리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독

Summary

여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.

Abstract

세포가 PFT로 인한 막 손상에 저항하기 때문에 기공 형성 독소(PFT)의 기능과 메커니즘을 이해하는 것은 어렵습니다. 생물 물리학 적 접근법은 기공 형성을 이해하는 데 도움이되지만, 종종 막 지질과 단백질의 완전한 보완이 부족한 환원 주의적 접근법에 의존합니다. 배양 된 인간 세포는 대체 시스템을 제공하지만 복구 메커니즘의 복잡성과 중복으로 인해 특정 메커니즘을 식별하기가 어렵습니다. 대조적으로, 피부 리슈만편모충증을 담당하는 인간 원생동물 병원체인 리슈만편모충은 복잡성과 생리학적 관련성 사이의 최적의 균형을 제공합니다. L. major 는 유전적으로 다루기 쉽고 시험관 내에서 고밀도로 배양될 수 있으며 섭동이 감염에 미치는 영향은 확립된 쥐 모델에서 측정할 수 있습니다. 또한 L. major 는 포유류와 구별되는 지질을 합성하여 막 역학을 변경할 수 있습니다. 막 역학의 이러한 변화는 가장 잘 특성화된 독소 계열인 콜레스테롤 의존성 세포용해제(CDC)의 PFT로 프로젝션할 수 있습니다. CDC는 리슈만편모충 막의 에르고스테롤에 결합하여 L. major 프로마스티고테를 죽일 수 있으며, 이는 L. major 가 PFT 기능의 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 적합한 모델 시스템임을 나타냅니다 . 이 연구는 기생충 배양, 지질 감수성 평가를위한 유전 도구, 막 결합 분석 및 세포 사멸 분석을 포함하여 L. 주요 프로마스티고트에서 PFT 기능을 테스트하는 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 진화적으로 다양한 유기체와 지질 조직의 공통점에 걸쳐 PFT 기능을 이해하기 위한 강력한 모델 시스템으로 L. major 를 신속하게 사용할 수 있도록 합니다.

Introduction

기공 형성 독소(PFT)는 박테리아 독소의 가장 큰 계열^이지만1, 세포를 천공하고 파괴하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 가장 잘 연구된 모공 형성 독소 계열은 콜레스테롤 의존성 세포질(CDC)입니다. CDC는 주로 괴사 성 근막염의 원인균 인 Streptococcus pyogenes²를 포함한 그람 양성 박테리아에 의해 합성됩니다. S. pyogenes 는 숙주 세포의 원형질막에 있는 스테롤에 단량체로 결합하여 올리고머화하고 ~20-30nm 기공을 막¹에 삽입하는 CDC 스트렙톨리신 O(SLO)를 분비합니다. 이 과정에서 지질이하는 역할은 아직 결정되지 않았습니다.

지질-CDC 상호작용을 연구하는 한 가지 접근법은 화학적으로 정의된 리포좀을 사용하는 것입니다. 정의된 리포좀은 독소 결합 및 기^{공 형성3,4}을 유지하는 데 필요한 지질의 역치에 대한 정보를 제공하지만 세포 기능을 완전히 요약하지는 않습니다. 예를 들어, 재구성된 리포좀은 포유류 숙주의 지질 비대칭성과 독소에 대한 반응의 지질 변형이 부족^합니다5. 리포좀에 대한 한 가지 대안은 포유류 세포주를 사용하는 것입니다. 이러한 세포주는 생리학적으로 더 관련이 있지만 독소 감지 및^{내성 메커니즘에는} 상당한 수준의 중복성이 있습니다2. 결과적으로 CDC에 저항하는 데 사용되는 복구 경로는 제대로 결정되지 않은 상태로 남아 있습니다. 특히,^{Ca 2+} 유입은 막 복구¹의 주요 활성화 제입니다. ^{Ca 2+} 유입의 하류에는 세라마이드 의존적 복구 ^6,7 및 MEK 의존적 복구 경로⁶를 포함한 여러 경로가 참여합니다. 이러한 경로는 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체(ESCRT)⁸ 및 부속신 ^6,9,10을 포함한 다른 단백질 이펙터와 상호 작용합니다. 포유류 세포에서 이러한 경로를 해부하는 것은 데이터 해석을 혼란스럽게 하는 중복성으로 인해 어렵습니다.

복구 경로를 해부하기 위해 복잡성과 단순성의 균형을 맞추는 한 가지 방법은 Leishmania 속의 원생 동물 병원체와 같은 더 간단한 유기체를 사용하는 것입니다. 리슈만편모충 sp. 인간과 다른 동물에서 리슈만편모충증을 유발합니다. 리슈만편모충증은 종 및 기타 요인에 따라 피부 리슈만편모충증(자가 제한된 피부 병변)에서 치명적인 내장 리슈만편모충증(간비장비대)에 이르기까지 다양합니다¹¹. 피부 리슈만편모충증의 원인균인 리슈만편모충은 모래편모충 벡터를 통해 인간에게 전염되며 리슈만편모충 기능과 감염을 이해하는 데 사용됩니다¹². 또한, 리슈만편모충 sp. 아르 디제닉¹². 그들은 amastigotes라고 불리는 세포 내 포유류 대 식세포 기생충과 모래 파리¹²에서 자유롭게 수영하는 편모 모양의 프로 마스 티고트로 존재합니다. L. 주요 프로마스티고테는 M199와 같은 혈청 보충 배지에서 고밀도¹³으로 배양할 수 있습니다. 프로마스티고테는 또한 유전적으로 다루기 쉽습니다. 지질 생합성 경로를 표적으로 하는 것을 포함하여 많은 유전자 녹아웃이 존재합니다¹³. 이러한 녹아웃은 Balb/c 마우스¹³의 감염을 통해 감염성 및 병변 발달의 성장 및 차이에 대해 평가할 수 있습니다.

