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방법 논문

IDG-SW3 3차원 세포외 기질에서의 세포 배양

2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64507

⸱

2023년 11월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Shanghai Key Laboratory for Prevention and Treatment of Bone and Joint Diseases, Shanghai Institute of Traumatology and Orthopaedics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 3차원(3D) 세포외 기질에서 IDG-SW3 세포를 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

골세포는 조골세포에서 말단으로 분화된 비증식성 세포로 간주됩니다. 뼈 세포외 기질(osteoid)에 내장된 조골세포는 Pdpn 유전자를 발현하여 세포 수상돌기를 형성하고 전골세포로 변형됩니다. 나중에, 전골세포는 Dmp1 유전자를 발현하여 기질 광물화를 촉진하여 성숙한 골세포로 변형시킵니다. 이 과정을 골세포 형성이라고 합니다. IDG-SW3는 골세포 형성의 시험관 내 연구를 위한 잘 알려진 세포주입니다. 이전의 많은 방법은 콜라겐 I을 배양 매트릭스의 주요 또는 유일한 구성 요소로 사용했습니다. 그러나 골골에는 콜라겐 I 외에도 세포 성장, 접착 및 이동을 촉진하는 중요한 구성 요소인 지상 물질도 포함되어 있습니다. 또한 매트릭스 물질은 투명하여 콜라겐 I 형성 겔의 투명도를 높이고 이미징 기술을 통해 수상돌기 형성을 탐색하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 논문은 IDG-SW3 생존을 위해 콜라겐 I과 함께 세포외 기질을 사용하여 3D 겔을 확립하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 연구에서는 골세포 형성 중에 수상돌기 형성과 유전자 발현을 분석했습니다. 7일간의 골형성 배양 후, 형광 컨포칼 현미경으로 광범위한 수상돌기 네트워크가 명확하게 관찰되었습니다. Real-Time PCR은 Pdpn 및 Dmp1 의 mRNA 수준이 3주 동안 지속적으로 증가하는 것을 보여주었습니다. 4주차에 실체현미경은 X선 형광(XRF) 분석과 일치하는 광물 입자로 채워진 불투명 겔을 보여주었습니다. 이러한 결과는 이 배양 매트릭스가 조골세포에서 성숙한 골세포로의 전환을 성공적으로 촉진한다는 것을 나타냅니다.

서론

골세포는 조골세포 1,2에서 유래한 말단 분화 세포입니다. 조골세포가 조골세포에 의해 매몰되면 골세포 형성을 거쳐 Pdpn 유전자를 발현하여 전골세포를 형성하고, Dmp1 유전자를 발현하여 골세포를 광물화하고, Sost와 Fgf23 유전자를 발현하여 뼈 조직에서 성숙한 골세포로 기능한다3. 여기에서는 골세포 형성 과정에서 수상돌기 확장 및 마커 유전자 발현을 식별하기 위해 3D 배양 시스템을 도입합니다.

IDG-SW3 세포는 형질전환 마우스에서 유래한 불멸의 1차 세포주이며, 다른 배지에서 배양할 경우 골아세포를 후기 골세포 분화로 확장하거나 복제할 수 있다4. MLO-A5, MLO-Y4 및 기타 세포주와 비교했을 때, 기능성 단백질의 발현 프로파일, 칼슘염 침착 수행 능력, IDG-SW3 세포의 다양한 호르몬에 대한 반응은 뼈 조직의 일차 골세포와 동일할 가능성이 더 높다4.

2D 시스템에 비해 3D 배양 시스템은 영양 구배, 낮은 기계적 강성 및 주변 기계적 범위를 포함하여 생체 내 세포 성장 환경을 더 잘 모방할 수 있습니다(표 1). 3D 시스템에서 조골세포 세포를 배양하기 위한 대부분의 이전 방법은 콜라겐 I 섬유가 칼슘 및 인 침착 부위 역할을 하기 때문에 제형 4,5,6의 고유한 구성 요소로 콜라겐 I을 사용했습니다. 그러나 골골의 필수 구성 요소인 세포외 기질은 세포 성장, 접착 및 이동을 촉진하는 많은 세포 인자 그룹을 포함하고 있으며(7,8) 투명하고 이미징 관찰에 편리합니다. 따라서 이 프로토콜은 골세포 형성 연구를 위한 2차 구성 요소로 Matrigel(이하 기저막 매트릭스라고 함)을 사용합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 24웰 플레이트의 4웰에서 세포를 배양하는 데 적합합니다. 여러 샘플 또는 플레이트를 준비하는 경우 그에 따라 시약의 양을 늘려야 합니다.

