줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있어 인간 심장에 대한 더 나은 전임상 모델이 절실히 필요합니다. 조직 공학은 기초 과학 심장 연구에 매우 중요합니다. 체외 인간 세포 배양은 동물 모델의 종간 차이를 제거하는 반면, 조직과 유사한 3D 환경(예: 세포외 기질 및 이세포 결합)은 플라스틱 페트리 접시에 대한 기존의 2차원 배양보다 생체 내 조건을 더 많이 시뮬레이션합니다. 그러나 각 모델 시스템에는 맞춤형 바이오리액터 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 필요합니다. 또한 이러한 프로토콜은 종종 복잡하고 노동 집약적이며 작고 섬세한 조직의 결함으로 인해 어려움을 겪습니다.
이 논문은 조직 기능의 종단 측정을 위해 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 강력한 인간 공학 심장 조직(hECT) 모델 시스템을 생성하는 프로세스를 설명합니다. 선형 스트립 형상을 가진 6개의 hECT를 병렬로 배양하며, 각 hECT는 PDMS 랙에 부착된 한 쌍의 힘 감지 폴리디메틸실록산(PDMS) 포스트에 매달려 있습니다. 각 게시물은 사용 편의성, 처리량, 조직 보존 및 데이터 품질을 개선하는 새로운 기능인 검은색 PDMS SPoT(Stable Post Tracker)로 제한됩니다. 이 모양은 포스트 편향의 신뢰할 수 있는 광학 추적을 가능하게 하여 절대적인 능동 및 수동 장력으로 향상된 트위치 힘 추적을 제공합니다. 캡 형상은 포스트에서 미끄러지는 hECT로 인한 조직 손상을 제거하고, PDMS 랙 제조 후 두 번째 단계를 포함하므로 바이오리액터 제조 공정을 크게 변경하지 않고도 SPoT를 기존 PDMS 포스트 기반 설계에 추가할 수 있습니다.
이 시스템은 생리학적 온도에서 hECT 기능 측정의 중요성을 입증하는 데 사용되며 데이터 수집 중에 안정적인 조직 기능을 보여줍니다. 요약하면, 우리는 체외 응용을 위해 조작된 심장 조직의 생체 충실도, 효율성 및 엄격성을 발전시키기 위해 주요 생리학적 조건을 재현하는 최첨단 모델 시스템을 설명합니다.
서론
엔지니어링된 심장 조직 모델은 기존의 2차원 세포 배양으로는 달성하기 어려운 천연 심장 틈새의 다양한 측면을 재현하기 위해 다양한 형상과 구성으로 제공됩니다. 가장 일반적인 구성 중 하나는 선형 조직 스트립으로, 각 끝에 유연한 앵커가 있어 조직 자가 조립을 유도하고 조직에 정의된 예압과 결과 경련력 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
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프로토콜
이 프로토콜은 비식별화된 iPSC 라인인 SkiPS 31.3(원래는 건강한 45세 남성의 피부 섬유아세포를 사용하여 재프로그래밍됨)47을 사용했으며, 따라서 기관의 인간 연구 윤리 위원회 지침에 따라 특정 기관 검토 위원회의 승인에서 면제되었습니다. HEPA 여과 클래스 II 생물 안전 캐비닛 또는 층류 작업대의 무균 조건에서 모든 세포 및 hECT 조작을 수행합니다. 0.22μm 필터를 통한 여과로 모든 비멸균 용액을 멸균하고 모든 세포와 hECT를 37°C, 95% 상대 습도 및 5%CO2에서 인큐베이터로 유지합니다.
1. 생물반응기 제작
- 바이오리액터 구성품 및 알루미늄 마스터 캐스트 제작
참고: CAD(Computer-Aided Design) 파일은 보충 파일 1에 제공됩니다. 프로토콜은 이러한 단계 사이의 어느 곳에서나 일시 중지될 수 있습니다. 정확한 포스트 형상과 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 베이스 플레이트에 폴리설폰 프레임을 적절하게 압입하기 위해서는 높은 공차(≤5μm)와 매끄러운 마감이 필요하므로 이 섹션에 설명된 마스터 금형을 제조할 전문 기계공....