리슈만편모충 배양의 상대적 용이성과 지질 생합성 녹아웃의 범위 외에도 기생충은 포유류보다 더 단순한 게놈을 가지고 있습니다. 리슈만편모충의 가장 잘 특성화된 종은 L. major로, 지질 대사에 결함이 있는 돌연변이와 같은 기존의 많은 유전 도구를 가지고 있습니다¹⁴. 특히, 많은 복구 단백질이 없습니다. L. major는 아넥신과 같은 주요 포유류 복구 단백질에 대해 현재까지 확인된 동족체가 없습니다. 이것은 포유류 시스템의 복잡성없이 진화 적으로 보존 된 복구 경로의 특성화를 가능하게합니다. 그러나 수리 경로는 현재까지 리슈만편모충에서 특성화되지 않았습니다. 동시에 MEK 경로⁶과 같은 복구와 관련된 주요 신호 전달 경로는 리슈만편모충 sp.15,16에서 보존되지만 동족체를 검증해야 합니다. 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로는 L. mexicana에서 잘 연구되어 포유류 세포의 세포 내 생존 및 열 안정성에 기여하고 메타 사이클 생성을 제어합니다¹⁶. 리슈만편모충 sp.에서는 15개의 MAPK 중 10개가¹⁷개로 특성화되었습니다. LmMAPK9 및 LmMAPK13은 보존된 인산화 립 서열에서의 동일성에 기초하여 포유동물 ERK1/2와 가장 유사한 것으로 예측된다. 인산화 립 서열은 포유동물 ERK1/2 및 LmMAPK9 및 LmMAPK13 둘 다에 대해 TEY이다. 그러나, 리슈만편모충 MAPK 중 8개는 TDY 인산화 모티프¹⁵를 갖는다. 적어도 두 개의 MEK 동족체가 리슈만편모충 sp., LmxMKK¹⁸ 및 MEKK-관련 키나아제(MRK1)¹⁹에서 확인되었다. 이것은 리슈만편모충에서 확인된 통찰력이 포유류 시스템으로 번역될 수 있음을 시사합니다. 포유류 시스템으로 번역되지 않는 경우 리슈만편모충증 치료를 위한 치료 표적을 나타냅니다.

L. major promastigotes를 사용하여 막 복구 및 독소와의 상호 작용을 연구하려면 중간 처리량 기술이 필요합니다. 고해상도 라이브 셀 이미징을 사용하면 표지된 단백질과 막을 실시간으로 시각화할 수 있지만 처리량이 적고 세포 생존을 측정하지 못할 수 있습니다. 중간 처리량 생존력 분석에는 유세포 분석으로 측정한 염료 흡수, 미토콘드리아 활성 측정 또는 젖산 탈수소효소(LDH)와 같은 세포 단백질의 방출이 포함됩니다. 포유류 세포에서, LDH 분석은 세포 사멸을 정량적으로 측정하지 않는다²⁰. 또한, LDH 방출 또는 미토콘드리아 활성과 같은 인구 기반 분석은 강력한 단일 세포 또는 다중 파라미터 분석을 허용하지 않습니다²⁰. 대조적으로, 유세포분석 기반 분석은 다중 파라미터 단일 세포 분석을 가능하게 합니다(²⁰). 그러나 이러한 분석은 독소 생물학 또는 L. 주요 프로마스티고테의 독소에 대한 반응을 이해하는 데 적용되지 않았습니다.

이 연구에서 SLO는 L. major promastigotes와 더 간단한 Tyrode 완충액을 배양하는 데 일상적으로 사용되는 M199 배지의 두 가지 다른 완충액에서 L. major의 스핑고지질 널 돌연변이의 원형질막 섭동을 이해하는 도구로 사용됩니다. 중간 처리량 유세포 분석 분석이 설명되고 독소 용량-반응 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 유동 세포분석 분석으로부터의 데이터는_LC50 값을 결정하기 위해 로지스틱 곡선으로 모델링된다. 이러한 정보를 이용하여, SLO의 전분해 용량을 결정하여 웨스턴 블롯팅을 사용하여 MAPK 항체를 검증할 수 있다.

Protocol

RG2 병원체 리슈만편모충 메이저 및 재조합 DNA의 사용 및 취급을 위해 모든 적절한 지침과 표준 미생물학적, 안전성 및 세포 배양 관행이 사용되었습니다. 살아있는 L. 전공 에 대한 모든 실험은 BSL-2 인증 실험실의 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 이 작업은 텍사스 공대 기관 생물 안전위원회가 감독했습니다.