1. 콜라겐 I 혼합물의 제조

참고: 콜라겐 I과 기저막 매트릭스 겔은 실온에서 빠르게 겔화됩니다. 따라서 콜라겐은 얼음 (2 °C에서 8 °C)에서 처리해야합니다. 사용된 모든 팁과 튜브는 달리 명시되지 않는 한 미리 냉각되어야 합니다. 모든 절차는 안전 후드에서 수행해야 합니다.

  1. 모든 시약과 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  2. 0.48mL의 콜라겐 I(5mg/mL)과 0.1mL의 10x 최소 필수 배지(MEM)(페놀 레드 포함)를 얼음 위에 보관된 멸균 15mL 원심분리 튜브에 천천히 피펫팅합니다. 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
  3. 페놀 레드 지시약의 색상 팔레트에 따라 7.5%(w/v) NaHCO3 (약 0.2mL)의 적절한 부피를 사용하여 페놀 레드 표시기를 주황색으로 조정하여 pH 값이 7.0-7.4 범위에 있음을 나타냅니다.
    참고 : 배지의 pH에 따라 NaHCO3 부피를 사용하여 pH를 약 7.0-7.4로 만듭니다. 또한 NaOH는 pH 중화에 사용됩니다.
  4. 적절한 부피의 ddH2O를 추가하여 혼합물의 최종 부피를 1mL까지 올립니다. 피펫팅을 위아래로 부드럽게 하여 잘 섞어 사용할 준비를 합니다.
    참고 : ddH2O의 최종 부피는 1.3 단계에서 사용 된 NaHCO3 또는 NaOH의 양에 따라 달라집니다.

2. 세포-매트릭스 혼합물의 제조

  1. 0.9mL의 기저막 매트릭스를 얼음 위의 새로운 15mL 원심분리 튜브에 천천히 피펫팅합니다.
  2. 33°C에서 50U/mL INF-γ가 보충된 4mL의 완전한 배지(10% 소 태아 혈청[FBS]를 포함하는 알파-MEM)로 T25 플라스크에서 IDG-SW3 세포를 배양합니다.
  3. IDG-SW3 세포가 90% 밀도에 도달하면 배지를 제거하고 피펫으로 인산염 완충 식염수(PBS, 프로토콜 전체에 걸쳐 pH 7.4)로 세포를 세척합니다. 0.5mL의 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 37°C에서 30초 동안 세포를 분해합니다.
  4. 3.5mL의 완전한 배지(10% 소 태아 혈청[FBS]를 함유한 알파-MEM)를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 4mL 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  5. 셀 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 얼음 위의 완전한 배지 1mL에 재현탁시킵니다.
  6. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 전체 배지로 최종 세포 밀도를 4 × 105 cells/mL로 조정합니다. 2.1단계에서 제조된 세포 현탁액 0.1mL를 세포외 기질 0.9mL에 추가합니다. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞습니다.
    참고: cell-free 대조군이 필요한 경우 음성 대조군으로 전체 배지 0.1mL를 세포외 기질 0.9mL에 추가합니다.

3. 세포-겔 혼합물 도금

  1. 2.6단계 및 1.4단계의 두 혼합물을 얼음 위에서 위아래로 피펫팅하여 2mL로 부드럽게 잘 혼합합니다. 최종 혼합물 0.5mL를 각 웰(24웰 플레이트의 웰 4개)에 피펫팅합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양하여 세포-겔 혼합물을 형성합니다.
  2. 0.5mL의 골형성 배지(50μg/mL 아스코르브산 및 4mM β-글리세로포스페이트, 골형성 유도 배지라고도 함)4 를 각 웰의 세포-겔 혼합물에 추가하여 37°C에서 골형성 분화를 시작합니다. 이를 Day 0으로 간주합니다.
  3. 2일마다 배지의 절반을 37°C에서 유지되는 신선한 골형성 배지로 교체합니다. 35일 동안 배양을 계속합니다.

