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방법 논문

혈액 투석 접근 관련 손 기능 장애의 쥐 모델

2K 조회수

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DOI:

10.3791/63892

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2022년 5월 31일

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1Department of Applied Physiology and Kinesiology, University of Florida, 2Division of Vascular Surgery and Endovascular Therapy, University of Florida, 3Center for Exercise Science, University of Florida, 4Malcom Randall Veteran Affairs Medical Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 쥐 총장골 동정맥루 생성의 수술 단계를 자세히 설명합니다. 우리는 혈액 투석 접근 관련 사지 병태생리학을 연구하기 위해 이 모델을 개발했습니다.

초록

만성 신장 질환은 주요 공중 보건 문제이며 혈액 투석과 같은 만성 신대체 요법이 필요한 말기 신장 질환(ESRD)의 유병률이 계속 증가하고 있습니다. 자가 동정맥루(AVF) 배치는 ESRD 환자의 주요 혈관 접근 옵션으로 남아 있습니다. 안타깝게도 혈액 투석 환자의 약 절반이 미묘한 감각 이상에서 디지털 괴저에 이르기까지 투석 접근 관련 손 기능 장애(ARHD)를 경험합니다. 특히, ARHD의 원인이 되는 근본적인 생물학적 동인은 잘 이해되지 않았으며, ARHD의 예방/치료를 위한 메커니즘을 밝히거나 새로운 치료법을 개발하기 위한 적절한 동물 모델이 존재하지 않습니다. 여기에서 우리는 왼쪽 총장골동맥과 정맥 사이에 AVF가 생성되어 사지 병태생리학의 평가를 용이하게 하는 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 미세 수술에는 혈관 분리, 세로 정맥 절제술, 동정맥 문합 생성 및 정맥 재건이 포함됩니다. 가짜 수술에는 AVF 생성을 제외한 모든 중요한 단계가 포함됩니다. 장골 AVF 배치는 중추 혈역학, 말초 허혈 및 뒷다리 신경 운동 성능의 손상에서 임상적으로 관련된 변화를 초래합니다. 이 새로운 전임상 AVF 모델은 혈액 투석 환자가 보고한 일반적인 신경 운동 교란을 요약하는 유용한 플랫폼을 제공하여 연구자가 ARHD 병태생리학의 메커니즘을 조사하고 잠재적인 치료법을 테스트할 수 있도록 합니다.

서론

기능적 혈관 접근의 확립 및 보존은 혈액 투석을 통해 신대체 요법을 받는 말기 신장 질환(ESRD) 환자에게 중요한 주요 목표로 남아 있습니다1. 신장 기능이 부적절해지면 노폐물을 제거하고, 전해질을 정상화하고, 체액 균형을 유지하기 위해 반복적인 혈액투석 치료가 필요하므로 장기 생존에 필요하다2. 따라서 혈관 접근은 ESRD 환자의 "생명선"을 나타내며 자가 동정맥루(AVF) 배치는 이 코호트3에서 선호되는 투석 접근 옵션으로 남아 있습니다. 그러나 혈액 투석 환자의 약 30%-60%는 임상적으로 접근 관련 손 기능 장애(ARHD)로 정의되는 다양한 손 장애를 경험합니다. ARHD의 증상은 쇠약과 협응 장애에서 단일마비 및 디지털 괴저에 이르기까지 다양할 수 있으며, 이는 AVF 생성 후 초기에 발생하거나 누공 성숙과 함께 점진적으로 발생할 수 있습니다. 또한, ARDD는 ESRD 치료 일정을 복잡하게 하는데, 이는 낮은 삶의 질, 높은 심혈관 질환 위험 및 사망률 증가와 관련이 있다 2,3,4.

