여기에 제시된 것은 복잡한 조직에서 기능적으로 관련된 카스파제를 식별, 검증 및 표적으로 삼기 위한 상세한 면역조직화학 프로토콜입니다.
방법 논문
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여기에 제시된 것은 복잡한 조직에서 기능적으로 관련된 카스파제를 식별, 검증 및 표적으로 삼기 위한 상세한 면역조직화학 프로토콜입니다.
카스파제 계열은 세포 분화, 축삭 경로 찾기 및 증식을 포함하여 세포 사멸을 넘어 많은 세포 경로를 매개하는 것으로 알려져 있습니다. 세포 사멸 프로테아제 패밀리의 동정 이후, 발달, 건강 및 질병 상태에서 특정 가족 구성원의 기능을 식별하고 확장하는 도구에 대한 검색이 있었습니다. 그러나, 널리 사용되는 현재 상업적으로 이용가능한 카스파제 툴 중 다수는 표적화된 카스파제에 특이적이지 않다. 이 보고서에서 우리는 새로운 억제제를 사용하여 신경계에서 caspase-9를 식별, 검증 및 표적으로 삼는 데 사용한 접근 방식과 면역 조직 화학적 판독을 통한 유전 적 접근 방식을 설명합니다. 특히, 우리는 망막 신경 조직을 모델로 사용하여 카스파제의 존재와 기능을 확인하고 검증했습니다. 이 접근법은 세포 유형 특이적 세포사멸 및 비-아폽토시스 카스파제-9 기능의 질의를 가능하게 하고, 관심있는 다른 복잡한 조직 및 카스파제에 적용될 수 있다. 카스파제의 기능을 이해하면 세포 생물학에 대한 현재 지식을 확장하는 데 도움이 될 수 있으며 질병에 관여하기 때문에 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데에도 유리할 수 있습니다.
카스파제는 질병1,2에서 발달 세포 사멸, 면역 반응 및 비정상적인 세포 사멸을 조절하는 프로테아제 계열입니다. 카스파제 계열의 구성원이 다양한 신경퇴행성 질환에서 유도된다는 것은 잘 알려져 있지만, 어떤 카스파아제가 질병 병리를 유발하는지 이해하는 것은 더 어렵습니다3. 이러한 연구에는 개별 카스파제 가족 구성원의 기능을 식별, 특성화 및 검증하는 도구가 필요합니다. 관련 개별 카스파제를 파싱하는 것은 기계론적 관점과 치료적 관점 모두에서 중요한데, 이는 문헌에 카스파제 4,5의 다양한 역할에 대한 증거를 제공하는 여러 연구가 있기 때문입니다. 따라서, 목표가 치료 이익을 위해 질병에서 카스파아제를 표적화하는 것이라면, 관련 가족 구성원(들)의 특정 표적화를 갖는 것이 중요하다. 조직에서 카스파아제 수준을 검출하는 전통적인 기술에는 웨스턴 블로팅과 효소 및 형광 측정 접근법 3,6이 포함됩니다. 그러나 이러한 측정 중 어느 것도 카스파아....
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이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.
1. 망막 조직의 제조 및 냉동 절제
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설명된 프로토콜을 통해 사용자는 망막 조직에서 카스파제-9 수준을 분석하고 정량화할 수 있습니다. 또한 caspase-9 및 다운스트림 기판을 추가로 식별, 검증 및 구체적으로 타겟팅하는 도구를 제공합니다. 요약된 단계를 통해 형광 현미경 사진에서 카스파아제 수준과 세포 특이성을 정량적으로 분석할 수 있습니다. 모든 그림은 손상되지 않은 1일 P-RVO 망막 단면에서 전체 망막, 내피 세포 및 뉴런에서 표시된 카스파아제 수준의 대표적인 현미경 사진 및 정량화를 보여줍니다. 망막 단면은 Hoechst로 염색 할 때 망막 신경절 층 (RGL), 내부 핵층 (INL) 및 외부 핵층 (ONL)의 망막 핵을 시각화 할 수 있습니다. 또한, 망막 혈관은 망막 플렉시 폼 층 또는 RGL과 INL 사이, INL과 ONL 사이에서 볼 수 있습니다. 혈관의 조직 학적 특성으로 인해 망막이 절편되면 혈관이 분리되고 분리 된 것처럼 보이며 플렉시 폼 층을 공급합니다. 그림 2 는 카스파제-9를 고.......
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Caspases는 세포 사멸 및 염증에서의 역할에 대해 가장 잘 연구 된 프로테아제의 다중 구성원 계열입니다. 그러나 최근에는 일부 가족 구성원에 대해 다양한 비 사망 기능이 발견되었습니다 4,5. 카스파아제 기능에 대한 우리의 이해의 대부분은 세포 배양에서의 작업과 인간 질병의 추론 데이터에서 파생됩니다. 질병에서 카스파제의 비정상적인 유도, 활성화 또는 불활성화가 있다는 것은 인식되지만, 카스파제가 질병 병리를 유발하는지 여부를 기능적으로 결정하는 것은 어려웠습니다. 특정 카스파제를 평가하기 위해 사용되는 많은 도구는 다수의 패밀리 구성원을 검출하여, 이들 시약(17)으로 수득된 데이터의 기능적 관련성을 약화시킨다. 여기에서는 망막을 예로 들어 복잡한 조직에서 카스파제를 연구하는 프로토콜을 제공합니다. 신경계에서 카스파아제 발현은 출생 전후에 하향 조절됩니다. 이를 통해 특정 항.......
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저자는 다음과 같은 경쟁 이익을 선언합니다 : C.M.T.는 다음과 같은 특허 출원 US20200164026, US20190142915 및 US20150165061을 보유하고 있습니다. C.M.T.와 SS는 미국 20140024597에 특허 출원을 하고 있습니다. C.M.T., A.M.P. 및 MIA는 특허 출원 US2020058683을 가지고 있습니다. C.M.T. 및 YJ는 특허 출원 WO2018013519를 가지고 있다. M.I.A와 C.M.T는 뉴욕시 컬럼비아 대학교 관리위원회의 특허 출원 WO/2020/223212에 발명자로 등재되어 있습니다. 나머지 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
이 연구는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(NSF-GRFP) 보조금 DGE - 1644869 및 국립 보건원(NIH)의 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(NINDS), 수상 번호 F99NS124180 NIH NINDS 다양성 전문 F99(CKCO), 국립 안과 연구소(NEI) 5T32EY013933(AMP), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(RO1 NS081333, R03 NS099920에서 CMT), 국방부 육군/공군(DURIP에서 CMT로).
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | 1:150에서 사용 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | 1:800에서 사용 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | 오픈 소스 | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 마우스 | 실험실 생성 | See Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | 사용 1:200 |
| 케타민 하이드로클로라이드 | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| 관류 펌프 | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | 연구실에서 생성된 | Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T | 피셔 | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron 시스템 | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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