참고: 안전성 관점에서 살아있는 L. 주요 프로마스티고테는 위험 그룹 2 병원체입니다. 기관 생물안전 위원회(IBC)의 적절한 격리, 예방 조치 및 감독을 사용하여 처리합니다. 독성 물질에 대한 제도적 절차에 따라 독성 물질 및 화학 물질을 취급하십시오. 재조합 독소가 사용되는 경우 재조합 DNA 작업을 위해 IBC 승인 및 감독이 필요할 수 있습니다.

1. L. 주요 프로마스티고테스의 재배 및 준비

1. 상동 재조합 또는 CRISPR 기반 방법^13,21을 사용하여 이전에 설명한 L. 주요 유전 돌연변이를 얻거나 만들고 검증합니다. 녹아웃의 특이성을 보장하기 위해 플라스미드에 다시 추가된 유전자로 보완된 녹아웃을 사용하십시오.
2. 야생형 L. 메이저 및 spt2^- 프로마스티고테를 완전한 M199 배지에서 27°C에서 배양한다. 에피솜 애드백 세포(spt2^-/+SPT2)를 완전한 M199와 10μg/mL G418에서 배양합니다( 표 1 및 재료 표 참조).
   알림: L. 주요 세포 실험을 포함하는 전체 실험 설정은 BSL2 인증 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
3. ^{이전에 수행}된 L. 주요 성장 곡선 분석에 의해 결정된 바와 같이 완전한 M199 배지²²에서 프로마스티고테를 배양합니다(2-8 x 10⁶ cells/mL). 세포 독성을 위해 각 웰에 대해 1 x 10 5 세포와 염색 제어를 위한 5 x 10⁵ 세포를 계획하십시오. 웨스턴 블롯의 경우 웰당 2 x 10⁷ 셀을 계획하십시오.
   참고: 두 가지 기술 복제로 세포 독성 분석을 수행합니다.
4. 적절한 세포 밀도를 확인하려면 분취량 (10-40 μL)의 프로 마스 티 고테를 동일한 부피의 고정 제 (3.7x PBS에서 1 % 파라 포름 알데히드)와 혼합하십시오. 고정된 시료 10μL를 혈구계의 양쪽에 로드합니다.
   주의 : 포름 알데히드는 독성 화학 물질입니다. 유해 화학 물질에 대한 제도적 정책에 따라 취급하십시오.
5. 현미경을 사용하여 20x 배율로 세포 계수를 수행합니다. 혈구 측정기 중앙에있는 25 개의 작은 사각형에있는 모든 세포를 세십시오. 양쪽의 사각형에 대해 반복하고 카운트의 평균을 구합니다.
   참고: 카운트 간의 변동이 >10이면 다시 계산하고 평균을 구합니다. 평균 개수가 <10 또는 >100이면 희석 및 재계수를 변경한 후 다음 수식을 사용하여 배양 밀도를 계산합니다.
   (식 1)
   예를 들어, 25개의 사각형에 평균 250개의 리슈만편모충 이 있는 경우 배양 밀도는 5 x 10⁶ cells/mL입니다.
6. 계수 후 5 x 10⁶ 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 실온에서 8분 동안 1,500 x g 로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
7. 10mL 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 세포 펠릿을 잠시 와동시킵니다. 동일한 튜브에 5mL의 1x PBS를 추가하고 3-6x를 부드럽게 뒤집어 세포를 세척합니다. 실온에서 8분 동안 1,500 x g 로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
8. 10mL 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 5mL 피펫으로 실험에 사용된 5 mL의 배지(예: M199 또는 1x Tyrode's 완충액)에 5 x 10 6 세포 펠릿을 재현탁하여 최종 농도 1 x 10⁶ cells/mL를 수득하였다.