AVF 생성 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 후 혈역학적 변화에 의해 유도된 혈관 리모델링을 연구하기 위해 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 장골 또는 대퇴골 AVF 16,17,18,19,20을 가진 대형 동물 모델과 경동맥-경정맥 문합 또는 신장하 대동맥-하대정맥 누공 형성을 사용하는 설치류 모델은 앞서 언급한 AVF 성숙 및 개통 측면을 조사하기 위해 잘 확립되어 있다 21 . 예를 들어, 정맥 고혈압, 더 큰 내강 직경 및 증가된 정맥 벽 두께는 성공적인 AVF 성숙의 신호인 반면, 매질의 실질적인 섬유증 및 흐름의 변화가 없는 내막 증식 또는 혈전 발달은 종종 AVF 실패를 특징으로 합니다 6,15. 그러나 대형 동물 모델은 쥐 모델의 실험적 유연성이나 형질전환 능력이 부족한 반면, 현재의 설치류 모델은 해부학적 위치 및/또는 관련 사지 병리의 부족으로 인해 ARHD 조사를 쉽게 용이하게 하지 않습니다. 실제로, 관련 임상 표현형을 요약하는 확립된 전임상 동물 모델의 부족으로 인해 증상이 있는 ARHD 환자의 수가 점진적으로 증가했음에도 불구하고 병리학적 메커니즘을 밝히고 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 연구 진행은 정체 상태를 유지하고 있습니다. 따라서 본 연구의 주요 목적은 ARHD의 독특한 마우스 모델을 도입하여 AVF 미세수술의 절차적 단계와 AVF 관련 병태생리학의 특성화를 제공하는 것입니다.

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프로토콜

모든 절차는 플로리다 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)와 Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center의 승인을 받았습니다.

참고: 젊은 성인(8-10주령) 수컷 C57BL/6J 마우스를 잭슨 연구소에서 구입하여 조명(12시간 조명: 12시간 암주기 주기), 온도(22°C ± 1°C) 및 습도(50% ± 10%) 제어 동물 시설에 수용했습니다. 5마리의 생쥐가 우리당 거주할 수 있도록 허용되었으며(W:18 cm x L:29 cm x H:12.5 cm) 둥지 재료, 음식 및 물이 임의로 제공되었습니다. 표준 차우로 7일 동안 서식지에 적응한 후, 마우스를 식단 전환 단계로 7일 동안 카제인 기반 차우 식단으로 변경했습니다. 그 후, 마우스에 앞서 기술한 바와 같이 AVF 수술 전에 신장 기능 장애(CKD)를 유도하기 위해 2-3주 동안 0.2%-0.15% 아데닌 보충과 함께 카제인 기반 차우를 공급했습니다22,23,24. 대조군 마우스는 아데닌 보충 없이 카제인 기반 차우 식이를 받았습니다(대조군). 대조군 및 CKD 식단은 수술 후 회복 기간(POD) 동안 유지되었습니다.

1. 수술 전 측정

  1. 앞서 설명한 바와 같이 이중 초음파 영상 및 레이저 도플러를 통한 뒷다리 관류를 사용하여 기준선/수술 전 결과 측정, 대동맥 관절관 직경 및 혈역학적 흐름 매개변수를 평가합니다25.
  2. 앞서 설명한 대로 기준선 뒷다리 기능을 설정하기 위해 편측 뒷다리 그립 강도와 트레드밀 보행 평가를 결정합니다25,26.
  3. 앞서 설명한 바와 같이 FITC-이눌린 청소율 및/또는 혈청 혈액 요소 질소(BUN) 수준을 통해 사구체 여과율(GFR)을 측정하여 신장 기능을 평가합니다 22,24,27.