4. 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 생존율과 세포 수상돌기 식별

  1. 세포 염색
    참고: 칼세인 아세톡시메틸 에스테르(칼세인 AM)는 세포 생존율을 측정하는 데 사용할 수 있는 세포 투과 염료입니다. 에티듐 호모다이머-I(EthD-1)은 온전한/생존 가능한 세포의 막을 통과하지 않는다9. 따라서 칼세인 AM/EthD-1은 세포 생존율과 세포 수상돌기를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
    1. 배양 1일차와 7일차에 칼세인 AM 원액(DMSO에서 4mM)과 EthD-1 원액(DMSO/H 2O 1:4 [v/v]에서2mM)을 냉동실에서 꺼내 실온으로 예열합니다.
      참고: 광물화된 매트릭스는 강한 자가형광 신호를 가지므로 배양 후 7일 이내에 Dmp1 발현이 없는 골전 세포 단계(preosteocyte stage)4가 세포 염색 관찰에 더 적합합니다.
    2. 2mM EthD-1 원액 4μL와 4mM 칼세인 AM 원액 5μL를 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) 2mL에 넣고 잘 섞습니다. 이를 통해 약 2μM calcein AM 및 4μM EthD-1을 작업 용액으로 사용할 수 있습니다.
    3. 작업 용액 0.5mL를 24웰 플레이트의 웰에 피펫팅합니다. 실온에서 30-45분 동안 배양하여 세포-겔 매트릭스를 염색합니다.
    4. 배양 후 약 0.5mL의 신선한 D-PBS를 새로운 35mm 유리 바닥 배양 접시에 추가합니다. 샘플의 오염이나 건조를 방지하기 위해 접시를 덮으십시오.
    5. 팔꿈치 끝이 있는 겸자를 사용하여 4.1.3단계에서 염색된 세포-겔 매트릭스를 4.1.4단계의 35mm 배양 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 세포-겔 매트릭스를 손상시키거나 깎지 마십시오.
    6. 레이저 컨포칼 형광 현미경으로 라벨링된 세포를 볼 수 있습니다.
  2. 현미경 스캐닝 세트
    1. 35mm 접시를 s에 놓습니다.tage. 10x 대물렌즈를 사용하여 접안렌즈를 통해 스캔할 세포-겔 매트릭스의 영역을 선택합니다. 더 높은 배율의 대물렌즈는 확장된 수상돌기의 크기 때문에 권장되지 않습니다.
    2. 광학 필터를 선택합니다. Calcein은 표준 fluorescein bandpass filter를 사용하여 녹색으로 볼 수 있으며, EthD-1은 propidium iodide 또는 Texas Red 염료 필터로 빨간색으로 볼 수 있습니다. 스캔을 위해 "라인 모드"를 선택하고 "핀홀"을 2μm로 설정합니다.
    3. 8비트 데이터 심도의 데이터 심도와 1,024픽셀 x 1,024픽셀의 이미지 해상도를 선택합니다.
    4. 최적의 레이저 및 검출기 설정으로 순차 라인 스캐닝을 사용한 이미지(잠재적인 광표백을 방지하기 위해 최소한의 레이저 에너지 유지).
      알림: 최적의 검출기 설정은 최종 형광 신호에 따라 다릅니다.
  3. 이미지의 "z-stack" 수집
    1. 녹색 채널 신호에 따라, 연속적으로 스캔하면서 샘플을 통해 초점을 맞춰 스캔할 세포-겔 매트릭스의 상단 및 하단 위치를 정의합니다.
    2. 샘플의 상단과 하단이 지정되면 원하는 스캔 프레임을 선택합니다. 스캔을 시작합니다. 샘플은 4.2단계에서 선택한 설정으로 위에서 아래로 스캔되어 이미지 갤러리를 생성합니다.
  4. 세포 생존율 식별.
    1. 4.3단계에서 슬라이스 하나를 선택합니다. 녹색 및 빨간색 채널은 각각 살아있는 세포와 죽은 세포를 나타냅니다.
  5. 세포 수상돌기 식별.
    1. 단일 녹색 채널을 선택하여 이미지 수집 소프트웨어로 3D 재구성을 생성합니다. 깊이 정보는 일련의 무지개 의사 색상 이미지로 표시됩니다. 겔의 바닥에 있는 수상돌기는 빨간색으로 표시되는 반면, 상단에 있는 수상돌기는 파란색으로 표시됩니다.

