이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
동물 모델에서 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)이 클러스터링되어 생리적 현상 연구를 위한 정확한 유전자 조작이 가능합니다. Zebrafish는 전체 장기 및 유기체 수준에서 유전성 질병, 발달 및 독성학과 관련된 수많은 질문을 연구하는 효과적인 유전 모델로 사용되었습니다. 주석이 잘 달리고 매핑된 제브라피쉬 게놈으로 인해 유전자 편집을 위한 수많은 도구가 개발되었습니다. 그러나 CRISPR을 사용하여 정확한 녹인 편집을 생성하는 효율성과 용이함은 제한 요소입니다. 여기에 설명된 것은 심장 재분극을 담당하고 전기 장애인 LQTS(Long QT 증후군)와 관련된 유전자에서 정밀한 편집을 간단하게 감지하는 CRISPR-Cas9 기반 녹인 접근 방식입니다. 이 2-단일 가이드 RNA(sgRNA) 접근법은 표적 서열을 절제 및 대체하고 유전적으로 암호화된 리포터 유전자를 연결합니다. 이 접근법의 유용성은 야생형 및 유전자 편집 제브라 피쉬 유충에서 심장 전기 기능의 비 침습적 표현형 측정을 설명함으로써 입증됩니다. 이 접근법은 전체 유기체에서 질병 관련 변이체의 효율적인 연구를 가능하게합니다. 또한, 이 전략은 리포터 유전자, 오르토로그 또는 유전자 편집자와 같은 외인성 선택 서열의 삽입 가능성을 제공합니다.
서론
동물 모델에서 CRISPR 기반 유전자 편집 전략을 사용하면 전체 유기체 수준 1,2,3에서 유전적으로 유전되는 질병, 발달 및 독성학을 연구할 수 있습니다. 제브라피쉬는 쥐 또는 인간 유래세포 모델보다 다양한 생리학적 측면에서 인간에게 더 가까운 강력한 모델을 제공합니다4. 광범위한 유전 도구와 전략이 제브라 피쉬에서 전진5 및 역 유전자 스크리닝6 모두에 사용되었습니다. 제브라피쉬의 포괄적인 유전자 매핑 및 주석은 표적 유전자 녹아웃(KO) 및 정밀 녹인(KI)을 엔지니어링하는 주요 기술로서 유전자 편집 접근 방식을 촉진했습니다7.
그럼에도 불구하고 제브라 피쉬에서 정확한 KI 편집을 생성하는 것은 낮은 효율성과 정확한 탐지의 어려움으로 인해 제한됩니다. 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs)가 KI8에 성공적으로 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
제브라 피쉬를 사용한 연구는 Simon Fraser University 동물 관리위원회와 캐나다 동물 관리위원회의 정책 및 절차에 따라 수행되었으며 프로토콜 # 1264K-18에 따라 완료되었습니다.
1. 정밀한 편집을 위한 CRISPR 부품 설계
- KI 표적 부위를 포함하는 서열을 절제하는 데 사용될 2-sgRNA 가이드를 설계하려면 먼저 관심 유전자에 대한 제브라피쉬 오르토로그를 식별합니다.
참고: 그림 2 는 two-sgRNA CRISPR-Cas9 접근법을 사용하여 정밀한 편집을 엔지니어링하는 단계에 대한 요약 개요를 제공합니다. - 다음으로, CRISPOR24와 같은 설계 소프트웨어 도구를 사용하는데, 여기에는 사용할 Cas 효소의 종으로서의 Danio rerio 에 대한 선택이 포함됩니다.