2. 세포독성 분석

1. 실험 준비
   1. 앞서 설명한 바와 같이 독소를 정제하거나²⁴, 또는 공급 업체로부터 독소를 구입하십시오. 일회용 분취량으로 분취하고 최대 80년 동안 -1°C에서 보관합니다. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.
   2. 인간 적혈구를 사용하여 각 독소에 대한 용혈 활성을 결정합니다( 재료 표 참조)²⁴.
      참고: 용혈 활성은 정제, 돌연변이 등으로 인한 활성의 차이를 제어하기 때문에 사용됩니다. 적혈구의 종 선택은 용혈 활성을 변경할 수 있습니다 (예를 들어, 인터메디신은 인간 적혈구를 필요로 한다).
   3. 각 조건에 대해 2개의 기술 복제, 용량-반응 곡선에 대한 7개의 희석 및 무독소 대조군을 계획합니다.
      참고: 야생형(WT), spt2^- 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테의 경우 하나의 V^-바닥 96웰 플레이트에서 두 가지 처리를 테스트할 수 있습니다. 예를 들어 미디어에 대한 민감도를 비교할 수 있습니다(그림 1). V-바닥 플레이트 대신 1.2mL 마이크로타이터 튜브(재료 표 참조)를 사용할 수 있습니다. 세포분석기의 획득 시간으로 인해 한 번에 두 개 이상의 플레이트를 실행하는 것은 권장되지 않습니다.
   4. 필요한 테스트 조건과 실험 목적에 따라 사용할 분석 버퍼를 결정합니다.
      참고: 이 예에서는 M199와 생존 염료 프로피듐 요오드화물(PI)이 보충된 Tyrode의 버퍼라는 두 가지 분석 버퍼를 비교합니다. 혈청 내 콜레스테롤은 CDC 활동을 방해합니다²⁴.
   5. 치료된 유전자형의 상태와 수에 따라 필요한 독소의 양을 계산합니다. 50% 특이적 용해가 희석 곡선의 중간에 발생하는지 확인하십시오.
      참고: CDC의 경우 2배 직렬 희석은 나중에 물류 모델링을 위한 좋은 범위를 제공합니다. spt2^- 프로마스티고테의 경우 4,000 HU/mL SLO가 권장되는 시작 희석액입니다. 비활성 독소가 사용되는 경우 최고 용량에 해당하는 질량을 대신 사용할 수 있습니다.
   6. 웰당 200 μL의 최종 부피를 계획하고 파이펫 오류를 고려하여 소량의 추가 부피(50-100 μL)를 추가합니다.
      참고: 각각 중복으로 수행되는 3개의 유전자형으로 연속 희석을 위한 6개의 샘플이 있습니다.
   7. 다음 공식을 사용하여 필요한 독소의 총량을 결정하십시오.
      (식 2)
      여기서 액티비티맥스는 사용된 최고 농도(HU/mL)입니다. TotalFinalVolume은 총 부피입니다 (6 개 샘플의 경우 200 x 6 + 100 = 1,300 μL). 활동 재고는 독소 스톡 (HU / mL)의 활성입니다. VolStockToxin은 필요한 독소 재고의 양입니다.
   8. 실험에 필요한 충분한 분석 완충액을 준비합니다. 생존 염료와 Ca²⁺ 수준을 제어하는 데 필요한 Ca²⁺ 또는 EGTA로 기본 배지를 보충하십시오. 혼합 할 소용돌이.
      참고: 예를 들어, Tyrode의 완충액 10mL마다 50μL의 2mg/mL PI와 200μL의 100mM_CaCl2를 추가하여 각각 10μg/mL 및 2mM의 최종 농도를 제공합니다.
   9. 생존성 염료 PI가 Cy5 또는 AlexaFluor647-접합 독소^20,25를 사용하는 형광 결합 분석과 같이 사용된 다른 프로브와 충돌하지 않는지 확인합니다.
   10. 독소의 2x 용액을 만들기 위해 독소 희석을 계획하십시오. 1.5mL 원심분리 튜브에 분석 버퍼를 넣고 얼음에서 식힙니다. 분석을 시작하기 직전에 독소를 추가하십시오.
       참고: 이 예에서는 1.3mL의 분석 버퍼가 상단 희석에 추가되고 650μL가 연속 희석에 추가되어 2x 독소 용액을 준비합니다.
2. 실험
   1. 1.8단계에서 처리된 프로마스티고테 0.5mL를 별도의 튜브에 "염색되지 않은 대조군"으로 예약합니다.
      알림: 이 샘플은 유세포분석기에서 게이팅을 설정하는 데 사용됩니다.
   2. 2 mg/mL PI를 최종 농도 10 μg/mL에 첨가하여 나머지 프로마스티고테에 첨가합니다. 3 초 동안 소용돌이.
