방법 논문

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

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DOI:

10.3791/63934

⸱

2023년 3월 3일

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

이 논문에서

요약

여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.

초록

담수 체와 관련된 미생물총을 통한 항생제 내성(AR)의 개발 및 확산은 주요 글로벌 건강 문제입니다. 본 연구에서는 기존의 배양 기반 기술과 고처리량 배양 독립적 메타게놈 접근 방식을 모두 사용하여 담수 샘플을 수집하고 총 박테리아 다양성 및 AR 유전자(ARG)와 관련하여 분석했습니다. 이 논문은 담수 샘플에서 전체 및 항생제 내성 배양 가능한 박테리아를 열거하고 배양 가능한 분리 물에서 표현형 및 유전형 내성을 측정하기위한 체계적인 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 배양 불가능한 박테리아를 포함한 전체 박테리아 다양성의 식별과 수역에서 다른 ARG (resistome)의 총 풀을 식별하기 위해 담수 샘플에서 추출한 전체 메타 게놈 DNA의 전체 메타 게놈 분석의 사용을보고합니다. 이러한 상세한 프로토콜에 따라 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL 범위에서 높은 항생제 내성 박테리아 부하를 관찰했습니다. 대부분의 분리주는 세포탁심, 암피실린, 레보플록사신, 클로람페니콜, 세프트리악손, 겐타마이신, 네오마이신, 트리메토프림 및 시프로플록사신을 포함한 여러 테스트된 항생제에 내성이 있었으며 다중 항생제 내성(MAR) 지수는 ≥0.2로 분리균주에서 높은 수준의 내성을 나타냅니다. 16S rRNA 시퀀싱은 폐렴 클렙시엘라와 같은 잠재적인 인간 병원체와 코마모나스 종, 마이크로코커스 종, 아르트로박터 종 및 아에로모나스 종과 같은 기회주의적 박테리아를 확인했습니다. 분리 물의 분자 특성 분석은 blaTEM, blaCTX-M (β- 락탐), aadA, aac (6 ') -Ib (아미노 글리코 시드) 및 dfr1 (트리 메토 프림)과 같은 다양한 ARG의 존재를 보여 주었으며, 이는 또한 전체 메타 게놈 DNA 분석에 의해 확인되었다. 항생제 유출 펌프를 암호화하는 다른 ARGs의 높은 유병률-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-락타마제-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자 catB10, 및 리팜피신 내성 유전자 rphB-메타게놈 DNA에서도 검출되었다. 이 연구에서 논의된 프로토콜의 도움으로 다양한 AR 표현형 및 유전형 특성을 가진 수인성 MAR 박테리아의 존재를 확인했습니다. 따라서 전체 메타게놈 DNA 분석은 수역의 전반적인 AR 상태를 결정하기 위해 기존의 배양 기반 기술에 보완적인 기술로 사용될 수 있습니다.

서론

항생제 내성 (AMR)은 가장 시급한 글로벌 문제 중 하나로 확인되었습니다. AMR의 급속한 진화와 전 세계적인 확산은 이와 관련된 건강 비용 측면에서 인간의 건강과 세계 경제에 대한 가장 큰 위협 중 하나입니다1. 항생제의 남용과 오용은 AR의 증가로 이어졌습니다. 이것은 COVID-19 대유행에 의해 강조되었으며, 그 동안 많은 경우 관련 2 차 감염의 치료가 영향을받은 환자의 AMR로 인해 크게 손상되었습니다2. 인간에 의한 항생제의 직접적인 사용 / 오용 외에도 농업 및 축산업에서 항생제의 남용 및 오용과 수역을 포함한 환경으로의 부적절한 배출이 주요 관심사입니다3. 박테리아에서 새로운 내성 특성과 다제 내성의 증가는 AR의 발달과 보급으로 이어지는 요인에 대한 더 나은 이해의 필요성을 시급히 강조합니다. 플라스미드와 같은 이동성 유전 요소에 종종 여러 AR 유전자 (ARG)를 운반하는 여러 항생제 내성 박테리아는 이러한 내성 유전자를 잠재적 인 인간 병원체를 포함한 비 내성 미생물로 전달할 수 있으므로 최후의 수단 항생제로도 치료할 수없는 슈퍼 버그가 출현 할 수 있습니다4. 이러한 여러 항생제 내성 박테리아는 물 생태계에 존재하는 경우 물고기, 게 및 연체 동물과 같은 오염 된 수성 식품의 섭취를 통해 인간의 장에 직접 들어갈 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 자연적으로 발생하는 수계에서 AR 박테리아의 확산은 식수를 포함한 다른 물 공급에도 도달 할 수 있으므로 인간 먹이 사슬에 들어갈 수 있습니다 5,6,7.

