, 펠렛은 또한 아밀로이드 피브릴로 풍부합니다. 더 높은 수율을 얻으려면 두 분수를 결합하고 진행하십시오. 피펫을 사용하여 중간 수성층을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
8. 합한 분획을 4°C에서 20분 동안 8000 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
9. 세척된 펠렛에 빙냉 소화 완충액 1 mL를 첨가하고, 재현탁시키고, 실온(RT)에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
10. 4°C에서 20분 동안 8000 x g 에서 원심분리하고 피펫을 이용하여 상층액을 제거하였다.
11. 재현탁하고 소화된 펠렛을 빙냉 트리스 완충액 1 mL에 두 번 세척한다(단계 2.8과 동일).
12. 세척된 펠렛을 1% SDS 및 1.3 M 수크로스를 함유하는 가용화 완충액 1 mL에 재현탁시켜 상하로 피펫팅한다. 4°C에서 60분 동안 200,000 x g 에서 신속하게 원심분리한다.
    참고: 아밀로이드 피브릴은 세제 및 변성제에 대한 내성이 높지만 세제(1% SDS)에 매우 오래 노출되면 피브릴의 무결성에 영향을 미치거나 단단히 결합된 단백질을 제거할 수 있으며 이는 후속 분석을 손상시킬 수 있습니다. 따라서, 펠렛을 재현탁시킨 직후, 원심분리를 진행한다.
13. 펠렛을 저장하고 나머지 상청액의 부피를 증가시켜 50 mM 트리스 완충액 (비율 1:0.3)을 첨가하여 수크로오스 농도를 1.3에서 1 M으로 감소시키고 4°C에서 45분 동안 200,000 x g 에서 1회 더 원심분리한다.
14. 두 펠렛을 아밀로이드 정제를 위해 0.5% SDS 및 풀을 함유하는 100 μL의 트리스 완충액에 용해시킨다. 눈에 보이는 펠릿은 작으며 불투명하고 회백색으로 나타나야 합니다(그림 2A 참조).

3. 아밀로이드 정제

참고 : 두 펠렛을 결합하고 균일 한 용액을 얻을 때까지 피펫팅하여 가용화하고 아밀로이드 정제의 다음 단계를 진행하십시오.

1. 펠릿에 존재하는 아밀로이드가 풍부한 물질의 완전한 가용화를 위해, 튜브를 20 사이클 동안 중간 범위 주파수에서 30 s ON 및 30 s OFF 동안 실행되는 욕조 초음파 처리 장치에서 초음파에 의해 생성 된 기계적 전단에 적용하십시오.
2. 물질을 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 에서 즉시 원심분리하고, 펠렛을 0.5% SDS 트리스 완충액의 500 μL에 재현탁시켰다.
3. 3.1단계를 반복합니다. 및 3.2 단계. 총 다섯 번 씻을 때 네 번. 순도를 향상시키기 위해 세척 횟수를 늘릴 수 있습니다.
   참고: 초음파 처리 및 세척 단계는 0.5% SDS에서 최적화되어 있는데, 더 높은 농도가 피브릴의 구조, 무결성 또는 단백질 조성에 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 이 단계에서 SDS 농도를 증가시키는 것은 권장되지 않습니다.
4. 최종 원심분리 단계 후, 펠렛을 200 μL의 초순수로 세척하고, 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하여 임의의 잔류 세제를 제거하였다. 정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 세척된 펠릿은 반투명하게 나타나며 때로는 보기 어렵다.
5. 정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 최종 펠렛을 100 μL의 초순수에 용해시킨다. 하류 처리를 위해 즉시 다음 단계로 진행하거나 추가 분석을 위해 피브릴 현탁액을 -20°C에서 저장한다. 얼어 붙은 경우 강수량을 시작하기 전에 얼음 위에서 해동하십시오.

4. 메탄올 클로로포름 침전

참고: 최종 목표가 단백질 분석을 수행하는 것이라면 추가적인 비단백질성 불순물을 탈염하고 제거하는 것이 좋습니다.