2. 수술 준비

  1. 다음 수술 도구 및 용품 준비 (재료 표) : 뜨거운 구슬 살균기, 눈 윤활제, 펜 트리머, 알코올 준비제, 클로르헥시딘 물티슈, 극세 Graefe 집게, 멸균 된 0.9 % 식염수, 29G 및 31G 바늘 주사기, 2 x 2 부직포 스폰지, 중간 단일 종단 원형 (SC-9) 및 작은 양단 단단하고 날카 롭고 뾰족한 (SC-4) 면봉, 저온 소작, 직선 Dumont 집게, 45° 각진 Dumont 집게, 직선 Vannas 스프링 가위, 곡선 Vannas 스프링 가위, 둥근 손잡이 바늘 홀더, 다양한 크기의 봉합사(4-0 실크, 5-0 PGA, 6-0 실크 및 10-0 나일론 봉합사), 헤파린, 흡수성 젤라틴 스폰지, 직선 바늘 홀더 및 부프레노르핀.
    알림: 복부와 다리의 사지 고정 고무 밴드와 견인기는 수작업으로 제작되었습니다.
  2. 수술 전 120-125°C에서 30분 동안 증기 멸균과 함께 오토클레이브를 사용하여 수술 준비를 소독한 후 30분 동안 건조시킵니다. 각 동물 수술 사이에 70% 에탄올 클렌징 후 핫 비드 멸균(240-270°C에서 3분)을 활용합니다.
  3. 29-31G 바늘 주사기를 사용하여 멸균된 0.9% 생리 식염수, 헤파린 처리 식염수(100IU/mL) 및 부프레노르핀(0.01mg/mL)을 준비합니다.

3. 마취 및 위치 지정

  1. 유도 챔버에서 마우스 마취를 시작합니다(0.8mL/분, 2.5% 이소플루란). 마우스가 적절하게 마취되면 멸균 커튼으로 덮인 수술 스테이션에서 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 면도 및 위치 지정 단계에서 이소플루란 농도를 ~1.2%로 줄입니다.
  2. 수술 중 눈이 건조해지지 않도록 안구 윤활제를 바르십시오.
  3. 펜 트리머를 사용하여 수술을 위해 복모를 면도하고 수술 후 관류 측정을 위해 다리 털을 면도합니다. 수술 부위에서 머리카락을 치우십시오.
  4. 고무줄과 압정으로 상지와 하지를 고정하고 발가락 꼬집음 반사를 모니터링하여 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 마취를 적정합니다. 마취 수준을 보정하기 위해 수술 절차 전반에 걸쳐 3-5분마다 호흡 패턴 평가를 수행합니다.

4. 수술 대상 부위 탐색

  1. 면도한 피부 부위를 여러 번 청소하고 알코올 제제와 클로르헥시딘 물티슈를 원형 패턴으로 번갈아 가며 수술 부위를 소독합니다.
  2. 흉골 가장자리의 아래쪽 가장자리에서 치골 결합까지 정중선 개복술을 시행합니다. 더 넓은 수술 영역을 얻기 위해 치골 지방 패드를 해부합니다.
  3. celiotomy를 열어 견인기로 복막 내용물에 접근하고 중간 단일 끝 원형 면봉을 사용하여 소장과 대장을 내장을 적출합니다. 식염수에 적신 부직포 스폰지로 장을 덮으십시오.
  4. 후복막 맥관 구조가 적절하게 노출되면 나머지 장, 신장 및 요관을 작은 식염수에 적신 부직포 스폰지로 덮습니다. 필요에 따라 중간 크기의 단일 끝 원형 면봉으로 방광 돔을 부드럽게 짜서 팽창된 방광을 비웁니다.
  5. 곧은 Dumont 집게와 작고 양단이 단단하고 날카롭고 뾰족한 면봉을 사용하여 왼쪽 장골 분기점까지 확장되는 약 1cm 근위부에서 대동맥 분기점까지 약 1cm의 혈관주위 근막과 지방 조직을 조심스럽게 절개합니다.
    참고: 왼쪽 장골 동맥과 정맥은 동정맥 구조를 한꺼번에 분리하면서 서로 접착된 상태로 남아 있습니다. 이 단계는 AVF 생성을 용이하게 하기에 충분한 선박 동원을 제공할 것입니다.
  6. 왼쪽 총장골 정맥에서 시작되거나 수렴하는 작은 정맥 가지가 발견되면 필요에 따라 6-0 실크 봉합사를 사용하거나 사용하지 않고 저온 소작을 사용하여 결찰합니다.
  7. 각진 집게의 끝을 왼쪽 총장골 혈관 다발 아래로 통과시키고 부드럽게 여러 번 펴서 밑에 있는 후복막 근육계에서 혈관을 동원합니다(그림 1A).

