방법 논문

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

DOI:

10.3791/64584

⸱

2022년 10월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다량의 재조합 아데노바이러스의 생성에 대한 방법이 기재되어 있으며, 이는 이식유전자의 발현 또는 내인성 유전자 산물의 하향조절을 허용하는 천연 설치류 요로상피를 형질도입하는 데 사용될 수 있습니다.

초록

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고저항 장벽을 형성하는 것 외에도 신장 골반, 요관, 방광 및 근위 요도를 둘러싸고 있는 요로상피는 환경에 대한 정보를 감지하고 기저 조직으로 전달하여 배뇨 기능과 행동을 촉진하는 것으로 가정됩니다. 요로상피장벽 또는 감각/변환기 기능의 파괴는 질병을 유발할 수 있습니다. 이러한 복잡한 사건을 연구하는 것은 요로상피에서 유전자와 단백질 발현을 변화시키는 간단한 전략이 없기 때문에 방해를 받습니다. 연구자가 다량의 고역가 아데노바이러스를 생성할 수 있도록 하는 방법이 여기에 설명되어 있으며, 이를 사용하여 설치류 요로상피를 고효율로 비교적 간단한 방식으로 형질도입할 수 있습니다. cDNA와 작은 간섭 RNA는 모두 아데노바이러스 형질도입을 사용하여 발현될 수 있으며, 요로상피 기능에 대한 이식유전자 발현의 영향은 12시간에서 며칠 후에 평가할 수 있습니다. 이러한 방법은 마우스 또는 쥐 동물 모델을 사용한 정상 및 비정상 요로상피 생물학 연구에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

서론

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요로상피(urothelium)는 신장 골반, 요관, 방광, 근위 요도를 둘러싸고 있는 특수 상피이다1. 그것은 3 개의 지층으로 구성되어 있습니다 : 고도로 분화되고 분극화 된 종종 이중 핵 우산 세포의 층으로, 정점 표면은 소변으로 목욕됩니다. 이들의 급성 손실에 반응하여 표재성 우산 세포를 발생시킬 수 있는 이핵-전이-증폭 세포의 집단을 갖는 중간 세포층; 및 기저 세포의 단일 층, 그 하위 집합은 만성 손상에 대한 반응으로 요로 상피 전체를 재생할 수 있는 줄기 세포로 기능합니다. 우산 세포는 주로 고내성 요로상피 장벽을 형성하는 역할을 하며, 그 구성 요소에는 물과 용질에 대한 투과성이 낮은 정점막(콜레스테롤과 세레브로사이드가 풍부함)과 고저항 정점 접합 복합체(밀착 접합부, 부착 접합부, 데스모솜 및 관련 악토미오신 고리로 구성됨)가 포함됩니다.1 . 우산 세포의 정점 표면과 접합 링은 모두 방광 충전 중에 확장되고 1,2,3,4,5를 배뇨한 후 빠르게 미리 채워진 상태로 돌아갑니다. 장벽 기능에서의 역할 외에도 요로피는 세포외 환경의 변화(예: 스트레칭)를 감지하고 매개체(ATP, 아데노신 및 아세틸콜린 포함)의 방출을 통해 이 정보를 전달하여 이 정보를 비뇨상피하 구심성 신경 과정을 포함한 기저 조직으로 전달할 수 있는 감각 및 변환기 기능을 가지고 있다는 가설이 있습니다 6,7,8 . 이 역할에 대한 최근의 증거는 Piezo1과 Piezo2 모두의 요로상피 발현이 결여된 마우스에서 발견되며, 이는 변경된 배뇨 기능을 초래합니다9. 또한, 우산 세포층에서 밀착 접합 기공 형성 단백질인 CLDN2를 과발현하는 쥐는 간질성 방광염 환자에서 볼 수 있는 것과 유사한 염증과 통증을 일으킨다10. 요로상피관/변환기/장벽 기능의 파괴가 여러 방광 장애에 기여할 수 있다는 가설이 있습니다 6,11.