1. 정제된 100 μL의 아밀로이드 피브릴에 메탄올 400 μL를 1.5 mL 튜브에 첨가하고 와류 웰에 첨가한다.
2. 100 μL의 클로로포름을 튜브에 넣고 잘 와류하십시오.
3. 300 μL의 초순수와 와류를 완전히 첨가하십시오. 이것은 단백질 침전으로 인해 혼합물을 흐리게 만듭니다.
4. RT에서 2분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.
5. 단백질 플레이크를 함유하는 계면층을 방해하지 않고 수성 층(즉, 상부)을 조심스럽게 제거한다.
6. 동일한 부피의 메탄올을 다시 첨가하고, RT에서 2분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.
7. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 RT에서 펠렛을 공기 건조하십시오. 과도한 건조를 피하십시오. 아밀로이드 분획은 과도하게 건조될 경우 재용해되기 어렵다.

5. 트립신 소화

1. 펠렛을 50 μL의 구아니딘 히드로클로라이드 (GuHCl) 완충액에 용해시킨다. 얼음처럼 차가운 물 욕조에서 초음파 처리하고 필요한 경우 95 °C에서 5 분 동안 가열하십시오.
2. RT에서 45 분에서 1 시간 동안 철저히 소용돌이 치며 완전히 용해시킵니다. 이 단계 후에는 펠릿이 보이지 않으며 용액이 외관상 선명하게 보입니다.
3. 동일한 부피의 0.2% 계면활성제 용액을 첨가한다. RT에서 60분 동안 볼텍싱으로 가용화하십시오. 이 단계는 트립신 효소 활성을 향상시킵니다.
4. 500 mM 원액으로부터 1 μL의 트리스-2-카르복시에틸포스핀 (TCEP)을 첨가한다. 60분 동안 인큐베이션한다.
5. 2 μL의 500 mM 요오도아세트아미드 (IAA)를 첨가하고, 20분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
6. IAA를 15분 동안 5μL의 TCEP 용액으로 켄칭한다.
7. 필요한 부피의 50 mM 중탄산암모늄 용액을 튜브에 첨가하여 구아니딘 농도를 1.5 M으로 감소시킨다.
8. 튜브에 1% 계면활성제 용액(단백질 1μL/50μg)을 첨가합니다.
9. 트립신 (1 μg / 100 μg의 단백질)을 첨가하고 튜브를 37 °C에서 밤새 혼합하십시오.

6. 펩티드 정리

1. 다음날 아침, 포름산을 첨가하여 pH를 2.0으로 낮춤으로써 소화된 펩티드 용액을 산성화시킨다.
2. 200 μL의 50% 메탄올 용액을 첨가하여 2 mL 수신기 튜브에서 C18(n-옥타데실) 스핀 컬럼을 활성화시키고 RT에서 2분 동안 1500 x g 에서 스핀한다.
3. 200 μL의 평형화 완충액을 첨가하고 동일한 조건으로 2분 동안 방사함으로써 C18 컬럼 수지 베드를 평형화시킨다. 이 단계를 반복합니다.
4. 산성화된 펩티드 용액을 C18 컬럼에 로딩하고, RT에서 2분 동안 1500 x g 에서 원심분리한다. 두 번째 흐름은 버립니다.
5. C18 수지에 결합된 펩티드를 단계 6.3에서 행해진 바와 같이 세척 완충액 2x로 세척한다. 컬럼을 세척하기 위해 동일한 평형화 완충액을 사용한다.
6. 40 μL의 용출 완충액을 첨가하여 펩티드를 에루트한 다음, RT에서 2분 동안 1500 x g에서 원심분리하여 용출 단계를 3회 반복하여 회수된 펩티드의 수율을 증가시킨다.
7. 펩티드를 수성 용액을 증발시킴으로써 진공 농축기에서 빠르게 건조시킨다. 건조 펠릿은 MS 분석 전에 몇 주 동안 -20°C에서 저장될 수 있다.

7. 펩타이드 분석을 위한 질량분석기 설정

참고: MS 매개 변수에 대해서는 보충 파일 1 (랩의 이전 간행물에서 수정됨)¹⁴를 참조하십시오.