      참고 : 처리 된 프로 마스티고트에 PI를 첨가 한 후,이 세포는 2.5 시간의 시간 동안 만 사용할 수 있습니다. 2.5 시간이 지나면 세포가 죽기 시작하고 결과가 잘못됩니다.
   3. 1 x 10⁵ (100μL/웰 기준) 처리된 프로마스티고트를 V-bottom 96웰 플레이트 또는 1.2mL 마이크로타이터 튜브의 각 웰에 추가합니다(그림 1). 플레이트 또는 튜브 랙을 보기에서 약 45° 각도로 얼음 위에 놓습니다. Leishmania promastigotes를 취급 할 때 생물 안전 캐비닛에서 작업을 수행하십시오.
   4. PI가 있는 분석 버퍼 100μL를 각 무독소 대조군(마지막 행)에 추가합니다. 색상이 더 어둡게 나타나는 총 부피가 200μL인 튜브를 시각적으로 식별하여 컨트롤이 올바르게 추가되었는지 확인합니다.
   5. -80°C에서 독소 분취량을 제거하고 얼음에서 해동하고 필요에 따라 풀링합니다. 단계 2.1.5에서 계산된 독소의 부피를 가장 높은 희석액에 첨가한다(단계 2.1.10에서 제조됨). 그런 다음 독소를 연속 희석합니다(그림 1). 혼합을 보장하기 위해 최소 8배 위아래로 피펫을 사용합니다.
      알림: CDC는 실온에서 빠르게 비활성화되므로 얼음 위에서 수행하십시오.
   6. 가장 낮은 독소 농도에서 시작하여 올바른 행(그림 1 및 그림 2)에 100μL의 독소를 빠르게 추가하고 모든 독소가 세포에 추가될 때까지 계속합니다.
   7. 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 기간 후, 플레이트를 포장하고 유세포 분석기로 운반한다.
3. 데이터 수집
   1. 유세포분석기( 재료 표 참조) 및 수집 소프트웨어를 제조업체의 지침 및 시설 정책에 따라 설정하십시오. 세포분석기에 대한 사전 교육 없이 유세포분석 절차를 수행하지 마십시오.
      참고:이 예에서는 4-레이저 Attune NxT가 사용되었습니다. PI는 YL-1 채널(561nm 레이저에 의해 여기되고, 577 LP를 통과하고, 600 DLP에서 반사되고, 585/16 대역통과를 통해 필터링됨)에서 수집되었지만, PI의 광범위한 스펙트럼은 다른 채널에서 수집을 허용합니다.
   2. 염색되지 않은 L. major promastigote 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란에 대한 게이트와 선택한 염료를 기반으로 초기 형광 매개 변수를 설정합니다.
   3. 자가 형광을 확인하기 위해 점도표에 필요한 경우 하나의 추가 매개 변수를 포함합니다(예: "얼룩 없음")(그림 3).
      참고:이 예에서는 BL-1 채널(488nm 레이저로 여기, 495 DLP 및 503 LP 통과, 555 DLP에서 반사, 530/30 대역통과를 통해 필터링)이 사용되었습니다.
   4. 단일 염색 대조군을 사용하여 생존 염료(이 연구에서는 PI) 및 형광 표지된 독소에 대한 게이트를 설정합니다. 마이크로 막힘에 대한 전방 산란 대 시간을 모니터링합니다.
      알림: PI는 염색되지 않은 컨트롤 위의 모든 셀을 희미하게 염색합니다. 죽은 세포는 개체군 사이에 일시적으로 투과된 세포와 함께 쉽게 분리될 수 있습니다.
   5. 세포분석기의 각 샘플에 대해 >10,000개의 게이트 이벤트를 수집합니다.
      참고: 가장 민감한 것부터 가장 덜 민감한 것까지 읽는 것이 좋지만 읽기 순서가 샘플 결과에 미치는 영향을 확인하기 위해 수집 순서를 반대로 할 수 있습니다.
   6. 데이터를 저장하고 분석을 위해 필요에 따라 내보냅니다.
4. 데이터 분석
   참고: 이 연구에서는 해 찾기 플러그 인이 있는 Excel( 재료 표)는 데이터 분석에 사용되었습니다( 보충 파일 1).
   1. 게이트 전체, 단일 세포 L. 주요 프로마스티고테는 필요에 따라 전방 및 측면 산란 및 시간에 게이팅합니다(그림 3). 유세포분석기에 권장되는 높이 또는 면적을 사용하십시오.
      알림: 여기에 사용된 유세포분석기의 경우 면적 대신 높이가 권장되는 매개변수입니다.
   2. 죽은 세포를 식별하고 게이트를 "PI 높음"으로 지정합니다. 중간 셀을 "PI 낮음"으로 게이트합니다. PI 높은 세포는 죽은 세포인 반면, PI 낮은 세포는 일시적으로 투과화된다²⁶.