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결과
위의 프로토콜에 따라, 심근세포는 이전에 우리 그룹 9,15에서 사용했던 건강한 iPSC 라인에서 생성되었으며 배양 8-61일 후에 hECT로 제조되었습니다. 그림 9A는 아래에서 본 hECT의 대표 이미지를 보여주며, SPoT를 사용하지 않고(위) SPoT를 사용하지 않고(아래) 만든 것입니다. 기능 측정은 hECT 제조 후 37일에서 52일 사이에 실온(23°C) 및 생리학적 온도(36°C)에서 수행되었습니다. PDMS 랙을 제작할 때 숙련된 사용자는 6개의 포스트가 모두 손상되지 않은 상태에서 PDMS 랙에서 80%의 수율을 기대할 수 있으며, 최소 5개의 포스트(당사 실험실의 3명의 사용자 기준)에서 전체 95%의 수율을 기대할 수 있으며, 포스트 높이의 변동성은 <3%입니다.
SPoT는 PDMS 포스트의 팁에.......
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토론
문헌에 발표된 수많은 선형 공학 심장 조직 모델이 있으며, 그 중 일부는 표 1에 설명되어 있습니다. 일부 모델은 조직력의 직접 측정을 수반하지만, 이들은 전형적으로 작제물을 별도의 근육 욕조(38)로 이송할 것을 요구한다. 대부분의 모형은 PDMS 포스트 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16에 영구히 정박된 조직으로, 일반적으로 디자인됩니다 .......
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공개 사항
K.D.C.는 Novoheart의 공동 창립자이자 최고 과학 책임자이며 지주 회사인 Medera Biopharmaceutical의 지분을 보유하고 있습니다. Novoheart는 이 연구의 자금 지원, 계획 또는 실행에 기여하지 않았습니다. 그러나 이 연구 결과는 잠재적으로 노보하트와 메데라에 재정적 영향을 미칠 수 있다. 다른 저자들은 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 이 방법에 대한 이전 연구에 대해 Timothy Cashman 박사를 인정합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)(R01-HL132226 및 K01 HL133424)과 Leducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)의 자금 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25 mm 직경 304 스테인레스 스틸 와이어 | McMaster Carr | 6517K61 | |
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.7 mL 마이크로튜브 | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm 접시(높이 20 mm) | Corning | 353003 | |
| 10 mL 혈청학 피펫 | Drummond | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | 멸균 증류수 10X에 1:10 희석 |
| 수정된 독수리 매체 | 시그마 Aldrich | M0275 | |
| 20 - 200 μ L 마이크로피펫 | Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μ L 마이크로피펫 팁 | VWR | 76322-150 | |
| 5 mL 혈청학 피펫 | Drummond | 6-000-005 | |
| 50 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Falcon | 352070 | |
| 6 cm 페트리 디쉬 | Corning | 353002 | |
| 6 와트 LED 듀얼 구즈넥 조명기 | AmScope | LED-6W | |
| 6-웰 플레이트 | Corning | 353046 | |
| 90도 각도 거울 | Edmund Optics | 45-594 | |
| 아크릴 본딩 접착제 | SCIGRIP# | 4 | |
| 조정 가능한 10cm x 10cm 잭 | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| 알루미늄 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10X 대물 렌즈 | ZEISS | 1020-863 | |
| 오토클레이브 백 | 프로퍼 | 21002 | |
| B-27 보충제 | ThermoFisher | 17504044 | |
| B-27 보충제(인슐린 제외) | ThermoFisher | A1895601 | |
| 벤치탑 원심분리기 | Eppendorf | 5810 R | |
| 블랙 ABS | Ultimaker | 2.85mm 너비 | |
| 소 콜라겐 I | Gibco | A1064401 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| 클래스 II 생물 안전 캐비닛 | Labconco | 3430009 | |
| 투명 아크릴 시트 | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm 두께 |
| CNC 수직 밀 | Haas | VF-1 | |
| 전도성 흑연 바 | McMaster Carr | 1763T33 | |
| 해부 현미경 | Olympus | SZ61 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | 물에서 70%로 희석 |