본 연구의 목적은 인도 뭄바이의 수역에 존재하는 총 박테리아 다양성 및 다양한 ARG의 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻기 위해 배양 기반 및 비 배양 기반 (전체 메타 게놈 분석) 기술의 조합을 사용하는 포괄적 인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 전통적으로 배양 기반 기술은 수역의 박테리아 다양성을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 가능한 미생물은 모든 틈새 시장에서 전체 미생물총의 작은 비율에 불과하므로 박테리아 다양성의 전반적인 상태와 모든 샘플에 만연한 다양한 내성 특성을 더 잘 이해하려면 다양한 배양 기반 및 배양 독립적 기술을 함께 사용해야 합니다. 이러한 강력하고 신뢰할 수 있는 배양 독립적 기술 중 하나는 전체 메타게놈 DNA 분석입니다. 이 고 처리량 방법은 박테리아 다양성 또는 다양한 ARG 8,9의 기능 주석에 대한 다양한 연구에서 성공적으로 활용되었습니다. 이 기술은 메타게놈(샘플의 전체 유전 물질)을 다양한 분석을 위한 출발 물질로 사용하므로 배양 독립적입니다. 본 연구의 프로토콜은 물 샘플에서 전체 박테리아 다양성 및 다양한 ARGs(resistome)에 대한 정보를 얻기 위해 전체 메타게놈 DNA 분석에 사용될 수 있다.

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프로토콜

1. 샘플 수집 및 처리

  1. 샘플 수집
    1. 멸균 시료 용기에 적절한 양의 물 시료를 수집하여 용기의 3/4 이하가 채워지지 않도록하십시오.
    2. 수집 후 가능한 한 빨리 무균 조건에서 샘플을 실험실로 운반하고 즉시 처리하십시오.
  2. 샘플 처리
    1. 멸균 모슬린 천을 통해 물 샘플을 무균 여과하여 미립자 물질을 제거합니다.
    2. 추가 분석을 위해 여과된 물의 적절한 연속 희석을 수행합니다.