5. 일반적인 장골 동정맥루 문합의 생성

  1. 분리된 좌측 총장골 동정맥 다발 주위에 2개의 4-0 실크 봉합사를 놓고 혈관 다발에 대한 합자(예: 교차 클램프)로 사용합니다. 각 4-0 실크 넥타이로 하나의 매듭을 만들고 근위부에서 원위부까지 순차적으로 적용하십시오.
  2. 실크 타이 크로스 클램프가 ~2mm의 혈관 길이를 분리할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하고 봉합사 합자를 순차적으로 적용하면 왼쪽 장골 정맥 충혈이 촉진됩니다.
  3. 4-0 실크 봉합사 스트링을 손잡이로 사용하여 왼쪽 장골 동정맥 다발을 시계 방향으로 돌리고 위치를 미세 조정하여 동맥 앞쪽 정맥을 일시적으로 찾습니다(그림 1B).
  4. 직선 Vannas 스프링 가위로 세로 정맥 절개술(~1mm)을 하고 0.9% 식염수로 정맥 내강에 남아 있는 혈액을 부드럽게 씻어냅니다(그림 1C). 고압 식염수 세척은 정맥 파열을 유발할 수 있으므로 이 단계에서 주의하십시오.
    참고: 정맥 세척 후 장골 동맥에 남아 있는 붉은 색 영역은 다음 단계를 위한 시각적 창을 제공합니다.
  5. 정맥의 후벽을 통해 10-0 나일론 봉합사를 놓습니다.
    참고: 장골 정맥의 이 부분은 장골 동맥의 전벽에 즉시 위치해야 하며 벽은 자연적으로 접착됩니다. 봉합사는 양쪽 벽을 통과하고 봉합사를 단일 매듭으로 묶어야 합니다(그림 1D). 장골 동맥의 정체 된 혈액에서 비롯된 소량의 출혈은 바늘이 양쪽 벽을 통과하면 나타납니다. 이 단계에서 내강 내 출혈이 계속되면 실크 봉합사 크로스 클램프가 너무 느슨할 수 있으므로 더 조여야 합니다.
  6. 침윤된 봉합사 끝을 잡고 장골 동맥의 후벽에서 전벽을 이동시키기 위해 부드러운 장력 하에 놓습니다. 곡선 Vannas 스프링 가위를 사용하여 ~1.0mm x 0.3mm 타원형 절개를 만들어 장골 동맥과 정맥의 접착 벽을 제거합니다.
    참고: 동정맥루는 이 공통 채널이 설정되면 생성됩니다. 이 단계에서 정맥 절개술 노출을 통해 후장골정맥/전방장골동맥벽 절개를 시행하기 때문에 정맥의 외벽을 손상시킬 수 있습니다. 누공 직경을 상당히 줄이고 혈전 발생을 유발할 수 있으므로 이러한 합병증을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다.
  7. 노출된 동맥 내강의 잔류 혈액을 0.9% 식염수와 헤파린 처리 식염수(100IU/mL)로 부드럽게 씻어냅니다.28 (그림 1E).
  8. AVF를 만든 후 중단된 방식으로 2개 또는 3개의 10-0 나일론 봉합사를 사용하여 초기 전벽 정맥 절개술을 복구합니다(그림 1F).
  9. 혈관 다발을 원래의 해부학적 방향으로 복원하고 지혈을 촉진하기 위해 수리된 정맥 절개술 옆에 식염수에 적신 흡수성 젤라틴 스폰지의 작은 조각을 놓습니다.
  10. 4-0 단일 매듭 크로스 클램프 합자를 원위에서 근위까지 순차적으로 풉니다. 각 봉합사를 풀면서 과도한 출혈이 있는지 독 절개술 부위를 면밀히 모니터링하십시오.
  11. 수리가 적절하게 지혈되지 않으면 크로스 클램프를 다시 적용하고 출혈 부위에 또 다른 10-0 나일론 봉합사를 놓습니다. 지혈이 확실하면 봉합사를 제거한 다음 흡수성 젤라틴 스폰지를 제거하십시오.
  12. 작은 양단의 단단하고 날카 롭고 뾰족한 면봉으로 혈관 다발을 부드럽게 문지르면 혈류 회복을 촉진합니다. 장골 정맥으로 들어가는 박동성의 밝은 적색 산소가 함유 된 혈액의 시각화를 사용하여 수술의 기술적 성공을 확인하고 뒷다리에서 돌아 오는 어두운 정맥혈과 혼합합니다.
  13. 전신 항응고를 위해 헤파린 처리 식염수(0.2 IU/g)15 를 IVC에 주입하여 AVF 개통 결과를 개선합니다.
    참고: 이 단계는 혈관 재건 후에 발생하지만(혈관 교차 클램핑 전에 헤파린화가 발생하는 인간 유사체와 대조적으로) 절차의 이 단계에서 수행했을 때 수술 중 출혈의 감소 및 개선된 AVF 개통성이 관찰되었습니다. 근막 및/또는 지방으로 덮인 부위에 주사하는 것이 천자 부위의 출혈을 방지하는 것이 바람직합니다.
  14. 헤파린 처리 식염수 주사 후 수술 부위의 지혈을 다시 검사하십시오. 출혈 우려가 없으면 정중선 근막을 봉합한 다음 흡수성 5-0 PGA 봉합사로 피부 절개를 런닝 방식으로 봉합합니다.
  15. 가짜 작업의 경우 AVF 형성을 제외한 절차의 모든 주요 단계를 따르십시오. 왼쪽 장골 동정맥 다발의 근위 끝에 4-0 실크 합자의 단일 매듭을 적용하고 클램프 시간을 AVF 수술에 맞춥니다(예: 미세외과 의사의 숙련도에 따라 ~20분).

