생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

Summary

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

Abstract

부분 간 절제술은 생쥐의 간 재생을 조사하는 데 널리 사용되어 왔지만 다운스트림 단일 세포 적용을 위한 생존 가능한 간세포의 높은 수율의 분리는 어려운 일입니다. 재생 간세포 내 지질의 현저한 축적은 생쥐에서 정상적인 간 재생의 처음 2 일 동안 관찰됩니다. 이 소위 일시적인 재생 관련 지방증(TRAS)은 일시적이지만 주요 증식 단계와 부분적으로 겹칩니다. 밀도 구배 정제는 원발성 간세포의 분리를 위한 대부분의 기존 프로토콜의 중추입니다. 그래디언트 정제는 세포의 밀도와 크기에 의존하기 때문에 비지방성 간세포 집단과 지방성 간세포 집단을 분리합니다. 따라서 지방 간세포는 종종 손실되어 비대표성 간세포 분획을 생성합니다.

제시된 프로토콜은 지질 함량에 관계없이 재생 간세포의 생체 내 분리를 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 수컷 C57BL/6 마우스의 간세포는 고전적인 2단계 콜라게나제 관류 접근법에 의해 간 절제술 후 24-48시간 후에 분리됩니다. 표준 연동 펌프는 문맥을 통해 유출되는 역행 관류 기술을 사용하여 카테터가 삽입된 하대정맥을 통해 따뜻해진 용액을 잔여물로 구동합니다. 간세포는 Glisson 캡슐에서 방출하기 위해 콜라게나제에 의해 해리됩니다. 세척 및 신중한 원심분리 후, 간세포는 모든 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다. 결론적으로, 이 논문은 생쥐에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 분리하기 위한 간단하고 재현 가능한 기술을 설명합니다. 이 방법은 또한 지방간 질환의 연구에 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

간은 주요 조직 손실 후에도 스스로 재생될 수 있습니다. 이 독특한 재생 능력은 1931년 Higgins와 Anderson이 쥐에서 처음 기술한 부분적(70%) 간 절제술의 실험 모델에 의해 명시적으로 설명됩니다¹. 이 모델에서는 더 큰 간엽을 잘라내어 동물에서 간장의 70%를 외과적으로 제거합니다. 나머지 엽은 보상 비대를 통해 성장하여 수술 후 약 1 주일 이내에 원래의 간 덩어리를 회복하지만 원래의 간 구조를 복원하지는 않습니다 ^2,3. 간 잔여물이 너무 작아서 회복할 수 없는 86% 확장 간절제술과 같이 다양한 양의 조직 제거를 가진 추가 간 절제술이 개발되어 결국 간 절제술 후 간부전(PHLF) 및 동물의 30%-50%에서 후속 사망으로 이어집니다 ^4,5,6. 이 모델은 절제된 조직의 양에 따라 정상 및 실패한 간 재생에 대한 연구를 가능하게 합니다(그림 1).

간 절제....

Protocol

모든 동물 실험은 스위스 연방 동물 규정에 따라 이루어졌으며 취리히 수의과(n° 007/2017, 156/2019)의 승인을 받아 인간의 보살핌을 보장했습니다. 10-12주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간 주야간 주기로 유지했습니다. 각 실험군은 6-8마리의 동물로 구성되었다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 장비 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 생쥐의 부분 간 절제술

1. 표준 간 절제술(70%)의 경우 왼쪽 측엽, 정중엽의 오른쪽 부분 및 정중엽의 왼쪽 부분을 결찰 및 절제합니다(그림 1B). 확장 간 절제술 (86 % ⁴)의 경우 꼬리 엽과 우측 전엽도 제거하십시오 (그림 1C).
2. 참고: 표준 간 절제술은 수년 동안 간 재생 연구에 사용되어 온 절차입니다. 이 절차에 대한 프로토콜은 Mitchell 및 Willenbring 18의 비디오 지원 프로토콜을 포함하여 ^3,17<....

Results

TRAS는 간 절제술 후 16시간에 최고조에 달하고 표준 간 절제술 후 32-48시간 후에 점차 사라지지만 연장된 간 절제술 후 48시간 이상 지속됩니다. 거시적으로 TRAS는 간 잔여물의 창백한 안색으로 쉽게 볼 수 있으며(그림 1F) 수술 후 16시간에서 48시간 사이에 간 절제술을 받은 마우스에서 관찰할 수 있습니다.

