본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
엔테로이드는 괴사성 장염(NEC)과 같은 염증성 장 질환 연구에서 떠오르는 연구 도구입니다. 그들은 전통적으로 상피 세포의 정점 표면이 내부 내강을 향하는 기저측(BO) 형태로 자랍니다. 이 모델에서는 치료 및 실험을 위해 엔테로이드의 내강 표면에 접근하는 것이 어려워 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 능력이 제한됩니다. 이를 피하기 위해 괴사성 장염에 대한 신생아 정점(AO) 모델이 만들어졌습니다. 장 상피 세포 투과성 변화는 NEC에 대한 병리학적이기 때문에 이 프로토콜은 루시퍼 옐로우(LY)를 세포 투과성의 마커로 사용하여 설명합니다. LY는 세 가지 주요 세포 간 경로(기공, 누출 및 제한되지 않음)를 통해 장 상피 장벽을 가로지릅니다. AO 모델에서 LY를 사용하면 NEC의 투과성에 대한 광범위한 연구가 가능합니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 조산 신생아로부터 장 조직의 수술 샘플을 수집했습니다. 장 줄기 세포는 지하실 분리 를 통해 수확되어 장내 증식에 사용되었습니다. 엔테로이드는 성숙할 때까지 성장한 다음 AO로 변형되거나 BO 형태로 남았습니다. 이들은 치료되지 않았거나 (대조군) 또는 지질 다당류 (LPS)로 처리되었고 시험관 내 NEC의 유도를위한 저산소 조건을 받았다. 투과성을 평가하기 위해 LY를 사용하였다. 정점 단백질 zonula occludens-1 및 기저측 단백질 β-catenin의 면역형광 염색 결과 AO 형태가 확인되었습니다. LPS와 저산소증으로 치료받은 AO 및 BO 엔테로이드는 대조군에 비해 세포 주위투과성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. AO 및 BO 엔테로이드 모두 대조군에 비해 처리된 엔테로이드의 내강으로의 LY 흡수가 증가한 것으로 나타났습니다. AO 엔테로이드 모델에서 LY를 활용하면 세포 투과성의 세 가지 주요 경로를 모두 조사할 수 있습니다. 또한 숙주-병원체 상호 작용과 이것이 BO 엔터로이드 모델과 비교하여 투과성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사할 수 있습니다.
서론
엔테로이드는 장기 제한 인간 장 줄기 세포 1,2에서 파생된 3차원(3D) 구조입니다. 그들은 전적으로 상피 계통으로 구성되어 있으며 분화 된 모든 장 상피 세포 유형2을 포함합니다. 엔테로이드는 또한 내부 구획을 형성하는 정점 내강 표면과 주변 매체를 향한 기저측 표면으로 구성된 세포 극성을 유지합니다. 엔테로이드는 생성 된 호스트의 특성을 보존한다는 점에서 고유 한 모델입니다3. 따라서 미숙아에서 생성 된 엔터 로이드는 괴사 성 장염 (NEC)과 같이이 집단에 주로 영향을 미치는 질병을 조사하는 데 유용한 모델을 나타냅니다.
전통적인 엔터로이드 모델은 엔테로이드가 기저막 매트릭스(BMM)의 돔에 둘러싸인 기저측부(BO) 형태로 재배됩니다. BMM은 엔터로이드가 외부에 기저측 표면이 있는 3D 구조를 유지하도록 유도합니다. BO 엔테로이드는 2차원(2D) 1차 인간 세포주와 생체 내 동물 모델 2,4 사이의 간극을 해소하는 NEC에 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
본 연구는 오클라호마 대학의 기관 검토 위원회 승인(IRB, #11610, 11611)에 따라 수행되었습니다. IRB 사양에 따라 인간 수술 표본을 수집하기 전에 부모의 동의가 필요했습니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 소장 조직을 NEC 또는 장루 제거 또는 폐쇄증 수리와 같은 기타 장 절제술 수술을 받는 영아(샘플 수집 당시 36-41주 범위의 교정 재태 연령(GA), 모두 25-34주의 추정 GA, 2:1 M:F)로부터 얻었습니다. 엔테로이드는 공장 또는 회장에서 얻은 조직에서 생성되었습니다.