| EVE 자동 세포 계수기 | NanoEntek | E1000 | |
| EVE 세포 계수 슬라이드 | NanoEntek | EVS-050 | |
| 태아 소 혈청 | Life Technologies | 10438026 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | 일명 "인큐베이터". HEPA 클래스 100 필터 |
| Fusion360 소프트웨어 Autodesk | , 일명 "CAD 소프트웨어" | ||
| , 유리 혈구계 | Reichert | 1475 | 0.1mm 깊이 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC 인증 matrigel | Corning | 354277 | 일명 "기저막 매트릭스". 냉동 부분 표본에 보관 |
| 고속 CCD 카메라 | PixelLINK | P7410 | |
| 도립 현미경 | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X 위상차 대물 |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView 소프트웨어 | National Instruments | 2016 | |
| 층류 클린 벤치 | NuAire | NU-201-330 | hECT 기능 분석에 필요 |
| 노트북 | AsusTek | Strix | Intel Core i& 프로세서, CPU 2.8GHz, 16GB |
| RAM 레이저 절단기 | Epilog | Helix 24 | |
| 확대 헤드셋 | ExcelBlades | 70020 | 미세 조작이 필요한 단계에 권장 |
| Matlab | Mathworks | 버전 2019b 이상 | 일명 "데이터 분석" 소프트웨어 " |
| 마이크로 Vannas 가위, 3mm 블레이드 | WPI 기기 | 501839 | |
| 현미경 붐 스탠드 | 올림푸스 | SZ2-STU1 | |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 재고 솔루션 | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU / ml 페니실린; 10,000 μ g/ml 스트렙토마이신 |
| 2가 양이온이 없는 인산염 완충 식염수 | Sigma Aldrich | P3813 | 증류수에 1X 및 10X 농도로 희석 |
| 피펫 컨트롤러 | Drummond | 4-000-100 | |
| PixelLINK 캡처 OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | 일명 "카메라 소프트웨어" |
| Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | 반투명 호박색 |
| 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | 블랙, 몰드 |
| ReLeSR | 줄기 세포 기술 | 5872 | 일명 "iPSC 해리 매체" |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 매체 | ThermoFisher | 11875135 | |
| 실리콘 시트 | SMI 제조 | 광택, 두께 0.02, 경도계 40 | |
| 크기 10/0 파란색, 녹색, 빨간색 및 노란색 유리 씨앗 구슬 | Michael의 | 고압클레이 | |
| 스파툴라 | 피셔 사이언티픽 | 14-373 | 혼합하는 데 사용됩니다 |
| . | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
| 스테인레스 스틸 Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | 경도가 낮기 때문에 비 스테인레스 스틸보다 선호 |
| Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | 일명 "iPSC 배양 매체" |
| 멸균 증류수 | ThermoFisher | 5230 | |
| Sylgard 170 - 실리콘 엘라스토머 봉지재 블랙 0.9kg 키트 | Dow | DOWSIL 170 2LB 키트 | AKA 블랙 폴리디메틸실록산(블랙 PDMS) |
| Sylgard 184 - 실리콘 엘라스토머 투명 1lb 키트 | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB 키트 | AKA 폴리디메틸실록산(PDMS) |
| 온도 제어 가열 스테이지 | Okolab | H401-HG-SMU | 높이를 10cm로 설정 |
| 열가소성 3D 프린터 | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
| Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
| 진공 챔버 | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
| 가변 속도 미니 밴드 톱 | Micro-Mark | 82203 | |
| 가변 속도 소형 드릴 프레스 | Micro-Mark | 82959 | |
| 진동 절연 테이블 | Labconco | 3618000 | |
| 계량 보트 | VWR | 10803-140 | |
| Talon 실린더 벤치 클램프 | VWR | 97035-528 | AKA 나사 클램프 |
참고문헌
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Turnbull, I. C., et al.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