6. 수술 후 관리 및 측정

  1. 개복술 폐쇄 후 레이저 도플러 영상을 사용하여 양측 경골근 전방 근육과 복부 발의 혈액 관류를 측정합니다.
    참고: 일방적인 관류 결손은 동맥 흐름의 누공 전환("훔치기")을 확인합니다.
  2. 0.1mg/kg 부프레노르핀을 피하 투여하고 둥지가 있는 흡수성이 높은 부드러운 침구가 있는 예열된 마우스 케이지로 마우스를 되돌립니다.
  3. 마취가 사라질 때까지 예열된 마우스 케이지에서 마우스가 회복되도록 허용하며, 이는 마우스가 걸을 수 있고 상호 작용할 때(~2시간) 분명합니다. 회복하는 동안 마우스가 보습되고 부드러운 식단에 쉽게 접근 할 수 있도록하십시오.
  4. 부프레노르핀 및/또는 피하 식염수 수분 공급을 12시간마다 최대 48시간까지 투여하고 수술 후 5일 동안 매일 모니터링을 수행합니다. 변형된 허혈 점수로 분류되는 상태가 악화되거나 과도한 조직 괴사가 있는 동물을 안락사시킵니다≥229.
  5. 수술 후 누공 개통을 평가하기 위해 직렬 이중 초음파 평가를 사용합니다. 누공 혈전증이 있는 마우스는 실험의 목적이 AVF 성숙 실패를 특성화하는 것이 아닌 한 후속 분석에서 제외됩니다.
  6. 회복 기간 동안 국소 혈역학, 악력 및 보행 성능과 같은 기타 수술 후 결과 측정을 결정합니다. 희생25,27 동안 실험이 끝날 때 조직 형태를 평가하기 위해 누공 및 근육 조직을 수집합니다.

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결과

아데닌 식이에 노출된 동물은 카제인 기반 차우를 투여받은 동물에 비해 사구체 여과율이 감소하고(대조군: 441.3 ± 54.2 μL/min 대 CKD: 165.1 ± 118.3 μL/ min, p < 0.05) 혈청 요소 질소 수치가 증가하여(대조군: 20.39 ± 4.2 μL/min 대 CKD: 38.20 ± 10.65 μL/min, p < 0.05) 카제인 기반 차우를 투여받은 동물에 비해 동정맥루 수술 전에 신장 기능 부전이 있음을 확인했습니다.