      참고: PI 높은 셀은 일반적으로 음수 셀에서 2-3 로그 이동을 보여줍니다.
   3. 데이터를 Excel로 내보냅니다. 샘플 이름/ID 및 %PI high를 가져와 킬링을 결정합니다.
      참고: 형광 독소를 사용한 경우 살아있는, 일시적으로 투과된 집단 및 음성 집단의 중간 형광 강도(MFI)가 필요합니다. 과도적 투과화를 위해 %PI low를 내보낼 수 있습니다.
   4. 두 기술 반복실험 사이의 각 조건에 대한 평균 %PI 최고치를 결정합니다.
      알림: 형광 독소에 평균 MFI가 필요한 경우 이 값도 계산하십시오.
   5. 다음 공식^24,25를 사용하여 %PI 최고치에서 %특이적 용해를 계산합니다.
      (식 3)
      여기서 PIhighxpt는 실험 조건에 대한 %PI 최고입니다. PIhighctl은 무독소 대조군에 대한 %PI 최고입니다.
   6. 용량-반응 곡선에 대한 독소 농도에 대한 %특이적 용해를 플로팅합니다(그림 4).
   7. 로지스틱 모델링을 위해 Excel에서 용량-반응 곡선을 구성합니다. 독소 농도 및 평균 %특이적 용해와 실험 세부 정보 및/또는 원시 %PI 높은 계산을 포함합니다(표 2).
   8. 해 찾기 추가 기능이 사용하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
      참고: 데스크톱 버전의 Excel에서 해 찾기를 사용하도록 설정하려면 파일 > 옵션 > 추가 기능으로 이동하여 해 찾기 상자를 선택합니다. 엑셀을 다시 시작합니다.
   9. 4개 이상의 열에 "모델링됨", "잔차", "매개 변수" 및 "매개 변수 값"으로 레이블을 지정합니다. 첫 번째 열이 실험 매개 변수, 독소 농도 및 %특이적 용해에 해당하는지 확인합니다(표 2).
   10. "매개 변수" 열에 L, k, c, SUM 및 LC50 매개 변수를 추가합니다. "매개 변수 값" 열에 100, 0.05, 1,000 값을 입력하여 매개 변수 L, k 및 c를 초기화합니다.
   11. "modeled" 열에서 다음 수식을 사용하여 로지스틱 모델을 생성합니다.
       (식 4)
       L, k 및 c를 "매개 변수 값" 열의 해당 매개 변수가 포함된 셀로 설정합니다.
       x를 독소 농도를 포함하는 세포로 설정합니다.
       참고: 표 2, 셀 G4의 경우 수식은 =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5)))
   12. 이 방정식을 무독소 대조군을 제외한 모든 %특이적 Lysis 값에 적용합니다.
   13. "잔차" 열에서 다음 방정식을 사용하여 모델링된 수와 실제 특정 용해 간의 차이의 제곱을 계산합니다.
       (식 5)
       여기서 y는 실험적 %특이적 용해이고; m은 2.4.10-2.4.11 단계에서 계산 된 "모델링 된"열의 해당 값입니다.
   14. "SUM" 옆의 "매개 변수 값" 열에서 잔차 열의 모든 값을 합산합니다.
   15. "LC50" 옆에 있는 "매개변수 값" 열에서 방정식을 초기화하여 결정된 값에서 LC₅₀ 을 계산합니다. 이것은 m = 50일 때 x 에 대해 식 4를 푸는 것입니다.
       (식 6)
       표 2의 경우 Excel 수식은 =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4입니다.
   16. 데이터 탭에서 솔버를 엽니다. 목표 설정을 선택하여 계산된 잔차의 합을 포함하는 셀이 되도록 합니다. 최소로 설정합니다.
   17. L, k 및 c의 매개 변수 값에 대한 변수 셀을 변경합니다.
       참고: 솔버는 "제약 조건이 없는 변수를 음수가 아닌 값으로 만들기"를 선택한 상태로 두면 더 잘 동작할 수 있습니다.
   18. 음수 k 값의 경우 k에서 -1을 인수 분해하여 식4 및 식 6을 수정하여 k를 양수로 변경합니다. GRG 비선형 해결 방법을 사용합니다. 해결을 클릭합니다.
   19. 곡선을 확인하고 LC₅₀ 이 식 6을 사용하여 자동으로 계산되는지 확인합니다(표 2). %특이적 용해와 독소 농도에 대한 모델링을 모두 그래픽으로 플로팅하여 적합성을 확인합니다.
       참고: 곡선에 대한^R2 를 계산하여 확인할 수도 있습니다.