1. 인간 유아 유래 장내 배양: 전체 조직에서 음와균 분리 및 도금
- 이전 보고4에 따라 배양 배지, 킬레이트 완충액 #1 및 킬레이트 완충액 #2(표 1)를 준비합니다. 킬레이트 완충액을 4 ° C에 보관하고 48 시간 이내에 사용하십시오.
- 인간 미니거트 미디어를 준비합니다(표 1). 스톡을 -20 ° C에서 보관하고 사용하기 전에 37 ° C 수조에서 따뜻하게하십시오.
- 50% L-WRN 조절 배지(CM)를 준비합니다(표 1
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
AO 형태
50% LWRN 배지에 72시간 동안 현탁된 엔테로이드는 AO 형태를 가정합니다(그림 1). 이것은 정점 단백질, zonula occludens-1 (ZO-1) 및 기저측 단백질 β- 카테닌의 장내 전체 마운트를 활용 한 면역 형광 염색을 통해 확인되었습니다 (그림 1). AO 엔테로이드는 엔테로이드의 바깥쪽 정점 표면에 ZO-1(녹색)을 나타내는 반면 β-카테닌(빨간색)은 내부 기저측 표면에 있습니다(그림 1A). BO 엔테로이드는 외부 표면에 β-카테닌(빨간색)이 있고 내부 내강 표면에 ZO-1(녹색)이 있는 역을 보여줍니다(그림 1B). 이 결과는 실험 전에 엔테로이드가 AO임을 확인하기 위해 예상되는 극성 반전을 보여줍니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
장 투과성은 복잡하고 상피 장벽 기능을 반영합니다. 장 장벽은 세포횡단 및 세포주위 수송(14)을 매개하는 상피 세포의 단일층을 포함한다. 세포부투과성은 상피 세포(14) 사이의 공간을 밀봉하는 단단한 접합 단백질에 의존한다. 이 초세포 수송 내에는 분자가 교차할 수 있는 세 가지 뚜렷한 경로가 있습니다: 기공, 누출 및 무제한15. 공극 경로는 작은 하전 이온에 대한 투과성을 허용하는 반면, 누출 경로는15에 걸쳐 더 크고 하전되지 않은 분자를 허용합니다. 세 번째, 제한되지 않은 경로는 상피 손상 또는 사망에 이차적 인 투과성을 반영합니다16. 많은 분자가 세포 투과성을 평가하는 데 사용되지만 분자의 유형과 크기는 조사 할 투과성 경로에 영향을 미칩니다.
작고 친수.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이 기사에서 논의된 제품이나 개념에 대해 독점적 또는 상업적 관심을 보고하지 않습니다.
감사의 글
로체스터 대학 의료 센터의 Ashley Nelson에게 엔터 로이드 모델에 대한 그녀의 도구 적 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 오클라호마 대학교 소아외과에도 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [NIH Grant R03 DK117216-01A1], 오클라호마 성인 줄기 세포 연구 센터 및 장로교 건강 재단 보조금 # 20180587의 지원을 받아 오클라호마 대학 건강 과학 센터의 외과에 수여되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore 시그마 | G9145-.1MG | |
| 100 &마이크로; m 멸균 세포 여과 | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN 컨디셔닝 배지 | Miyoshi et al.12 | ||
| 24웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3526 | |
| 96웰 검정색, 투명 바닥 플레이트 | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R& D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 2차 ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 2차 ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| 항-베타;-카테닌 마우스 기본 ab, 1:100 | 세포 신호 | 14-2567-82 | |
| B-27 보충제에서 비타민 A를 뺀 | 값 Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| 세포 회수 솔루션 | Corning | 354270 | |
| 해부 가위 | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| 표피 성장 인자 (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 산 (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 이미징 시스템 | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| 유리 커버슬립 | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, 리튬 염 | Invitrogen | L453 | |
| 모듈식 인큐베이터 챔버 | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 설폰산(HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-아세틸시스테인 | 밀리포어 시그마 | A9165-5G | |
| 니코틴아미드 | 밀리포어 시그마 | N0636-100G | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| 냉장 스윙 버킷 원심분리기 | |||
| 냉장 테이블탑 마이크로원심분리기 | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 Millipore Sigma | S7067-5MG | ||
| SpectraMax iD3 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | ||
| 튜브 리볼버 로테이터 | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| 초저 부착 24웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
참고문헌
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492(2020).
- De Fazio, L., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