2. 총 박테리아 부하 및 항생제 내성 박테리아 수 추정

  1. 총 박테리아 부하의 결정
    1. R2A 한천 18.12g, 변성 분말을 이중 증류수 1,000mL에 현탁하고 가열하여 용해시킵니다. 용해된 혼합물을 121°C, 15psi에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 적절한 양의 오토클레이브 혼합물을 멸균 페트리 플레이트에 부어 R2A 한천, 변형 플레이트를 준비합니다(예: 90mm 멸균 페트리 플레이트에 약 20mL의 오토클레이브 멸균 배지 추가).
    2. 여과된 물 샘플의 적절한 희석액 100μL를 R2A 한천에 고르게 펴고 매체가 응고되면 수정된 플레이트에 뿌립니다. 실험을 반복적으로 수행하십시오.
    3. 위의 모든 플레이트를 35-37 ° C에서 48 시간 동안 배양합니다 (분리에 사용되는 배지에 따라 온도 및 배양 시간이 다름).
    4. 방정식 (1)을 사용하여 밀리리터당 집락 형성 단위(CFU/mL)로 총 박테리아 부하를 표현합니다.
      figure-protocol-1(1)
  2. AR 박테리아 수 측정
    1. 2.1.1-2.1.4 단계를 따르십시오. 그러나 R2A 한천, 변형 플레이트 대신 R2A 한천, 수정 플레이트는 5 가지 항생제, 즉 세포 탁심 (3 μg / mL), 시프로플록사신 (0.5 μg / mL), 에리스로 마이신 (20 μg / mL), 카나마이신 (15 μg / mL) 및 반코마이신 (3 μg / mL).
    2. 2.2.1단계에서 언급한 최종 항생제 농도를 달성하기 위해 20mL의 멸균 용융 R2A 한천, 변형된(용융된 R2A 한천의 온도로, ≤40°C에서 수정된) 2mL가 포함된 튜브에 항생제를 별도로 추가합니다.
    3. 균일하게 혼합하기 위해 소용돌이 치고 한천이 고형화되기 전에 멸균 페트리 플레이트에 붓습니다. 실험을 반복적으로 수행하십시오.
    4. 위의 모든 플레이트를 35-37 ° C에서 48 시간 동안 배양합니다 (다른 배지를 사용하는 경우 온도 및 배양 시간이 다를 수 있음).
    5. 품질 관리 및 항생제의 효능 확인을 위해 대장균 ATCC 25922 및 황색포도상구균 ATCC 29213 균주의 박테리아 현탁액 100μL를 각각의 항생제 함유 R2A 한천, 변형 플레이트에 퍼뜨립니다(접종에 사용된 신선한 배양의 밀도가 600nm에서 OD = 0.5인지 확인).
    6. 2.1.4단계에 설명된 대로 CFU/mL 측면에서 항생제 내성 박테리아 수를 결정합니다.
  3. 분리 물의 글리세롤 재고
    1. 형태학적으로 구별되는 AR 콜로니를 선택합니다.
    2. 단일 단리된 콜로니를 각각의 항생제를 함유하는 멸균 루리아-베르타니 브로스 2 mL에 현탁시킨다(예를 들어, 콜로니가 세포탁심이 함유된 플레이트로부터 선택된 경우, 단계 2.3.1로부터의 콜로니를 각각의 농도로 세포탁심이 함유된 멸균 루리아-베르타니 브로스에 접종한다).
    3. 접종된 튜브를OD600 이 0.5에 도달할 때까지 80rpm에서 37°C에서 인큐베이션한다.
    4. 무균 조건 하에 단계 2.3.3으로부터의 배양 현탁액 750 μL를 멸균된 100% 글리세롤 250 μL에 혼합함으로써 분리물의 글리세롤 스톡을 준비한다.
    5. 추가 분석이 있을 때까지 글리세롤 스톡을 -80°C에서 보관하십시오.
      참고: 글리세롤 스톡에서 배양물을 되살리려면 글리세롤 스톡을 4°C에서 해동합니다. 이 스톡의 루프를 각 항생제가 들어 있는 멸균 Luria-Bertani 브로스 2mL에 접종하고 성장시킵니다.