1. MS 분석을 위해 펩티드 샘플을 로딩하기 전에, 건조된 펩티드 펠릿을 20 μL의 샘플 로딩 완충액에 용해시키고, 회수된 펩티드의 농도를 정량화하기 위해 마이크로BCA를 수행한다.
2. 용해된 펩티드를 유리 바이알에 옮기고 펩티드의 3 μg (마이크로 BCA로부터 정량화)을 UPLC 시스템 자동 샘플러 내로 로딩한다.
3. 샘플을 250nL/min의 유량으로 통풍 트랩 컬럼(C18 HPLC 컬럼, 0.075mm x 20mm)에 로드합니다.
4. 트랩 컬럼을 분석 컬럼(0.075 μm x 500 mm)과 일렬로 배열하고 2000 V의 분무 전압을 거친 전기 분무 이온화(ESI) 소스에 에미터 팁을 조립한다.
   참고: 이 연구에서는 이동상이 기상으로 고전압 이온화를 받는 ESI가 수행됩니다. 이에 의해 생성된 스프레이는 가열된 모세관을 통해 MS의 진공 챔버로 향하게 된다. 진공 상태에서, 물방울의 탈용매화 및 이온의 배출은 열과 전압의 존재하에 발생합니다. 그 후, 이온들은 고전압 환경의 존재 하에 질량분석기를 향해 가속된다.
5. 2시간 수집 실행으로 샘플을 분석합니다. 이 연구는 가장 강렬한 상위 20 개 전구체 이온 선택 패러다임을 가진 데이터 의존적 수집을 사용하여 수행됩니다.
   참고: 데이터 의존적 획득에서, 제한된 수의 전구체 펩티드가 MS1 스캔에서 검출되고 MS2 분석을 위한 단편화를 거친다. 그러나, 동적 배제는 고도로 풍부한 Aβ 펩티드가 단편화를 위해 생략되고 그들의 양의 과소평가를 초래하기 때문에 여기에서 문제가 된다.
6. Aβ 펩티드의 절대 정량화를 위해, 표적화된 MS/MS 방법을 사용하여 동일한 샘플을 한 번 더 실행한다. 이 연구를 위해, APP 녹인 마우스 모델에 대한 다양한 가능한 트립틱 Aβ 펩티드에 대한 모든 m/z 비율의 완전한 목록이 제조된다( 보충 표 1 참조). 다른 그룹은 이용가능한 마우스 모델 및 관심있는 단백질로부터 생성된 가능한 펩티드 (예를 들어, AD에 대한 Aβ)에 따라 유사한 리스트를 제조해야 한다.
   참고: 고도로 풍부한 펩티드의 배제를 해결하려면, Aβ 트립틱 펩티드에 상응하는 선택된 m/z 값의 리스트를 제공함으로써 표적화된 접근법을 이용하라. 이 접근법은 Aβ 펩티드의 데이터 의존적 배제의 문제를 해결하고 높은 분해능으로 상이한 단량체 (Aβ38, 40 및 42 펩티드)의 절대 양을 정량화할 수 있다.
7. 질량 분광계는 펩티드 샘플의 MS 스펙트럼을 생성하고 원시 데이터 파일을 대상 디렉토리에 저장합니다. 이 파일을 사용하여 잘 정립 된 통계 및 생물 정보학 도구를 사용하여 스펙트럼 매칭을 수행하십시오. 여러 온라인 및 오프라인 데이터베이스 검색 및 분석 도구를 사용할 수 있습니다.

8. MS 데이터 분석

1. 오프라인 Rawconverter 도구 (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/)를 사용하여 MS1 및 MS2 파일을 추출하십시오.
2. 웹 기반 MS 데이터 검색 엔진에서 데이터의 식별, 정량화 및 상세한 분석을 수행합니다. 이 연구에서는 통합 프로테오믹스 파이프라인 – IP2 (브루커: http://www.integratedproteomics.com/)가 사용되었다.
   참고: 다른 여러 온라인 및 오프라인 MS 데이터 분석 도구를 사용할 수 있으며 MaxQuant (https://www.maxquant.org/)와 같은 것도 사용할 수 있습니다.
3. MS1 및 MS2 파일을 업로드한 후 업데이트된 마우스 프로테옴 데이터베이스를 선택합니다. 여기서, 추가적인 앱 넉인 특이적 돌연변이를 함유하는 업데이트된 마우스 데이터베이스가 ProLuCId 및 SEQUEST 알고리즘⁽¹¹)을 사용하는 펩티드의 동정을 위해 선택된다.
4. IP2 분석 시스템에서 기본 매개변수를 선택하고 실험 요구 사항에 따라 수정합니다. 이 연구에서, 전구체에 대해 50 ppm, 단편에 대해 600 ppm의 펩티드 질량 내성이 사용된다 (IP2에 사용된 다른 파라미터에 대해서는 보충 파일 1 참조).
   참고 : 연구원은 실험 목표에 따라 검색 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 번역 후 변형을 식별하기 위해, 다양한 PTM에 대한 차등 변형 값(예를 들어, 유비퀴틴화, SUMOylation, 인산화)을 추가한다.