추정 된 최종 수율은 마우스에서 70 % 간 절제술 후 10-15 × 10 6 간세포, 연장 된 86 % 간 절제술 후 4-9 × 10⁶이며, 평균 최종 생존율은 각각 78 % 및 65 %이다. 이는 전체 마우스 간에서 50-70 × 10⁶의 총 수율과 비교하여 예상되는 백분율에 해당합니다(그림 6A,C). 부분 간절제술 후, 간세포는 증가된 지질 함량에 상응하는 정.......

Discussion

공개된 프로토콜은 FACS 분류 후 단일 세포 다운스트림 분석 또는 세포의 벌크 분석을 위해 정상 및 지방성 쥐 간세포의 높은 수율을 분리하는 신뢰할 수 있고 간단한 방법을 제공합니다. 밀도 구배 정제에 비해 뚜렷한 이점은 세포 지질 함량이 본질적으로 간세포의 효과적인 수율에 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 따라서 지방성 간세포의 비율은 유지되고 다운스트림 분석에 포함됩니다. 이것은 지방성 간 질환 연구에 중요할 뿐만 아니라 간세포가 재생 후 처음 2-3일 이내에 시간적, 공간적으로 역동적인 지방증을 나타내는 주요 간 절제술 이후의 과정 분석에 가장 중요합니다. 분리된 간세포에 대한 (단세포) 분석이 이미 간절제술 19,20,21 후에 수행되었지만^, 분석된 세포 집단은 적어도 부분적으로 지질이 함유된 간세포가 결핍되어 그 결과가 완전히 대표적이지 않고 희박한 간세포로 치우쳐 있다고 가정해야 합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	아민 반응성 생존 염료
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%	Provet AG		QN01AB06 주의: 환기
필요 EDTA 용액	Sigma-Aldrich	E8008-100ML-Ethanol
	Sigma-Aldrich	V001229	70%
소태아 혈청(FCS)	Gibco	A5256701-Hanks
' Balanced Salt Solution(HBSS), Ca2+, Mg2+, 페놀 레드	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	소화/보존용
Hanks' Balanced Salt solution(HBSS), Ca2+ 제외, Mg2+ 없음, 페놀 레드 없음	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	관류 완충액
HEPES 용액의 경우, 1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F-Histoacryl
조직 접착제(부틸-2-시아노아크릴레이트)	B. Braun	1050052	캐뉼레이션 사이트 안정화용
Hoechst 33258 염색 염료 용액	Abcam	ab228550	-
Liberase 연구 학년	Roche	5401119001	동결 건조 콜라겐 분해 효소 I / II
NaCl 0.9 % 500 mL Ecotainer	B. Braun	123-Paralube
Vet Ointment	Dechra	17033-211-38-Phosphate
완충 식염수 (PBS)	Gibco
A1286301-Sudan IV – 지질 염색	Sigma-Aldrich
V001423-Temgesic(부프레노르핀 염산염), 주입용 용액 0.3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	마약. 안전하게 보관하십시오.
트리판 블루, 0.4%, 멸균 여과	Sigma-Aldrich	T8154	Williams의 세포 계수용
Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
Materials
25 mL 혈청학 피펫, Greiner Cellstar	Merck	P7865-50
mL Falcon 튜브	TPP	-	-
BD Neoflon, Pro IV 카테터 26 G	BD Falcon		391349-Cell
스크레이퍼, 회전 블레이드 너비 25 mm	TPP	99004-Falcon
Cell Strainer 100 &마이크로; m 나일론	BD Falcon	352360-Fenestrated
무균 수술 드레이프		--	재사용 가능한 천 소재
16# 튜빙(ID 3.1mm)	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	튜브에 들어가려면
유세포 분석 튜브, 5mL	BD Falcon	352008-Male
Luer to Barb, 튜빙 ID 3.2mm	Drifton	LM41	연결 튜브 주사기에
페트리 접시, 96 x 21 mm	TPP	93100-Prolene
5-0	Ethicon	8614H	흉골
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	피부 봉합
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	합자 담낭
튜브 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm	Drifton	SC0374T	관류 튜브
Equipment
BD LSRFortessa 세포 분석기 유세포 분석기	BD-		-
Isis 설치류 면도기	Aesculap	GT421-Isofluran
스테이션	Provet	-	-
저속 원심분리기 – Scanspeed 416	Labogene	-
-Neubauer-개선된 계수 챔버	Marienfeld	-	-
산소 집중 장치 – 에버플로	필립스	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – 피펫터 터보-픽스	TPP	94700-Shenchen
관류 펌프 – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x	-
외과 현미경 – SZX9	올림푸스	-	-
ThermoLux 온난화 매트	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092	-
수조 – 정밀 GP 02	Thermo	scientific-42	°로 조정; 씨