3. 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 의한 배양 가능한 박테리아 확인

  1. PCR을 위한 분리물로부터 DNA 주형의 제조
    참고: 박테리아로부터 조질 DNA를 분리하기 위한 PCR용 DNA 주형의 제조에 대해 설명된 프로토콜은 Carlson et al.10에 의해 제공됩니다.
    1. 멸균 이쑤시개를 사용하여 페트리 플레이트에서 자라는 분리 물의 단일 격리 된 순수한 식민지를 취하십시오. 박테리아 콜로니를 멸균 미세 원심분리 튜브의 멸균 이중 증류수 100μL에 현탁하고 10분 동안 끓입니다.
    2. 현탁액을 10,000×g에서 2 분 동안 원 심분리하여 파편을 펠릿화하고 상청액을 새로운 멸균 미세원심분리 튜브로 옮겨 원유 DNA 주형으로 사용합니다.
  2. 16S rRNA 유전자의 V3 영역의 표적 PCR 증폭 및 염기서열분석
    1. 표 1에 언급된 바와 같이 PCR 증폭을 위해 PCR 튜브에서 40 μL의 반응 혼합물을 준비한다.
      알림: DNA 준비는 오염 가능성을 최소화하면서 얼음 블록에서 수행해야합니다 (시약을 취급하는 동안 장갑을 착용하고 70 % 에탄올로 작업 표면을 철저히 청소하십시오).
    2. 튜브를 열 블록에 놓고 PCR 열 순환기에서 적절한 프로그램을 실행합니다. 표준화된 PCR 사이클링 조건 및 16S rRNA 유전자의 V3 영역의 증폭을 위한 프라이머 정보는 표 2 를 참조한다.
    3. 앰플리콘을 분해하고 시각화하기 위해, 아가로스 겔 전기영동(AGE)을 수행한다. 증폭된 PCR 산물 10μL와 6x 겔 로딩 완충액 2μL(표 3)를 혼합하고, 이 혼합물을 1.5% 아가로스 겔(100mL의 1x TAE 완충액[표 3]에 1.5g의 아가로스 분말 100mL에 용해)의 웰에 로드하고(100mL의 10mg/mL 에티듐 브로마이드(EtBr) 5μL를 함유하는 아가로스 겔 100mL에 0.5μg/mL EtBr의 최종 농도가 되도록 합니다.
      주의 : EtBr은 강력한 발암 물질입니다. EtBr 및 EtBr이 포함된 젤을 취급하는 동안 항상 장갑을 착용해야 합니다.
    4. 앰플리콘의 크기를 추정하기 위해 DNA 사다리를 추가합니다.
    5. TAE 탱크 버퍼에서 80-100 V에서 겔의 전기 영동을 수행하십시오.
    6. 추적 염료가 겔의 3/4을 실행하면 전기 영동을 중지하고 UV 투과 조명기 아래에서 앰플리콘 밴드를 시각화합니다.
    7. 분리물을 확인하기 위해 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 위한 PCR 산물(앰플리콘)을 사용합니다.
    8. 앰플리콘을 식 (2)를 사용하여 분광 광도계 분석을함으로써 정량화한다.
      figure-protocol-2(2)
    9. DNA의 순도를 확인하려면 A260/A280의 비율을 계산하십시오.
      참고: 이상적으로 이 숫자는 1.5 이상이어야 하며 가급적이면 1.8에서 2.0 사이여야 합니다.
    10. 분리를 식별하려면 적절한 정렬 검색 도구를 사용하여 얻은 서열을 서열 데이터베이스와 비교하십시오.

4. 항생제 감수성 검사를 이용한 분리균주의 항생제 내성 검출

알림: 이 프로토콜은 디스크 확산에 의한 항생제 감수성 검사(AST) 방법을 설명합니다. 다음 항생제 디스크가 사용되었다 : 세포 탁심 (5 μg), 암피실린 (10 μg), 레보플록 사신 (5 μg), 클로람페니콜 (30 μg), 티게 사이클린 (15 μg), 세프 트리 악손 (30 μg), 이미 페넴 (10 μg), 겐타 마이신 (10 μg), 네오 마이신 (10 μg), 트리 메토 프림 (5 μg) 및 시프로플록사신 (5 μg).

  1. AST 접종 물의 준비
    1. Luria-Bertani 액체(항생제 없이)와 같은 멸균 비선택적 배지 2mL에 멸균 루프를 사용하여 단일, 단일, 단균, 단독, 단균 접종, 80rpm으로 37°C에서 밤새 배양합니다.
    2. 신선한 비선택적 Luria-Bertani 브로스 배지 2mL에 100-150μL의 하룻밤 재배 배양물(약 OD 600 = 1.8-2.0)을 취하여 재현탁하고 2-4시간 동안 배양합니다(OD 600이 0.4-0.5에 도달할 때까지).
    3. 배양 밀도가 대략 1-2 × 108 cells/mL에 해당하는 0.5 McFarland 표준(대략 OD600 = 0.1)과 같도록 멸균된 0.85% 식염수를 사용하여 이 새로 성장한 배양 현탁액을 희석합니다.
    4. 균등한 세포 분포를 위해 박테리아 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
    5. 희석 후 15분 이내에 위의 현탁액을 사용하십시오.
  2. 한천 플레이트의 접종
    1. 1,000mL의 이중 증류수에 38g의 MHA를 혼합하여 AST를 수행하기 위한 Mueller-Hinton Agar(MHA) 플레이트를 제조하고 혼합물을 가열하여 용해시킵니다. 용해된 혼합물을 121°C, 15psi에서 15분 동안 오토클레이브한다.
    2. 플레이트의 MHA 깊이가 4mm(플레이트당 배지 25mL)인지 확인합니다.
    3. 동시에 냉동실에서 항생제 디스크를 꺼내 실온으로 따뜻하게하십시오.
      알림: 항생제 디스크는 처음에 디스크를 4°C에서 해동하고 나중에 실온에서 해동하여 디스크에 응결될 수 있는 잠재적 위험을 줄여 점차적으로 해동해야 하며, 이는 이후에 억제 영역(ZOI)에 영향을 미칠 수 있습니다.
    4. 무균 조건에서 멸균 면봉을 4.1단계에서 준비한 접종물에 담그고 플레이트의 과다 접종을 피하기 위해 과도한 현탁액을 제거합니다.
    5. MHA 플레이트의 상단에서 시작하여 가장자리에서 가장자리로 앞뒤로 플레이트에 균등하게 배양액을 펼칩니다. 면봉으로 접시를 60° 회전합니다.
  3. 항생제 디스크의 적용
    1. 화염 멸균 된 집게의 도움으로 항생제 디스크를 접종 된 MHA 플레이트에 무균 적으로 옮기고 디스크를 부드럽게 눌러 한천과 완전히 수평으로 접촉하도록합니다.
      알림: 이 절차는 플레이트에 배양액을 접종한 후 15분 이내에 완료해야 합니다.
    2. 억제 영역이 겹치지 않도록 유기체, 사용 된 항생제 및 플레이트의 크기를 고려하여 한천 플레이트에 적절한 수의 항생제 디스크를 놓습니다.
      참고: 90mm 원형 플레이트에 4-5개의 디스크를 수용할 수 있습니다.
  4. 플레이트의 부화
    1. 항생제 디스크를 적용한 후 15분 이내에 플레이트를 뒤집고 37°C에서 밤새 배양합니다.
  5. 결과의 해석
    1. 밀리미터(mm) 단위의 ZOI 직경을 측정하고 EUCAST11에서 제공한 중단점 값에 따라 해석합니다. 아래에 제공된 두 가지 예를 참조하십시오.
      1. 엔테로박테랄레스에 대한 시프로플록사신 항생제 디스크(5μg)의 영역 직경 중단점(mm)은 S ≥ 25 및 R < 22이며, 이는 ZOI가 25mm인 경우 민감한(S) 것으로 간주되는 반면 ZOI가 22mm≥< 경우 내성(R)인 것으로 간주됩니다. ZOI 직경이 22와 25 사이에 있으면 분리물은 중간(I)으로 간주됩니다.
      2. 포도상 구균 종에 대한 클로람페니콜 항생제 디스크 (30 μg)의 영역 직경 중단 점 (mm)은 S ≥ 18 및 R < 18이며, 이는 ZOI가 18mm ≥이면 민감한 것으로 간주되고 ZO
    2. 분리물이 노출된 총 항생제 수에 대한 분리물이 내성인 항생제 수의 비율을 찾아 다중 항생제 내성(MAR) 지수를 결정합니다.
      참고: 품질 관리를 위해 대장균 ATCC 25922 및 S. 포도상구균 ATCC 29213은 단계 4에서와 같이 프로토콜을 따르는 기준 균주로서 사용된다.

5. 분리주에서 항생제 내성 유전자의 PCR 기반 검출

  1. 분리기에서 ARG를 식별하기 위해 표준 PCR 프로토콜을 사용합니다. 단계 3.1에 제공된 프로토콜을 사용하여 DNA 주형을 준비합니다.
    참고: 본 연구에 사용된 PCR 사이클링 조건은 94°C에서 10분, 이어서 94°C에서 35사이클, 적절한 온도에서 30초 동안 어닐링(각 프라이머 세트에 대해 표준화된 대로), 72°C에서 40초 동안 연장, 및 72°C에서 5분 동안 최종 연장이었다. 반응 혼합물은 표 4에 기재되어 있다. ARG, 프라이머 및 어닐링 온도의 목록은 표 5에 나와 있습니다.
  2. 앰플리콘의 순도를 해결, 시각화 및 확인하려면 3.2.3-3.2.10단계를 따르십시오.

6. 전체 박테리아 다양성의 확인 및 메타게놈의 ARG 검출을 위한 전체 메타게놈 DNA 분석

  1. 물 샘플에서 총 DNA(메타게놈) 추출
    1. 여과된 물 샘플에서 메타게놈 DNA를 추출합니다.
      참고: 현재 연구에서 메타게놈 DNA(총 DNA)는 제조업체의 프로토콜에 따라 참조된 DNA 분리 키트를 사용하여 여과된 물 샘플에서 추출되었습니다( 재료 표 참조).
    2. 추출된 메타게놈 DNA 3μL를 0.8% 아가로스 겔에 로딩하여 DNA의 품질을 확인하고, 80-110V에서 약 30분 동안 겔을 실행한다.
    3. 손상되지 않은 단일 밴드가 있는지 확인하십시오.
    4. 형광계를 사용하여 DNA 농도를 확인하십시오.
  2. 전체 메타게놈 DNA 시퀀싱을 사용한 박테리아 다양성 측정 및 ARG 검출
    1. 라이브러리 준비 및 PCR 증폭:
      1. 참조된 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 쌍단 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다( 재료 표 참조).
      2. 200ng의 DNA를 취하여 기계적으로 더 작은 조각으로 전단하여 어댑터 결찰을 위해 DNA를 준비한 다음 3' 끝에 "A"를 추가하는 연속 최종 수리 단계를 수행합니다.
      3. 시퀀싱에 사용되는 플랫폼에 따라 DNA 단편의 양쪽 끝에 특정 어댑터를 결찰합니다.
        참고: 이중 바코드 라이브러리를 시퀀싱을 위해 플로우 셀에 바인딩하는 데 중요한 시퀀스가 이러한 어댑터에 있습니다. 이는 어댑터-라이게이션된 단편의 PCR 증폭 및 표준 시퀀싱 프라이머 결합을 허용한다.
      4. 품질과 양을 확인하려면 제조업체의 지침에 따라 고감도 DNA 칩을 사용하여 증폭된 라이브러리를 분석합니다.
    2. 클러스터 생성 및 시퀀싱:
      1. 증폭된 라이브러리를 클러스터 생성 및 후속 시퀀싱을 위해 적절한 시퀀싱 플랫폼에 로드합니다.
        참고: 라이브러리 분자는 쌍단 유동 셀의 상보적인 어댑터 올리고에 결합합니다. 시퀀싱 동안, 정방향 가닥은 역 가닥의 재합성 후에 선택적으로 절단된다. 이 복사 된 역 가닥은 조각의 반대쪽 끝에서 시퀀싱됩니다.
    3. 생물 정보학 분석 :
      1. 적절한 플랫폼을 사용하여 고품질 데이터에서 스캐폴드를 생성합니다.
      2. ARG의 분류 학적 분류 및 식별을위한 생물 정보학 분석에 이러한 스캐 폴드를 적용합니다.
        참고 : 전체 박테리아 다양성을 식별하고 메타 게놈에서 ARG를 검출하기위한 전체 메타 게놈 DNA 분석을위한 워크 플로는 그림 1에 나와 있습니다. 원고에 설명 된 전체 방법론의 흐름표는 그림 2에 나와 있습니다.

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결과

총 박테리아 부하 및 항생제 내성(AR) 박테리아 수
총 박테리아 부하의 열거는 R2A Agar, Modified 배지에 물 샘플의 10-4 내지 10-6 배 희석액을 확산시킴으로써 수행되었다. AR 박테리아 수의 열거를 위해 항생제가 들어있는 배지 플레이트에 10-3-10-6 배 희석액을 뿌렸습니다 (그림 3). 총 및 AR 박테리아 수는 CFU/mL로 계산되었으며 모든 도금 실험은 중복으로 수행되었습니다. 위의 프로토콜에 따라 본 연구에서는 총 박테리아 수가 3.0 × 109 CFU/mL임을 보여주었습니다. AR 박테리아 부하는 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL 범위에서 높은 것으로 나타났습니다(표 6).

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토론

샘플 수집 및 처리는 중요한 역할을하며 연구 결과 및 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 샘플의 변동성을 배제하려면 연구중인 담수 체의 여러 위치에서 샘플링을 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 샘플을 취급할 때 적절한 무균 환경 조건을 유지하면 오염을 방지할 수 있습니다. 또한, 추출된 핵산의 품질 및 양에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 조성의 변화를 방지하기 위해, 통과 조건은 샘플 수집 시점부터 후속 처리까지 최소한의 시간 경과로 4°C로 유지되어야 합니다. 여러 연구에서 샘플 수집과 처리 사이의 중간 기간이 신중하게 수행되지 않으면 분석의 후반 단계에서 다양한 결과를 얻을 수 있다고 강조했습니다12,13.

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공개 사항

저자는 공개할 상충되는 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

이 작업은 뭄바이 대학의 과학 기술-대학 연구 및 과학 우수성 진흥 (DST-PURSE) 계획의 재정 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. Devika Ghadigaonkar는이 계획에 따라 프로젝트 펠로우로 일했습니다. 과학 기술부-과학 및 공학 연구위원회 (DST-SERB) 프로젝트 번호 : CRG / 2018 / 003624의 선임 연구원 인 Harshali Shinde가 제공 한 기술적 도움을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 bp DNA ladderHimediaMBT049-50LN앰플리콘
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RPCR 반응 혼합물 제조용
37 ° C 인큐베이터GS-192, Gayatri ScientificNA박테리아 배양용
6x 겔 로딩 버퍼HiMediaML015-1ML로딩 및 추적 염료 DNA 샘플의 무게를 줄이고 전기영동 진행 상황을 추적하는 데 도움이 되는 아
가로스 분말HimediaMB229-50G아가로스 젤 전기영동(AGE) 중 앰플리콘 분해용
암피실린 항생제 디스크HiMediaSD002AST 수행을 위해
EquitronNA매체, 유리판, 시험관 등의 살균에 필요
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesNA증폭 라이브러리의 품질과 수량을 확인하기 위해
Bisafety B2 CabinetIMSETIMSET BSC-Class II Type B2박테리아 배양, AST 등과 같은 미생물 작업에 사용됩니다.
Cefotaxime 항생제 디스크HiMediaSD295E-5VLAST
Cefotaxime 항생제 분말HiMediaTC352-5G항생제 내성 박테리아 분리 시 필요한 항생제 원액 준비용
Ceftriaxone 항생제 디스크HiMediaSD065AST
원심분리기 MinispinEppendorfMinispin Plus-5453 수행용조잡한 DNA 준비 중 파편을 펠릿화하는 데 사용
클로람페니콜 항생제 디스크HiMediaSD006-5x50DSAST
Ciprofloxacin 항생제 디스크HiMediaSD060-5x50DSAST
Ciprofloxacin 항생제 분말HiMediaTC447-5G항생제 내성 분리 시 필요한 항생제 저장 용액 준비용 bacteria
ColorimeterQuestNA배양 현탁액의 OD 확인용
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) 데이터베이스ARG의 기능 주석; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker IncubatorBTL41 Allied ScientificNA박테리아 배양을 위한 미디어 플레이트 배양용
Deep Freezer (-40 ° 다) HaierDW40L, Haier Biomedicals글리세롤 주식 보관용
DNA 라이브러리 준비 키트NEB Next Ultra DNA 라이브러리 준비 키트 IlluminaNA쌍단 염기서열분석 라이브러리 준비
EDTAHiMediaGRM1195-100G아가로즈 젤 전기영동(AGE)용 겔 러닝 버퍼 준비용
전기영동 장치TechResource15cm 겔 주조 트레이아가로스 젤을 만들기 위해  그리고 전기영동을 수행한다 
전기영동 전극이 있는 파워 팩GeneiNAAGE를 실행하기 위한 
에리스로마이신 항생제 디스크HiMediaSD222-5VLAST 수행용
에리스로마이신 항생제 분말HiMediaCMS528-1G항생제 내성 박테리아 격리 시 필요한 항생제 원액 준비용
에리스로마이신 항생제 분말HiMediaTC024-5G항생제 내성 분리 시 필요한 항생제 원액 준비용 박테리아
대장균 ATCC 25922       HiMedia0335X-1AST 수행 중 대조군으로 사용
롬화 에티듐HiMediaMB071-1G에서 전기영동 후 DNA의 삽입제 및 시각화
메타게놈
DNA 겔 문서화 시스템BioRad의 농도 측정을 위한 용도전기영동 후 PCR 앰플리콘을 시각화하는 데 사용됩니다
겐타마이신 항생제 디스크HiMediaSD170-5x50DSAST
빙하 아세트산HiMediaAS119-500ML아가로스 젤 전기영동(AGE)을 위한 젤 러닝 버퍼 준비용
글리세롤HiMedia GRM1027-500ML글리세롤 스톡
만들기 이미페넴 항생제 디스크HiMediaSD073AST
Kaiju DatabaseNANA 판독 분류학적 분류를 위해; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin 항생제 디스크HiMediaSD017-5x50DSAST
Kanamycin 항생제 분말HiMediaMB105-5G항생제 내성 박테리아 분리 시 필요한 항생제 원액 준비
레보플록사신 항생제 디스크HiMediaSD216-5VLAST 수행용
Luria Bertani 국물HimediaM1245-500G배양 농축용
McFarland 표준HimediaR092-1No배양 현탁액의 밀도를 비교하려면
분자 생물학 물HiMediaTCL018-500MLPCR 반응 혼합물
을 만들기 위해뮬러-힌튼 한천 (MHA) HiMediaM173-500G항생제 감수성 검사 (AST)를 수행하기 위해,
Neomycin 항생제 디스크HiMediaSD731-5x50DS를 수행하기 위해, AST
PCR 그라디언트 열 순환기, EppendorfMastercycler, Nexus 그라디언트 230V/50-60 Hz를 수행하기 위해 16S rRNA 영역 및 다양한 항생제 내성 유전자의 증폭을 위한 PCR 수행에 사용됩니다.
입문서 XcelrisNAPCR 증폭 
R2A 한천, 수정된HiMediaM1743총 및 항생제 내성(AR) 박테리아 부하의 분리를 위한 미디어 플레이트 준비용
스캐폴드 생성CLC Genomics Workbench 6.0NA스캐폴드 생성용
Sequencer Illumina 플랫폼(2 x 150 bp 화학)NA증폭 라이브러리
기서열 분석 염화나트륨 HiMediaTC046-500G물 샘플을 연속적으로 희석하기 위한 0.85% 식염수 준비용
토양 DNA 분리 키트XcelgenNA여과수 샘플에서 전체 메타게놈 DNA를 추출하기 위해 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365P수행하는 동안 대조군으로 사용됨
문에서 속 수준까지 다양한 분류 그룹으로 읽기를 분류하기 위해 
포괄적인 항생제 내성 데이터베이스(CARD)NAARG의 기능 주석용
Tigecycline 항생제 디스크HiMediaSD278AST
Trimethoprim 항생제 디스크HiMediaSD039-5x50DSAST
Tris base수행용 HiMediaTC072-500GAgarose Gel용 젤 러닝 버퍼 준비 전기영동(AGE)
반코마이신 항생제 분말HiMediaCMS217항생제 내성 박테리아 분리 시 필요한 항생제 원액 준비용
저울Mettler ToledoME204 Mettler Toledo배지 분말, 시약 분말 등의 계량에 사용됩니다.
NA - 해당 없음
수행 , 브, , 겔 문서화 시스템 형광계 Qubit 2.0 NA 추출된 수행 염 AST Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA를

참고문헌

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139(2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180(2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592(2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350(2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173(2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062(2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356(2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).

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