3. 독소 도전 L. 주요 프로마스티고테의 단백질 분석

1. L. 주요 프로마스티고테를 섹션 1에 설명된 대로 준비합니다.
2. 5mL 피펫(예: 무혈청 M199)을 사용하여 원하는 분석 완충액 2mL에 2 x 10⁷ WT, spt2^- 및 spt2^-/+SPT2 L. 주요 프로마스티고트를 재현탁합니다. 독소를 최종 아용해 농도에 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
   참고: 예를 들어, spt2^- 프로마스티고테에 대한 SLO의 전분해 용량은 500 HU/mL입니다.
3. 다른 유전자형 및 무독소 대조군을 포함합니다.
4. 프로마스티고테를 1,500 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 10 mL 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 세포 펠릿이 들어있는 닫힌 튜브를 생물 안전 캐비닛의 그릴과 같은 불규칙한 표면을 가로 질러 빠르게 세 번 실행하여 세포 펠릿을 분해하십시오.
   알림: 셀 펠릿은 육안으로는 거의 보이지 않습니다.
5. 사용 직전에 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼를 2-메르캅토에탄올로 재구성하고 셀 펠릿에 첨가하기 전에 10분 동안 95°C로 가열합니다. 뜨거운 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁하고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 재현탁된 세포 펠릿을 95°C의 1x 샘플 버퍼에서 10분 동안 가열합니다.
   참고: 샘플 버퍼에 가용화한 후 필요한 경우 샘플을 -20°C에서 장기간 보관하십시오.
6. 분해 젤을 준비하십시오. 과황산암모늄(APS)과 TEMED를 제외한 모든 성분을 15분 동안 탈기합니다.
7. 젤을 주조하기 직전에 APS와 TEMED를 첨가하십시오. 분해 젤을 물로 조심스럽게 덮습니다. 분해능 겔이 중합되도록 ~30-45분 동안 기다립니다.
8. 물을 따라 내고 스태킹 젤을 준비하십시오. 거품이 발생하지 않도록 주의하면서 스태킹 젤을 추가합니다. 관련 웰 수가있는 빗을 넣고 5 분 동안 중합하십시오. 남은 스태킹 젤을 사용하여 중합을 모니터링합니다.
9. SDS-PAGE를 실행하기 위한 젤을 조립하고 챔버에 저장소 버퍼를 추가합니다.
10. 웰당 각 시료 10μL 또는 단백질 래더 8μL를 로드합니다. 샘플이 분해능 젤에 들어갈 때까지 180V에서 실행한 다음 전압을 ~160V로 낮추고 염료 전면이 플레이트 가장자리에서 ~0.5cm가 될 때까지 실행합니다.
    알림: 샘플이 바닥에 도달하는 데 걸리는 시간은 1-1.5 시간 사이에서 달라질 수 있습니다. 전압을 감소시킴으로써 시간이 길어질 수 있다. 전압을 0으로 낮추지 마십시오. 더 높은 전압은 젤 "미소"를 증가시키고 플레이트를 깨뜨릴 수 있습니다.
11. 젤을 Coomassie 염색(단백질 염색용) 또는 1x 전사 완충액(웨스턴 블로팅용)으로 옮깁니다. 쿠마시 염색의 경우 밤새 염색한 다음 염색, 이미징 및 건조합니다.
12. 웨스턴 블롯의 경우 제조업체의 지침에 따라 전송 시스템을 준비하십시오.
13. 습식 전사의 경우 차가운 1x 전사 버퍼와 사전 습윤 패드, 여과지 및 니트로셀룰로오스를 사용하십시오. 여기에 사용된 Bio-rad Protean III 시스템( 재료 표 참조)의 경우 여과지를 10cm x 7.5cm로 절단할 수 있습니다. 니트로 셀룰로오스를 9cm x 6.75cm로 자릅니다.
    알림: 니트로셀룰로오스는 가연성이 높습니다. 화염 및 기타 잠재적 인 점화원을 피하십시오.
14. 패드, 여과지 및 니트로셀룰로오스로 전사 카세트를 배치합니다. 기포를 굴립니다. 젤을 조심스럽게 첨가하십시오.
15. 여과지를 넣고 기포를 펼칩니다. 패드를 추가하고 카세트를 닫은 다음 올바른 방향으로 홀더에 삽입합니다(니트로셀룰로오스가 빨간색 단자를 향하도록 함). 교반 막대와 얼음 팩을 측면에 추가하고 차가운 1x 전달 버퍼로 저장소를 채웁니다. 110V에서 90분 동안 전송합니다.
    알림: 전송 중에 발생하는 열은 전송에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 좋은 전송을 보장하려면 항상 콜드 1x 전송 버퍼를 사용하십시오.
16. 니트로셀룰로오스를 제거하고 Ponceau 용액으로 ~5분 동안 염색합니다. 초순수로 헹굽니다. 단백질 사다리를 연필로 표시하고 필요에 따라 얼룩을 다듬습니다. 남은 전송 버퍼를 사용하여 얼룩을 제거하십시오.
    참고: 폰소는 여러 번 재사용할 수 있습니다.
17. 니트로셀룰로스를 4°C에서 1x TBST로 5% BSA 중 25mL로 차단하고, 밤새 진탕하였다. 그런 다음 블로킹 용액을 버리고 1x TBST의 1% BSA에 1차 항체(1:1,000)를 추가합니다. 4°C에서 밤새 흔든다.
    참고: 1차 항체는 -20°C에서 저장하여 여러 번 재사용할 수 있습니다.
18. 니트로셀룰로오스를 흔들면서 3x TBST에서 각각 10분 동안 1회 세척합니다. 세척물을 버리고 10mL의 HRP-접합 2차 항체(1:10,000)를 1x TBST의 1% BSA에 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 흔들어주십시오. 니트로셀룰로오스를 흔들면서 3x TBST에서 각각 10분 동안 1회 세척합니다.
19. 니트로셀룰로오스를 이미징하기 직전에 ECL 시약을 준비합니다. 이미징 직전에 TBST를 디캔트하고 ECL 시약을 니트로셀룰로오스에 추가합니다. 1분 동안 흔듭니다. 젤을 이미지화합니다.

Results

M199에 비해 Tyrode의 버퍼에서 SLO에 대한 프로마스티고트 민감도 증가
L. 주요 프로마스티고테의 SLO 민감도를 상이한 분석 완충액 간에 비교하였다. 야생형, spt2^- 및 spt2^-/+SPT2 프로마스티고테는 유세포분석기에서 분석하기 전에 30분 동안 2mM_CaCl2가 보충된 무혈청 M199 또는 Tyrode의 완충액에서 SLO로 도전되었습니다. 분석에 적합한 기생충은 전방/측면 산란 프로파일에 의해 확인된 단일 세포였다(도 3A,B). 데이터는 채널 BL1 (488 여기, 530/30 방출 필터)을 자동 형광 대조군으로 사용하고 PI에 대해 YL1 (561nm 여기, 585/16 방출 필터)을 사용하여 수집하였다. BL1은 잠재적인 자가형광 또는 보상 문제를 식별하는 데 사용되었습니다(