5. 실체현미경을 이용한 외관 식별

  1. 배양 1일차, 7일차, 21일차 및 35일차에 배양 배지를 제거하고 D-PBS로 플레이트의 겔을 두 번 세척합니다. D-PBS의 4%(v/v) 파라포름알데히드 0.5mL를 웰에 추가하여 실온에서 10분 동안 플레이트에 세포 겔 매트릭스를 고정합니다.
  2. 웰에서 파라포름알데히드를 제거하고 플레이트에 D-PBS를 사용하여 세포 겔 매트릭스를 두 번 더 세척합니다. 이미징을 위해 각 웰에 0.5mL의 D-PBS를 남겨 둡니다.
  3. 플레이트를 s에 놓습니다.tage 0.5x 대물렌즈를 사용하여 접안렌즈를 통해 최적의 위치를 선택합니다. 명시야 아래에서 "자동 노출"을 사용하여 플레이트에 있는 세포-겔 매트릭스의 전체 시야를 개별적으로 이미지화합니다.

6. XRF 분석으로 광물 침전물 식별

  1. 배양 35일째에 액체 질소가 충분한지 확인합니다. XRF 시스템을 시작합니다. 샘플 룸을 열고 팔꿈치 끝이 있는 집게가 있는 겔을 플레이트에서 기기의 샘플 스테이지 중앙으로 옮깁니다. 샘플 룸을 닫고 기기가 식을 때까지 30분 동안 기다렸다가 사용합니다.
  2. 수집 설정을 위해 "노출 시간"을 35ms로, "스펙트럼 범위"를 0-40keV로, "전류"를 770μA로 설정합니다.
  3. 샘플 스테이지를 이동하여 분석할 3-5개의 스캐닝 부위를 선택합니다.
  4. 감지할 요소(Ca 및 P)를 선택합니다. 검색을 시작하고 결과를 내보냅니다.
    참고 : Ca 와 P 는 하이드록시아파타이트에서 가장 풍부한 원소입니다.

7. 기능적 유전자 발현 확인

  1. 배양 1일, 7일, 21일, 28일, 35일째에 배양 배지를 제거하고 플레이트에 얼음처럼 차가운 D-PBS로 세포-겔 매트릭스를 두 번 세척합니다.
  2. 팔꿈치 끝이 있는 겸자가 있는 겔을 플레이트에서 2.0mL 튜브로 옮깁니다(배양 시간에 따라 세포-겔 매트릭스는 35일째에 약 0.1mL로 점차 줄어들 것입니다). 하나의 튜브에 하나의 젤을 넣었는지 확인하십시오. 페놀-클로로포름 1mL와 멸균 스테인리스강 박동 비드 2개(용해 매트릭스로 4mm)를 각 튜브에 추가합니다. 튜브를 기계적 박동 균질화기의 사전 냉각된 샘플 슬롯에 대칭으로 놓습니다.
  3. 비트를 55Hz의 주파수와 1초의 주파수로 설정하고 amp총 10번의 사이클로 10초의 일시 중지로 기계적 비트의 각 1분에서 cm의 진폭을 설정합니다. 구슬 치기를 시작합니다.
  4. 페놀-클로로포름-이소아밀라코홀 방법을 사용하여 세포-겔 매트릭스에서 총 RNA를 추출합니다. 무작위 헥사머 프라이머를 사용하여 총 RNA 2μg을 cDNA로 역전사합니다.
  5. Real-Time PCR을 위한 β-actin, Pdpn, Dmp1, Sost 및 Fgf23을 표적으로 하는 프라이머를 설계합니다(표 2). β-Actin은 정상화에 사용되는 하우스키핑 유전자입니다. Pdpn10 및 Dmp1 11 유전자는 주로 pre-osteocyte와 mineralized osteocyte에서 발현되는 반면, Sost12 및 Fgf23 13은 주로 성숙한 osteocyte에서 발현됩니다.
  6. 가열된 뚜껑을 105°C로 설정한 상태에서 튜브를 열순환기에 놓고 다음 PCR 사이클링 설정을 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다: 5초 동안 95°C, 35사이클 동안 60°C에서 35초 동안 초기 변성 단계, 5분 동안 95°C에서 초기 변성 단계, 30초 동안 60°C에서 최종 확장 단계. ΔΔCt 방법으로 접힘 변화를 분석합니다.