참고: 이 연구의 관심 유전자는 zkcnh6a (Ensembl 전사체 ID: ENSDART00000090809.6; UniProt 단백질 ID: B3DJX4), 표적 돌연변이는 아미노산, R56Q였다.- 2-sgRNA 접근법의 경우 표적 엑....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이 2-sgRNA 엑손 대체 CRISPR 접근법의 성공적인 사용은 제브라피쉬의 zkcnh6a 유전자에서 LQTS 관련 변이체 R56Q를 엔지니어링하기 위한 정밀 편집의 도입 및 간단한 검출로 강조됩니다. 도 6 은 상기와 같이 CRISPR 성분으로 단세포 배아 단계에서 주입된 대표적인 3 dpf 유충을 나타낸다. 도 6A 는 성공적인 주형 통합의 양성 리포터로서 눈 렌즈에서 YFP mVenus 리포터 유전자 발현의 존재를 보여준다. 그림 6B, C 는 각각 야생형 및 리포터 유전자 양성 어류의 꼬리 클립 샘플에서 분리 된 게놈 DNA에서 얻은 Sanger 시퀀싱 크로마토 그램을 보여줍니다. 리포터 유전자 양성 물고기는 Zkcnh6a에 R56Q 변이체를 도입하는 정확한 편집 G to A를 갖는 것으로 밝혀졌습니.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
CRISPR-Cas9를 사용한 정밀한 유전자 편집 엔지니어링은 HDR 메커니즘의 낮은 효율성과 효율적인 검출로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 양성 편집을 직접 시각적으로 감지하여 제브라피쉬에서 정밀한 편집을 생성하는 CRISPR-Cas9 기반 2-sgRNA 엑손 대체 접근법에 대해 설명합니다. 이 접근법의 효능은 zkcnh6a 유전자에서 정확한 편집을 생성함으로써 입증됩니다. 이 논문은 유전자 편집 제브라 피쉬 유충의 심장 기능이 심박수, 심낭 치수 및 ECG 형태의 비 침습적 표현형 측정을 사용하여 어떻게 평가 될 수 있는지 보여줍니다. 유전자 편집 도입에서 표현형 평가에 이르기까지이 접근법은 약 1 주일 이내에 처음부터 끝까지 완료 될 수 있습니다.
위의 편집 및 표현형 접근법의 이점은 CRISPR 변형 설계의 용이성, 여러 생리학적 시스템에서의 광범위한 적용 가능성, 큰 유전자 또는 유전자 단편을 삽입할 수 있는 능력, 개발 및 세대를 통해 종단적.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 보건원 연구 프로젝트 보조금 (TWC)과 캐나다 디스커버리 보조금의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (TWC)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm 페트리 디쉬 | VWR | ||
| Blackfly USB3 카메라 | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA 겔 추출 키트 | , Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7, 전사 키트, | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 인큐베이터 | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep 키트 | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra 전사 키트, | Invitrogen | ||
| ND1000 분광 광도계 | Nanodrop | ||
| PCR 정제 키트 | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac 기본 전원 공급 장치 | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT 전기 영동 시스템 | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish 하우징 시스템 | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β 유능한 세포 | NEB | ||
| 10X PCR 완충액 | Qiagen | ||
| 100mM 뉴클레오티드 혼합물 | ABM | ||
| 암피실린 | 시그마 | ||
| BamHI 엔도뉴클레아제(완충액 | 포함) NEB | ||
| BsaI 엔도뉴클레아제(완충액 | 포함) NEB | ||
| DR274 플라스미드(XL1 파란색 세균성 한천 찌르기) | Addgene | ||
| EcoRI, 엔도뉴클레아제(완충액 포함 | NEB | ||
| , 글리세롤 | |||
| HEPES, | 시그마 | ||
| 힌드III, 엔도뉴클레아제(완충액 포함 | NEB | ||
| 카나마이신 | 시그마 | ||
| 메틸렌 블루 | , 시그마 | ||
| MLM3613 플라스미드(XL1, 블루 세균성 한천 찌르기) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α 세균성 한천 찌르기) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| 수산화나트륨 | Sigma | ||
| T4 Ligase 버퍼 포함 | Sigma | ||
| Taq 중합효소 | Qiagen | ||
| TE 버퍼 | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ 버퍼 | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| 어닐링 버퍼(pH 7.5-8.0) | 10mM Tris | Sigma | |
| 50mM NaCl | Sigma | ||
| 1mM EDTA | Sigma | ||
| E3 매체(pH 7.2) | 5mM NaCl | 시그마 | |
| 0.17mM KCl | 시그마 | ||
| 0.33mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33mM MgSO4 | Sigma | ||
| 주입 버퍼(pH 7.5) | 20 mM HEPES | 시그마 | |
| 150 mM KCl | 시그마 |
참고문헌
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