Discussion

본 연구에서는 인간 병원균 리슈만편모충 전공 을 모델 시스템으로 사용하여 PFT의 분자 메커니즘과 기능을 연구하는 방법을 설명했습니다. 단일 세포 생존율을 측정하기 위한 배지-처리량 유세포분석-기반 세포독성 분석법이 개발되었다. LC₅₀ 값은 로지스틱 모델링을 사용하여 용량-반응 곡선에서 계산할 수 있기 때문에 모집단 수준에서 생존력이 정량적입니다. 원리 증명으로 유세포 분석 분석을 사용하여 배지의 선택이 SLO에 대한 야생형 및 스핑고지질 결핍 L.major 민감도를 변경할 수 있음을 설명하고 각 배지에서 과용해 독소 용량을 결정했습니다. 다운스트림 분석의 원리 증명으로, 포스포-MAPK 및 포스포-ERK 항체는 독소 챌린지 동안 L. 주요 프로마스티고테에서 테스트되었습니다. 전반적으로, L. 주요 프로마스티고테스는 세포에 대한 독소 매개 손상의 메커니즘과 기능을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있는 병원적으로 관련이 있고 유전적으로 다루기 쉬운...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL 마이크로타이터 (마쉬) 튜브	Fisher	02-681-376	세포독성 분석
1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브	Fisher	05-408-129	독소 희석
15 mL 원심분리기 튜브	Avantor VWR (Radnor, PA)	89039-666	세포와 매체를 보관하기 위해
1x 인산염 완충 식염수 (PBS)	Fisher	BP399	세포 처리용
3% H2O2	월마트  (아칸소 주 페이엇빌)	N/A	ECL용
5x M199	Cell-gro	11150067	L. major promastigotes용 기저 성장 배지
Biosafety cabinet	Baker		멸균 조건에서 세포 배양
소 혈청 알부민(BSA)	Fisher	BP1605-100	Fraction V 허용 순도
CaCl2	Fisher	BP510-100	재고 농도 100 mM
원심분리기	Thermo Fisher	Heraeus Megafuge 40R	배양에서 세포를 펠릿화하려면
Cy5 Mono-reactive dye pack	Cytiva (Marlborough, MA)	PA25031	독소용 형광단 라벨
디지털 건식 수조	벤치마크	BSH1002	단백질 샘플을 변성시키기 위해
EGTA	Amresco	0732-100G	재고 농도 0.5 M
Excel	Microsoft (Redmond, VA)		데이터 분석
소프트웨어 유세포 분석기 (4-laser Attune NxT)		데이터 수집을 위한
FlowJo	BD (Ashland, OR)		소프트웨어
포름알데히드	Fisher	BP531-500	세포 계수용 고정제
G418	Fisher	BP673-1	세포 선택제
Hellmanex III	Sigma	Z805939	희석 1:4 세포분석기 세척용
혈구계	Fisher	0267151B	세포 계수용
인간 적혈구	Zen-bio (Durham, NC)	SER-10MLRBC	독소 활성을 검증하기 위해
얼음 양동이
광학 현미경	Nikon	Eclipse 55i	세포를 시각화하기 위해
니트로셀룰로오스	Fisher	88018	프로빙용 항체를 통한 단백질
Pipettor 및 Tips	Avantor VWR		시약 분배
전원 공급 장치	Bio-Rad		SDS-PAGE 실행 및 전송
Propidium	iodide Biotium	40016	물 내 재고 농도 2 mg/mL
단백질 ladder	Bio-Rad	161-0373	단백질의 분자량
측정 SDS-PAGE 실행 장치(Mini Protean III)	Bio-Rad	165-3302	크기에 따라 단백질을 분리하려면
테이프	R& D	DY992	세포로 플레이트를 밀봉하기 위해
Streptolysin O C530A 플라스미드 삽입			pBAD-gIII 벡터로 복제 (참조: 7)
Streptolysin O C530A 독소	실험실 정제		특정 활성  4.34 x 105 HU/mg
스윙 버킷 로터	Thermo Fisher	75003607	세포 원심분리,
V-bottom plate	Greiner Bio-one	651206	세포독성 분석용
Vortex	Benchmark	BV1000	세포 혼합용
웨스턴 블롯 이미징 시스템(Chemi-doc)	Bio-Rad		웨스턴 블롯으로 단백질 시각화
웨스턴 블롯 전달 장치(Mini Protean III)	Bio-Rad	170-3930	전송 단백질을 니트로셀룰로오스로
변환하는 Whatman 필터 종이	GE Healthcare Life Sciences	3030-700	단백질을 니트로셀룰로오스로 전달하는 데 사용됩니다
<강한>항체
ERK 항체	세포 신호 기술	Cat# 9102S	Rabbit (1:1000 dilution)
Anti-lipophosphoglycan (LPG) 항체	CreativeBioLabs	Cat# WIC79.3	마우스 (1: 1000)
Anti-MEK 항체	세포 신호 기술	Cat# 9122L	Rabbit (1:1000)
안티-마우스 IgG, HRP 접합체	Jackson Immunoresearch	Cat#715-035-151	당나귀 (1:10000)
Anti-phosphoERK 항체	세포 신호 기술	Cat# 9101S	Rabbit (1:1000)
Anti-pMEK 항체	세포 신호 기술	Cat# 9121S	Rabbit (1:1000)
안티-토끼 IgG, HRP 접합체	Jackson Immunoresearch	Cat#711-035-152	당나귀 (1:10000)
안티-튜불린 항체	Sigma	Cat# T5168	마우스 (1: 2000)
Leishmania major Genotypes			Reference: 13
Episomal addback (spt2-/+SPT2)			Δ spt2::HYG/&델타; spt2:PAC/+pXG-SPT2
세린 팔미토일트랜스퍼라제 서브유닛 2 녹아웃(spt2-)			&델타; spt2::HYG/&델타; spt2::P AC
와일드 타입(WT)			LV39 클론 5(Rho/SU/59/P)