Representative Results

Discussion

아밀로이드 구조 및 구성에 대한 명확한 이해를 개발하는 것은 AD 뇌 조직^16,17에서 정제 된 피브릴을 추출하는 생물학적 복잡성과 실험적 한계로 인해 구조 생물 학자 및 생화학자에게 도전적입니다. 아밀로이드 피브릴은 분자 수준에서 다형성이며, 다양한 길이와 복잡성의 이종 집단을 보여줍니다^18,19. 그들의 생물학적 특징과 병리학적 관련성을 더 잘 이해하기 위해, 사후 인간 및 AD 마우스 뇌 조직으로부터 수득된 다형성 아밀로이드 피브릴의 조성에 대한 철저한 특성화가 요구된다^20,21. 단백질의 큰 서브세트는 Aβ42와 직접 상호작용하는 반면, 다른 것들은 큰 피브릴라 구조 또는 단백질 복합체 ^22,23,24를 형성하는 경향을 가질 수 있다. AD 병리학과 관련하여 아밀로이드 형성, 안정화 및 신장에서 Aβ42와 상호 작용하는 단백질에 의해 수행되는 역할을 결정하는 것이 더 어렵습니다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 프로테오믹 연구는 다양한 초분자 배열, 막이 없는 소기관, 봉입체 및 단백질 응집체^25,26,27의 단백질 조성의 차이와 유사성을 해명하였다. AD의 초기 단계에서, 다중 세포 단백질 (예를 들어, Aβ42 및 미세소관-관련 타우 단백질 및 아포리포단백질 E)은 다수의 뇌 영역^28,29에서 미스폴드 및 공동-응집된다. 아밀로이드 생성 단백질 형성은 AD의 주요 병리학 적 특징 중 하나이며 병인에 기여할 가능성이 높습니다³.

병든 인간의 두뇌에서 아밀로이드 피브릴을 정제하는 것은 지루하고 도전적인 작업이며 여러 가지 한계가 있습니다. 기존 방법의 주요 단점 중 하나는 추출 된 물질의 순도가 낮기 때문에 cryoEM과 같은 이미징 방법을 사용하여 상세한 구조 분석을 제한하는 경우가 많습니다. 마찬가지로, NMR 연구는 몇 밀리그램의 정제된 물질을 필요로 하며, 이는 또한 무거운 동위원소 (즉, ¹⁵N)³⁰으로 표지될 필요가 있다. 사후 인간의 두뇌는 출발 물질이 인간 조직의 몇 그램까지 증가 될 수 있기 때문에 첫 번째 요구 사항을 충족시킬 수 있습니다. 그러나 인간의 뇌 조직을 무거운 동위원소로 표지하는 것은 불가능합니다. 반면에, AD 마우스 모델을 ^15N동위원소로 라벨링하는 것은 가능하지만(비용이 많이 들지만) 현재^31,32개가 점점 더 보편화되고 있다. 우리 실험실은 질병 및 노화 중 시냅스 단백질 회전율 역학을 연구하기 위해 펄스 체이스 라벨링을 사용했습니다¹⁴. 우리는 또한 전체 동물 무거운 동위 원소 라벨링을 사용하여 수명이 긴 단백질을 확인하고 정교한 생물학적 구조^33,34에서 생리적 관련성을 이해했습니다. 그러나, 마우스 뇌의 경우, 피브릴 코어의 실행 가능한 양을 얻기 위해 다량의 출발 물질이 요구된다. 이 방법은 기존의 생화학적 분리 원리를 수정함으로써 추출된 아밀로이드 피브릴의 수율 및 순도를 개선함으로써 이러한 문제를 성공적으로 해결한다. 따라서, 뇌 조직으로부터 아밀로이드 피브릴 추출을 위한 이러한 강력한 프로토콜은 cryoEM 및 NMR 기반 구조 연구에 용이하게 활용될 수 있다.