AVF 개통 검증
기술적 성공에 대한 수술 중 시각적 확인은 누공 개통의 초기 식별이지만 연구 기간 동안 개통 또는 생리적 성숙을 완전히 보장하지는 않습니다. 수술 후 개통 결과(즉, 성공 또는 실패)는 이전에 입증한 바와 같이 이중 초음파 영상과 조직학적 검사를 모두 사용하여 결정되었습니다25. 도 2는 각각...

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토론

AVF 생성 후 ARHD가 있는 혈액투석 환자의 유병률은30,31 지속적으로 증가했습니다. 실제로, 통증, 쇠약, 감각 이상 및/또는 운동 범위 감소와 같은 해결되지 않은 증상 합병증4,32,33은 환자의 웰빙 4,32,33,34,35,36에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 고품질의 반복적인 혈액 투석 치료를 받을 수 있는 능력을 위협할 수 있다.<...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

장골 AVF 모델 개발 및 외과 교육에 대한 기술 지원을 해주신 플로리다 대학교 혈관 외과 및 혈관 내 치료 부서의 Guanyi Lu 박사와 라이브 미세 수술 이미지를 얻을 수 있도록 기술 지원을 해주신 플로리다 대학교 응용 생리학 및 운동 요법과의 Ravi Kumar에게 진심으로 감사드립니다.

이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) 및 국립 심장, 폐 및 혈액, 연구소 번호 R01-HL148697 (STS) 및 미국 심장 협회 보조금 번호 POST903198 (KK에)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.15% 아데닌 다이어트ENVIGOTD.13089920% 카제인, 0.15% 아데닌, 0.9% P
0.2% 아데닌 다이어트ENVIGOTD.13090020% 카제인, 0.2% 아데닌, 0.9% P
10-0 나일론 봉합사AD 수술XXS-N1005T4
29G 바늘 주사기Exel International14-841-32
31G 바늘 주사기AdvocateU-100 인슐린 주사기
4-0 실크 봉합AD 수술S-S41813
45도 각도 듀몬트 집게파인 사이언스 도구11253-25
5-0 PGA 봉합AD 외과PSGU-518R13
6-0 실크 봉합AD 수술S-S618R13
흡수성 젤라틴 스폰지ETHICON1975
알코올 준비Covidien5110-cs400070% 이소프로필 알코올
부프레노르핀NANA0.01g/mL
C57BL6/J 마우스Jaxon Laboratory
Casein 다이어트ENVIGOTD.13089820% 카제인, 0.9% P
면봉CONSTIXSC-9중간 단면 원형 면봉
면CONSTIXSC-4작은 양단 단단하고 날카롭고 뾰족한 면봉
Curity 부직포 스폰지 (2x2)Covidien9022
곡선 Vannas 스프링 가위Fine Science Tools15001-08
도플러 초음파VisualSonicsVevo 2100
Extra fine graefe yphpFine Science Tools11150-102 쌍
눈 윤활제CLCMEDICAOptixcare 눈 윤활유
Heparin (5000 U/mL)국가 약물 코드 목록63739-953-25100 IU/mL
핫 비드 살균기Fine Science Tools18000-50
저온 소작BovieAA04
펜 트리머Wahl5640-600
무가루 수술용 장갑Ansell7824PF
원형 핸들 바늘 홀더Fine Science Tools12076-12
멸균 수건 드레이프DynarexDY440-MI
멸균 0.9% 식염수국가 약물 코드 목록46066-807-25
스트레이트 듀몬트 집게파인 사이언스 도구11253-20
스트레이트 니들 홀더파인 사이언스 도구FST 12001-13
스트레이트 vannas 스프링 가위Fine Science Tools25001-08
TrizChLOR4National Drug Codes List17033-279-50
사 사 사 봉

참고문헌

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  6. Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
  7. Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
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