직장 오가노이드 형태 분석(ROMA): 낭포성 섬유증의 진단 분석

Senne Cuyx; Anabela S. Ramalho; Nikky Corthout; Steffen Fieuws; Eva Fürstová; Kaline Arnauts; Marc Ferrante; Catherine Verfaillie; Sebastian Munck; Mieke Boon; Marijke Proesmans; Lieven Dupont; Kris De Boeck; François Vermeulen

doi:10.3791/63818

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방법 논문

직장 오가노이드 형태 분석(ROMA): 낭포성 섬유증의 진단 분석

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DOI:

10.3791/63818

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2022년 6월 10일

Senne Cuyx¹^,² , Anabela S. Ramalho¹ , Nikky Corthout³^,⁴ , Steffen Fieuws⁵ , Eva Fürstová⁶ , Kaline Arnauts⁷^,⁸ , Marc Ferrante⁷^,⁹ , Catherine Verfaillie⁸ , Sebastian Munck³^,⁴ , Mieke Boon¹^,² , Marijke Proesmans¹^,² , Lieven Dupont¹⁰^,¹¹ , Kris De Boeck¹^,² , François Vermeulen¹^,²

¹Department of Development and Regeneration, Woman and Child Unit, CF research lab, KU Leuven, ²Department of Pediatrics, Pediatric Pulmonology, University Hospitals Leuven, ³VIB Bio Imaging Core, VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, ⁴Department for Neuroscience, KU Leuven, ⁵Interuniversity Center for Biostatistics and Statistical Bioinformatics, University of Leuven and University of Hasselt, ⁶Department of Pediatrics, 2<sup>nd</sup> Faculty of Medicine, Charles University and Motol University Hospital, ⁷Department of Chronic Diseases and Metabolism (CHROMETA), Translational Research Center for Gastrointestinal Disorders (TARGID), KU Leuven, ⁸Department of Development and Regeneration, Stem Cell Institute Leuven (SCIL), KU Leuven, ⁹Department of Gastroenterology and Hepatology, University Hospitals Leuven, KU Leuven, ¹⁰Department of Chronic Diseases, Metabolism and Ageing; Pneumology, KU Leuven, ¹¹Department of Respiratory Diseases, University Hospitals Leuven

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 낭포성 섬유증(CF)에 대한 새로운 진단 분석인 직장 오가노이드 형태 분석(ROMA)을 설명합니다. 형태 학적 특성, 즉 진원도 (원형도 지수, CI)와 루멘의 존재 (강도 비율, IR)는 CFTR 기능의 척도입니다. 189 명의 피험자를 분석 한 결과 CF와 비 CF가 완벽하게 구별되었습니다.

초록

낭포성 섬유증(CF)의 진단은 항상 간단한 것은 아니며, 특히 땀 염화물 농도가 중간이거나 질병을 유발하는 CFTR 돌연변이가 2개 미만인 경우 더욱 그렇습니다. 생리학적 CFTR 분석(비강 전위차, 장 전류 측정)이 진단 알고리즘에 포함되었지만 항상 쉽게 이용 가능하거나 실현 가능한 것은 아닙니다(예: 유아에서). 직장 오가노이드는 특정 조건에서 배양할 때 직장 생검의 음와에서 분리된 줄기 세포에서 자라는 3D 구조입니다. 비 CF 피험자의 유기체는 CFTR 매개 염화물 수송이 물을 내강으로 유도하기 때문에 둥근 모양과 유체로 채워진 내강을 가지고 있습니다. CFTR 기능에 결함이있는 유기체는 팽창하지 않고 불규칙한 모양을 유지하고 눈에 보이는 루멘이 없습니다. CF와 비 CF 오가노이드 간의 형태 차이는 새로운 CFTR 생리학적 분석으로 '직장 오가노이드 형태 분석'(ROMA)에서 정량화됩니다. ROMA 분석을 위해 오가노이드를 96웰 플레이트에 플레이팅하고 칼세인으로 염색한 다음 컨포칼 현미경으로 이미지화합니다. 형태 학적 차이는 두 가지 지수를 사용하여 정량화됩니다 : 원형도 지수 (CI)는 유기체의 진원도를 정량화하고 강도비 (IR)는 중심 루멘의 존재를 측정 한 것입니다. 비 CF 오가노이드는 CF 오가노이드에 비해 높은 CI와 낮은 IR을 갖는다. ROMA 지수는 CF가 없는 22명의 피험자와 CF가 있는 167명의 피험자를 완벽하게 구별하여 ROMA를 CF 진단에 도움이 되는 매력적인 생리학적 CFTR 분석법으로 만들었습니다. 직장 생검은 대부분의 병원에서 모든 연령대에서 일상적으로 수행 할 수 있으며 조직은 오가노이드 배양 및 ROMA를 위해 중앙 실험실로 보낼 수 있습니다. 미래에는 ROMA를 적용하여 체외에서 CFTR 조절제의 효능을 테스트할 수도 있습니다. 본 보고서의 목적은 ROMA에 사용되는 방법을 완전히 설명하고 다른 실험실에서 복제를 허용하는 것입니다.

서론

낭포성 섬유증(CF)은 CF 막횡단 전도도 조절제(CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 질환입니다. CFTR 단백질은 염화물 및 중탄산염 채널로 여러 상피¹의 수화를 보장합니다. CF는 주로 호흡기 질환으로 나타나지만 위장관, 췌장, 간 및 생식 기관에도 영향을 미치는 고부담, 수명 단축, 다중 시스템 질환입니다².

질병을 유발하는 CFTR 돌연변이는 CFTR의 양이나 기능을 감소시켜 점액 탈수를 유발합니다. CFTR 유전자의 2,000개 이상의 변이체가 기술되었으며³, 그 중 466개만이 완전히 특성화되었습니다⁴.

CF의 진단은 땀 염화물 농도 (SCC)가 60 mmol / L의 임계 값을 초과하거나 두 가지 질병 유발 CFTR 돌연변이 (CFTR2 데이터베이스에 따름)^{가 확인 될} 때 ^4,5 할 수 있습니다. 땀 검사의 약 4%-5%에....