이 방법은 기존의 슈크로스 밀도 구배 기반 아세포 분획화 패러다임을 이용하고, 연속적인 단계에서 비특이적 공동정제 단백질을 제거한다. 세포 파편, 미엘린, DNA, 및 세포 지질을 제거한 후, 아밀로이드가 풍부한 SDS 불용성 펠릿이 단리된다. 다중 초음파 결합 SDS 세척의 추가 단계의 통합은 공동 정화 세포 성분, 느슨하게 결합 된 단백질 및 아밀로이드의 더 작은 SDS 가용성 다형체의 수를 줄이는 데 도움이됩니다. 최종 펠렛은 초순수에서 가용화되며 시딩 실험, 생화학 또는 약리학 연구 및 구조 분석을 포함한 많은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. AD 뇌 조직으로부터 정제된 아밀로이드 피브릴은 또한 MS 기반 프로테오믹스를 사용하여 피브릴 코어의 프로테오믹 조성 및 구조적 특징을 이해하는데 사용된다. 이 분석은 피브릴의 코어에서 세포 단백질의 서브셋 ( 도 4에 나타냄)의 존재를 확인했으며, 이는 장기간에 걸쳐 아밀로이드 피브릴의 형성, 신장 및 안정화에서 하나 이상의 단백질의 가능한 역할을 나타낼 수 있다. 이 분석에서 확인 된 단백질 중 일부는 하나 이상의 신경 퇴행성 장애, 예를 들어 Adam22, APP, ApoE, β-catenin 신경 필라멘트 단백질, 14-3-3 단백질 및 기타와의 연관성으로 알려져 있습니다.

일부 오염 단백질이 단백질 분석에 나타날 수있는 가능성이 있는데, 이는 균질화 후 아밀로이드 피브릴의 높은 소수성으로 인해 단백질 사이에서 부당한 상호 작용이 발생할 수 있기 때문입니다. 이러한 단백질 중 일부는 코어에 달라 붙으며 여러 차례의 초음파 처리 및 SDS 세척 단계 후에도 제거되지 않습니다. 이것은 이러한 아밀로이드 정제 전략의 한 가지 한계이다. 그러나, 적절한 음성 대조군을 사용하고 대규모 프로테오믹 연구에서 효과적인 통계적 컷오프를 수행하는 것은 해결될 수 있다. 우리가 직면 한 또 다른 한계는 트립신 소화 후 Aβ 펩티드 풍부도의 과소 평가와 관련이 있습니다. 이 워크플로는 대상 MS/MS 분석 전략에 의해 해결되었습니다. KEGG 경로에 대한 GO 분석은 많은 신경퇴행성 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증(ALS) 및 프리온 질환에 관여하는 경로에 속하는 단백질의 풍부함을 나타낸다. 이 단백질은 여러 병리학 적 경로에서 중요한 역할을하며, 따라서 질병 개시 및 진행에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 흥미롭게도, 이러한 단백질 중 일부는 AD 및 기타 신경 퇴행성 질환의 병리학에 대한 가능한 개입을 결정하기 위해 추가 분석이 필요합니다.

다른 질병 모델의 순수한 아밀로이드 물질에 대한 미래의 연구는 핵심 피브릴의 구조적 패턴 및 구성에 대한 심층적 인 이해를 제공 할 수 있으며 주요 치료 목표를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Materials

Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm	Thermo Scientific	164535	Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody	Biolegend	803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody	Biolegend	800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody	IBL America	10323
anti-amyloid fibril LOC antibody	 EMD Millipore	AB2287
BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Bioruptor Pico Plus	Diagenode	B01020001
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	 C1016
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	G4505
HyperSep C18 Cartridges	Thermo Fisher Scientific	60108-302
Integrated Proteomics Pipeline – IP2 	http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor	Cole Parmer	Glas-Col 099C
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm	Thermo Scientific	164942
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter	BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns	Thermo Fisher Scientific	89870
Precellys 24 tissue homogenizer	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer	Promega	V2072
RawConverter	http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide	VWR	97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002446
Speed Vaccum Concentrator	Labconco	7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade	Promega	V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System	Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO