방법 논문

흉부외과 수술을 위한 사춘기 마우스 강아지의 마취 및 삽관

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DOI:

10.3791/64004

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2022년 6월 2일

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1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

생후 >7일 된 마우스의 흉부외과 모델은 삽관이 필요하지만 사춘기(8-14일령) 마우스 새끼에게는 어렵고 삽관을 위한 마취 요법에 대한 정보는 거의 없습니다. 여기에서는 동물 사망률을 최소화하면서 기관 내 삽관을 허용하는 10일 된 C57BL/6J 마우스 새끼의 케타민/자일라진/아트로핀 투여 요법을 제시합니다.

초록

쥐 수술 모델은 전임상 연구에서 중요한 역할을 합니다. 심장 손상 후 심근 재생에 대한 기계 론적 통찰력은 0-14 일 된 마우스의 흉부 수술 모델에서 얻을 수 있으며, 심근 세포는 성인과 달리 증식 능력을 유지합니다. 최대 7 일 된 마우스 새끼는 저체온증에 의해 효과적으로 고정되며 흉부 수술을위한 삽관이 필요하지 않습니다. 그러나 사춘기(8-14일령) 쥐 새끼는 삽관이 필요하지만 이것은 어렵고 삽관을 용이하게 하기 위한 마취에 관한 정보가 거의 없습니다. 여기에서는 동물 사망률을 최소화하면서 기관 내 삽관을 허용하는 10일 된 C57BL/6J 마우스 새끼의 케타민/자일라진/아트로핀 투여 요법을 제시합니다. 체중에 대한 케타민 / 자일 라진 / 아트로핀 투여 요법의 경험적 적정은 체중이 다른 마우스 새끼의 마취에 대한 반응이 비선형 적임을 나타 냈으며, 이에 따라 20 / 4 / 0.12 mg / kg, 30 / 4 / 0.12 mg / kg 및 50 / 6 / 0.18 mg / kg의 용량은 3.15-4.49 g (n = 22), 4.50-5.49 g (n = 20) 및 5.50-8.10 g (n = 20) 사이의 강아지의 삽관을 촉진했으며, 각각. 체중이 낮은 새끼는 무거운 새끼보다 삽관 시도가 더 필요했습니다(p < 0.001). 삽관 후 생존은 체중과 상관 관계가 있었다 (저체중, 중간 및 고체중 그룹의 경우 각각 59 %, 70 % 및 80 %, R2 = 0.995). 삽관 후 심근 경색 수술의 경우, 100 % 산소 중 4.5 % 이소 플루 란으로 마취 수술면을 유도하고 100 % 산소 중 2 % 이소 플루 란으로 유지시켰다. 수술 후 생존율은 92%, 86%, 88%에서 세 체중 그룹에서 유사했습니다(p=0.91). 삽관 및 수술을 위한 동물 취급 관행의 개선과 수술 후 댐에 의한 식인 최소화와 함께 전체 절차(삽관 및 수술)에 대한 전체 생존은 체중과 상관관계가 있었습니다(저체중, 중체중 및 고체중 그룹의 경우 각각 55%, 60% 및 70%,R2 = 0.978). 10 일 된 강아지의 삽관으로 인한 어려움과 관련 높은 사망률을 감안할 때 10 일 된 강아지의 흉부 수술은 체중이 5.5g 이상인 강아지로 제한하는 것이 좋습니다.

서론

뮤린 모델은 전임상 흉부외과 연구에서 매우 귀중한 도구이며, 특히 유전자 조작된 마우스 라인이 생성될 수 있는 용이성 때문에, 또한 예를 들어심장 손상 후 심근 재생의 연구를 허용하는 병리학적 질병 모델을 제공하기 위해 마우스를 외과적으로 조작할 수 있는 용이성 때문에1 . 이와 관련하여 심근 세포가 세포주기에서 빠져 나간 성인 마우스와 달리 0-2 일 된 신생아 마우스 심장은 정점 절제술 또는 심근 경색유도 후 최소한의 흉터로 복구됩니다 2,3,4. 대조적으로, 생후 7일 된 신생아 심장은 불완전하게 재생되어 흉터 발생률이 더 높습니다 2,3. 좌심실 정점의 심근 세포는 출생 후 최대 2 주 동안 증식 능력을 유지하기 때문에 0-14 일 된 마우스에서 심장 손상 후 재생에 대한 기계 론적 연구는 손상된 성인 심장의 재생을위한 치료 표적을 식별하는 데 유익 할 수 있습니다5.

심장 손상의 마우스 모델의 개발에는 마취하에 외과 적 조작이 포함됩니다. 이를 위해서는 일반적으로 삽관과 기계적 환기가 필요한 심장에 접근하기 위해 흉부를 열어야 합니다. 마우스 긴장, 체중 및 연령 영향 마취제에 대한 민감도6. 성체 마우스는 광범위한 약제로 마취될 수 있으며, 삽관을 위한 일반적인 요법은 100/13/0.5mg/kg 6,7에서 케타민/자일라진/아트로핀입니다. 신생아 마우스 (0-7 일령)는 중앙 통증 반사가 부족하고 얼음에 효과적으로 고정되어 삽관없이 수술을받을 수 있습니다 6,8,9. 사춘기 (8-14 일된) 마우스 새끼는 저체온증으로 마취 할 수 없습니다 9,10; 흉부 수술을 위해 삽관이 필요합니다. 생후 14일 미만의 사춘기 마우스에서 흉부외과 수술에 대한 이전 연구는 없습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 14 일령 미만의 이소 플루 란 마취 된 사춘기 마우스의 삽관은 어렵습니다. 7일 이상 된 마우스에 대해 보고된 권장 주사 가능한 마취 요법은 50-150mg/kg 케타민 및 5-10mg/kg 자일라진10입니다. 사춘기 마우스는 여전히 신경학적으로 발달하고 있으며 약물 및 약물 대사에 대한 반응은 성인 동물과 매우 다릅니다6. 이것은 체액, 전해질 및 산-염기 불균형의 위험을 증가시킬 뿐만 아니라 제한된 에너지 저장을 빠르게 고갈시키는 높은 대사율뿐만 아니라 체온 조절 미성숙으로 인해 저혈당 및 저체온증의 위험을 증가시킵니다6,11,12. 따라서 삽관을 촉진하고 사춘기 마우스의 생존을 극대화하는 마취 요법에 대한 정보는 거의 없습니다.

여기에서 우리는 10-57g 범위의 C57BL/6J 마우스 새끼에서 케타민/자일라진/아트로핀의 투여 요법을 경험적으로 적정하여 동물 사망률을 최소화하면서 후속 흉부 수술을 위한 기관 내 삽관을 허용하기에 충분한 마취 평면을 달성했습니다. 우리는 또한 삽관, 수술 및 수술 후 산모 식인 풍습으로 인한 사망률을 줄이기 위해 동물 취급 관행을 개선했습니다.

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프로토콜

설명 된 모든 동물 실험은 과학적 목적을위한 동물 관리 및 사용에 대한 호주 실천 강령 및 REACH 지침에 따라 Garvan / St Vincent 's Hospital 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 모든 실험은 소아 마취 전문의 (JJS)의지도하에 숙련 된 소형 동물 외과 의사 (JW)가 수행했습니다.

1. 악기 준비

  1. 수술 당일, 생후 10일 된 강아지의 삽관을 위한 특수 장비를 설치하세요(그림 1A,B). 여기에는 온난화 램프, 삽관 플랫폼, 광섬유 조명, 작은 집게, 직경 0.02mm의 구리선 조각으로 만든 후두경(길이 60mm, 와이어 끝이 직경 3mm의 원으로 모양 175°; 도 1B), 및 기관내 튜브로서 사용되는 24-게이지 플라스틱 정맥주사(i.v.) 캐뉼라를 포함한다.
  2. 캐뉼러가 21mm 플라스틱 암 루어 잠금 어댑터에 부착된 19mm 길이의 플라스틱 튜브(0.7mm OD)로 구성되어 있는지 확인합니다(그림 1B). 루어 잠금 어댑터를 통해 구리선 조각을 삽입하여 캐뉼러의 튜브를 강화합니다. 일회 호흡량이 ~130μL/g13,14인 마우스의 경우 총 부피가 130μL인 캐뉼러를 사용하십시오.

2. 생후 10일 된 쥐의 마취

  1. 수술 당일, 생후 10일 된 C57BL/6J 새끼의 케이지에서 댐을 제거하고 케이지를 온난화 패드(37°C)에 놓습니다.
  2. 0.5mL 인슐린 주사기와 29G 바늘을 사용하여 체중 g 당 10μL 씩 복강 내 주사하여 다양한 체중 그룹에 대해 표 1 에 자세히 설명 된 비율로 강아지를 마취합니다.
  3. 주사 직후, 강아지를 37 % 산소로 미리 산소가 공급 된 따뜻한 (100 ° C) 플렉시 유리 챔버에 넣습니다.

3. 생후 10일 된 마우스의 삽관

  1. 3-4 분의 산소 공급 후, 강아지를 본질적으로 성인 마우스와 마찬가지로 삽관을위한 플랫폼으로 옮깁니다. 강아지를 앙와위 자세(그림 1C)에 두거나 45° 각도로 매달아15로 이 작업을 수행합니다. 온난화 램프로 온도를 유지하십시오.
    1. 삽관 전에 발 핀치 반사에 의한 마취 깊이를 평가하십시오. 최적의 삽관을 위해서는 발 핀치 반사가 여전히 존재해야하지만 의식이있는 동물의 반사보다 현저하게 감소해야합니다.
  2. 마취된 강아지 앙와위를 삽관 플랫폼(그림 1C)에 고정한 후 작은 집게로 혀를 잡고 구리선으로 만든 후두경(그림 1B)을 사용하여 성문과 성대를 노출시킵니다. 유연한 광섬유 조명으로 트랜스 조명으로 성대의 시각화를 지원합니다 (그림 1D).
  3. 뻣뻣한 캐뉼러를 사용하여 루어 잠금 끝이 팁보다 약간 낮도록(~10°) 캐뉼러를 기울이고 성대가 분리되는 즉시 캐뉼러를 삽입하고 루어 잠금 어댑터가 입 바로 바깥에 올 때까지 전진합니다. 삽관 직후 와이어를 제거하십시오.
    참고: 캐뉼라가 너무 멀리 진행되지 않는 한 이 나이의 마우스에서는 삽관 중 저항이 예상되지 않으며 카리나에서 저항이 느껴집니다.
    1. 동물이 자발적으로 호흡 할 수있는 능력으로 삽관 후 마취의 깊이를 평가하십시오. 삽관 카테터를 잠시 막아 자발적으로 호흡하는 새끼의 성공적인 기관 삽관을 확인하여 가슴 움직임을 방해하는지 확인하십시오.
  4. 삽관된 강아지를 즉시 온난화 패드(37°C)로 옮기고 기관 내 캐뉼러를 100% 산소를 전달하는 인공호흡기에 연결합니다. 30μL/스트로크, 40μL/스트로크 또는 50μL/스트로크 각각 3.15-4.59g, 4.50-5.49g 또는 5.50-8.10g 강아지 및 150스트로크/분.
  5. 재호흡을 최소화하기 위해 <15초 이내에 이 절차를 빠르게 수행하십시오.

4. 생후 10일 된 마우스의 심근경색 수술

  1. 수술용 마취 수술면을 유도하려면 인공호흡기로 유입되는 가스를 산소 100% 산소에서 4.5% 이소플루란(이소플루란 농도는 기화기에 의해 결정됨)으로 4-5분 동안 전환합니다.
    1. 이소플루란으로 전환한 후 흉벽 움직임의 빈도가 인공호흡기의 움직임 빈도와 같은지 확인하여 기관 삽관을 다시 확인하십시오. 자발적 호흡 상실 후 꼬리 또는 발 핀치 반사가 없으면 마취 수술 평면에 도달했음을 나타냅니다 (4-5 분 후).
  2. 산소에서 2 % 이소 플루 란으로 마취를 유지하십시오.
  3. 16에 설명된 대로 수술용 현미경(10x 및 16x 대물렌즈)으로 심근경색 수술을 수행합니다.
    1. 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 70 % 알코올을 번갈아 가며 원을 그리며 피부를 여러 번 소독하십시오. 가는 가위를 사용하여 가슴의 왼쪽 측벽에있는 세 번째와 네 번째 갈비뼈 (네 번째 늑간 공간) 사이에 수평 피부 절개를하십시오. 가는 집게를 사용하여 늑간 공간을 무딘 해부로 흉부를 열고 견인기를 사용하여 공간을 열어 두십시오.
    2. 좌심방 부속기 바로 말단에 있는 좌관상동맥을 9-0 폴리프로필렌 모노필라멘트 봉합사로 결찰하여 심근경색을 유도한다. ~10분 경색 수술 후 7-0 프롤렌으로 피부를 닫고 절개 부위를 베타딘으로 소독합니다. 70 % 에탄올 또는 식염수로 강아지의 혈액을 청소하십시오.
      알림: 사춘기 새끼의 왼쪽 관상 동맥 결찰은 성인 결찰과 마찬가지로 본질적으로 무혈입니다.
    3. 0.5mL 인슐린 주사기와 29G 바늘로 차례로 투여하십시오 : 진정, 진통 (부 프레 노르 핀, 0.075mg / kg, 10μL, 피하) 및 식염수 (50μL, 복강 내)에서 빠른 회복을 위해 아티 파메 졸 (1-5mg / kg, 10μL, 복강 내).
  4. 이소플루란을 중단하여 동물이 회복되도록 합니다. 그 후 몇 분 이내에 자발적 호흡이 재개되도록 하십시오.
    1. 강아지를 예열 된 사전 산소 챔버로 되돌리고 올바른 반사가 회복 될 때까지 회복하는 동안 지속적으로 모니터링하여 강아지를 발관합니다.
    2. 강아지를 홈 케이지 침구로 부드럽게 문지르고, 강아지를 따뜻하게 유지하고, 호흡이 규칙적인지, 강아지가 자발적으로 움직일 수 있는지 확인하십시오. 이것은 댐에 의한 수술 후 식인 풍습을 줄일 것입니다.
  5. 모든 새끼가 마취에서 완전히 회복되면 댐을 새장으로 되돌립니다.
    알림: 한 강아지의 준비, 마취, 삽관, 수술 및 회복에 걸리는 전체 시간은 40-60분 사이입니다.
  6. 새장에서 하룻밤 동안 집 댐과 새끼를 37 ° C 온난화 패드에 절반 / 절반 떨어 뜨립니다.

5. 수술 후 경색 크기 평가

  1. 수술 후3 일째 에 새끼를 1mL / min 유속으로 산소 중 4.5 % 이소 플루 란으로 미리 평형 화 된 플렉시 유리 챔버에 넣어 마취시킵니다.
  2. 발 핀치 반사로 평가된 마취 수술 평면에 도달하면(4-5분 후) 강아지를 챔버에서 제거하고 꼬리를 테이핑하여 온난화 패드에서 앙와위 자세로 고정합니다.
  3. 앞니와 테이프 위에 실을 놓아 머리를 길게 펴고 인공 호흡기에 연결된 코 콘에 머리를 넣고 200 μL / 스트로크, 150 스트로크 / 분의 산소에서 4.5 % 이소 플루 란을 전달합니다. 산소에서 2 % 이소 플루 란으로 수술 마취면을 유지하십시오.
  4. 70 % 에탄올로 피부를 소독하십시오. 가는 가위를 사용하여 기관을 따라 오른쪽 총경동맥의 피부를 1cm 절개하고 단일 루멘 폴리에틸렌 튜브(OD 0.61mm, ID 0.28mm)를 사용하여 노출된 혈관을 캐뉼레이션하여 0.2mL의 헤파린화 식염수(200U)를 1분 동안 투여하여 혈액 응고를 방지합니다.
  5. 이완기 심장을 정지시키기 위해 2초 이내에 3.3M KCl 0.2mL를 빠르게 투여하기 전에 이소플루란을 산소에서 4.5%로 증가시킨다.
  6. 동일한 절개를 통해 오른쪽 경정맥을 해부하고 횡단합니다. 0.2mL의 인산완충식염수(PBS)로 심장을 관류한 다음 0.1mL의 0.2% 알시안 블루로 관류하여 경색되지 않은 원격 심근을 염색합니다. 경정맥을 통해 혈액, PBS 및 Alcian Blue의 세척으로 입증되는 성공적인 관류를 확인하십시오.
  7. 흉부를 열고 주변의 결합 조직과 혈관을 해부하여 심장을 절제하여 심장을 풀어줍니다. PBS로 심장을 헹구고, 원하는 경우 심방을 제거하고, 10x 대물렌즈를 사용하여 수술용 현미경에 장착된 카메라로 심장을 촬영합니다.

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결과

10 일 된 생쥐의 마취. 10 일 된 새끼는 4-5 분 안에 4.5 % 이소 플루 란으로 마취 될 수 있습니다. 그러나 삽관 준비 과정에서 마취에서 회복됩니다. 크기가 작기 때문에 표준 코 콘으로 전달되는 이소 플루 란 마취하에 삽관하는 것은 불가능합니다. 우리는 이전에 100 일 및 13 일 된 강아지와 성인0.5 일의 흉부 수술을 위해 각각 15 / 21 / 21 mg / kg의 케타민 / 자일 라진 / 아트로핀 마취 요법을 사용했습니다. 산소 보충을 포함한 예비 실험에서 50-150mg/kg 케타민과 5-10mg/kg 자일라진 10의 권장 주사 요법은10일 된 새끼에서 용납할 수 없는 사망률을 초래하는 것으로 나타났습니다. 생후 10일령 새끼의 체중과 깔짚 크기 사이의 역상관관계를 감안할 때(R2=0.250, p < 0....

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토론

현재 흉부 수술을 위해 10 일 된 마우스의 마취 및 삽관에 대한 잘 문서화 된 방법은 없습니다. 이를 위해 케타민/자일라진/아트로핀 투여 요법을 체중으로 적정하여 20/4/0.12mg/kg, 30/4/0.12mg/kg 및 50/6/0.18mg/kg의 용량은 각각 체중이 낮은(3.15-4.49g), 중간(4.50-5.49g) 및 높은(5.50-8.10g) 체중인 강아지의 삽관을 촉진했습니다. 삽관 후 생존은 체중과 상관 관계가 있습니다 (저체중, 중간 및 고체중 그룹의 경우 각각 59 %, 70 % 및 80 %). 10 일 된 강아지의 삽관의 어려움과 관련 높은 사망률을 감안할 때 10 일 된 강아지의 흉부 수술은 체중이 5.50g 이상인 동물로 제한하는 것이 좋습니다. 이 삽관 기술의 한계는 작업자의 기술과 경험, 그리고 얼마나 빨리 배울 수 있는지에 달려 있다는 것입니다. 그러나 성인 삽관 경험이 있는 작업자는 7-8마리의 새끼를 10마리 대상으로 연습한 후 사춘기 삽관에 능숙해질 수 있을 것으로 예상됩니다. 또 다른 한계는...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NHMRC 프로그램 보조금 [ID 1074386], Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research 보조금 [RMG] 및 RT Hall Trust [RMG & SEI]의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Atipamezole (Antisedan)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
Atropine 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Buprenorphine (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
광섬유 라이트Leica 3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLC버전 9.1.2
삽관 플랫폼 --대략적인 치수가 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H)
IsofluraneProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Ketamine 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
플라스틱 정맥 캐뉼라 24게이지 Polywin 안전성 BD 인사이드 CE008621mm 플라스틱 암 루어 잠금 어댑터에 부착된 19mm 길이의 플라스틱 튜브(0.7mm 외경); 환형 130 &mu의 총 부피; L
단 하나 루멘 폴리에틸렌 관Critchley 전기 제품 Pty 주식 회사 Auburn NSW외부 직경 0.61 mm의 안 직경 0.28 mm
작은 겸자F.S.T.NO 11051-10
수술용 현미경 (카메라 옵션)Leica M651 (Leica IC80 HD 카메라)10x 및 16x 대물
렌즈 봉합사 7-0 프롤렌Ethicon8708H
봉합사 9-0 폴리프로필렌 모노필라멘트Ethicon2813
V-1 능동 소기 이소플루란 마취 시스템이 있는 탁상용VetEquip901820
벤티드 2리터 플렉시글라스 인덕션 챔버VetQuip Pty Ltd94210225cm(L) x 13cm(W) x 11cm (H)
온난화 램프Brilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

참고문헌

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