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결과

살아있는/죽은 세포 염색 후, 컨포칼 레이저 현미경을 사용하여 세포를 시각화했습니다. 모든 세포는 칼세인 AM 양성(녹색)이었고 필드에는 EthD-1 양성 세포(빨간색)가 거의 없었으며, 이는 이 방법으로 만든 겔 시스템이 골세포 형성에 매우 적합함을 나타냅니다(그림 1A, 왼쪽). 세포의 공간적 분포를 더 잘 결정하기 위해, 겔의 다른 깊이에서 세포 수상돌기를 표시하기 위해 유사 색상 이미지를 선택했습니다. 빨간색은 겔 하단의 수상돌기를 나타내고 파란색은 상단의 수상돌기를 나타냅니다. 그 결과 IDG-SW3 세포는 이 세포-겔 매트릭스에서 잘 성장했으며, 세포 수상돌기는 7일째에 골형성 배지의 네트워크로 점차 확장되었습니다(그림 1A, 오른쪽 및 그림 1B).

실체현미경 하에서, 겔 매트릭...

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토론

이 프로토콜의 중요한 점은 자연 응고를 방지하기 위해 1단계와 2단계를 얼음 위에서 수행해야 한다는 것입니다. 이 방법에서 콜라겐 I의 최종 농도는 1.2mg/mL였습니다. 따라서 최적의 ddH2O 부피는 다양한 제조업체의 다양한 콜라겐과 일치하도록 계산되어야 합니다.

생체 내에서, 골세포 형성은 섬유주 뼈의 표면에서 내부로 조골세포의 극성 이동을 포함한다14. 이 프로토콜은 방향성 극성 없이 매트릭스에서 세포가 성장하지 않도록 합니다. 물론 cell-free 겔 매트릭스 표면에 IDG-SW3 세포를 파종하는 것은 선택 사항입니다. 그러나, 이 프로토콜에서 제공되는 콜라겐 농도는 조골세포 침윤을 위한 이론적으로 평평한 표면을 형성하기에 충분하지 않습니다. 이를 위해 콜라겐 I과 세포외 기질의 비율을 다르게 테스트해야 합니다.

오스테오이드의 뻣뻣함과 비교...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

IDG-SW3 세포주를 기증해 주신 Lynda F. Bonewald 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82070902, 82100935, 81700778)과 상하이 "과학 기술 혁신"항해 프로젝트 (21YF1442000)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산하이클론SH30042.01
15 mL 튜브Corning, NY, USA430791
7.5% (w/v) 소듐 바이카보네이Sigma-Aldrich, MO, USAS8761
아스코르빈산Sigma-Aldrich, MO, USAA4544
콜라겐 IThermo Fisher ScientificA10483-01 
소 태아 혈청Thermo Fisher Scientific10099141
균질화 BiHeng  생명공학, 상하이, 중국SKSI
레이저 컨포칼 형광 현미경 Carl  Zeiss, Oberkochen, GermanyLSM 800
Live/Dead Cell Imaging kitThermo Fisher ScientificR37601
Matrigel matrixCorning, NY, USA356234
MEM (10X), 글루타민 없음Thermo Fisher Scientific21430079
파라포름알데히드Sigma-Aldrich, MO, USA158127
인산염 완충 식염수하이클론SH30256. FS
스테레오 현미경Carl  Zeiss, Oberkochen, 독일Zeiss Axio ZOOM. V16
TrizolThermo Fisher Scientific15596026
형광EDAX, USAEAGLE III&BETA
;-GLYCEROPHOSPHATESigma-Aldrich, MO, USAG9422
트 선

참고문헌

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  15. Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
  16. Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).

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