정상 및 질병 상태에서 요로상피의 생물학에 대한 더 나은 이해는 연구자가 내인성 유전자 발현을 쉽게 하향 조절하거나 천연 조직에서 이식유전자의 발현을 허용할 수 있는 도구의 가용성에 달려 있습니다. 유전자 발현을 하향 조절하는 한 가지 접근법은 조건부 요로상피 녹아웃 마우스를 생성하는 것이지만, 이 접근법은 플록스 대립유전자가 있는 마우스의 가용성에 따라 달라지며 노동 집약적이며 완료하는 데 수개월에서 수년이 걸릴 수 있습니다12. 당연히 연구자들은 요로상피를 형질주입하거나 형질도입하는 기술을 개발했으며, 이는 더 짧은 시간 규모로 결과를 가져올 수 있습니다. 형질감염을 위해 공개된 방법은 양이온성 지질13, 안티센스 포스포로티오화 올리고데옥시뉴클레오티드 14, 또는 HIV TAT 단백질 침투 11-mer 펩티드15에 테더링된 안티센스 핵산의 사용을 포함한다. 그러나 이 프로토콜의 초점은 광범위한 세포에 대한 유전자 전달에 효율적인 잘 연구된 방법론인 아데노비랄 매개 형질도입의 사용에 있으며, 수많은 임상 시험에서 테스트되었으며, 가장 최근에는 COVID-19 캡시드 단백질을 암호화하는 cDNA를 COVID-19 백신의 한 변종 수혜자에게 전달하는 데 사용되었습니다16, 17. 아데노바이러스 수명 주기, 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스의 임상적 적용에 대한 보다 자세한 설명은 독자가 참조17을 참조하도록 지시합니다.

요로상피를 형질도입하기 위한 아데노바이러스 사용의 중요한 이정표는 Ramesh et al. N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)를 포함한 세제로 짧은 전처리가 β-갈락토시다아제를 암호화하는 아데노바이러스에 의한 요로상피의 형질도입을 극적으로 향상시켰습니다18. 이 원리 증명 연구를 지침으로 사용하여 요로상피의 아데노비랄 매개 형질도입은 이제 Rab-family GTPases, 구아닌-뉴클레오티드 교환 인자, 미오신 운동 단편, 기공 형성 밀착 접합 관련 클라우딘 및 ADAM17 10,19,20,21,22 . 동일한 접근법이 작은 간섭 RNA(siRNA)를 발현하도록 조정되었으며, 그 효과는 이식유전자22의 siRNA 내성 변이체를 공동 발현함으로써 구출되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 이러한 기술에 대한 요구 사항인 고농축 아데노바이러스를 대량으로 생성하는 일반적인 방법과 요로상피에서 이식유전자를 고효율로 발현하기 위한 Ramesh et al.18의 방법의 적응이 포함됩니다.

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프로토콜

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BSL2 인증이 필요한 아데노바이러스 생성과 관련된 실험은 피츠버그 대학교 환경 보건 및 안전 사무소와 기관 생물 안전 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 아데노바이러스 형질도입(ABSL2 인증 필요)을 포함한 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 동물 복지법의 관련 지침/규정에 따라 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다. 재조합 바이러스와 관련된 모든 절차에는 장갑, 보안경 및 적절한 의복을 착용합니다. 액체 또는 고체 폐기물은 아래에 설명된 대로 처리해야 합니다. 형질도입 후 동물의 침구와 그로 인한 동물 사체는 생물학적 위험 물질로 취급하고 제도적 정책에 따라 폐기해야 합니다.

1. 고역가 아데노바이러스 스톡의 제조

참고: 설치류 방광의 효과적인 형질도입은 정제 및 농축된 바이러스 스톡(일반적으로 μL당 1 x 107 내지 1 x 108 감염성 바이러스 입자(IVP))의 사용에 달려 있습니다. 프로토콜의 이 부분은 기존 바이러스 제제에서 고역가 아데노바이러스 스톡을 생성하는 데 중점을 둡니다. 모든 단계는 멸균 시약과 도구를 사용하여 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. 오늘날 사용되는 아데노바이러스 균주는 복제 결함이 있지만 대부분의 기관에서는 아데노바이러스 및 재조합 DNA를 사용하기 위해 승인이 필요합니다. 여기에는 종종 세포 배양실을 아데노바이러스를 생산하고 증폭하기 위한 BSL2 승인 시설로 지정하는 것이 포함됩니다. 몇 가지 일반적인 고려 사항에는 바이러스 생산 및 정제의 모든 단계에서 마스크, 보안경, 장갑 및 적절한 의복 사용이 포함됩니다. 원심분리를 수행할 때 원심분리기 튜브에 꼭 맞는 캡이 없는 경우 안전 캡을 사용하는 것이 좋습니다. 오염 가능성이 있는 원심분리기 안전 캡, 병 및 로터를 포함한 모든 비일회용 재료는 항바이러스 용액( 재료 표 참조)으로 처리한 다음 물 또는 70% 에탄올로 헹굽니다. 액체 폐기물은 표백제를 최종 농도 10%(v/v)로 첨가하여 처리됩니다. 이러한 액체 폐기물의 처리는 제도적 정책에 달려 있습니다. 고형 폐기물은 일반적으로 생물학적 유해 폐기물로 처리됩니다.

  1. HEK293T 세포 배양
    1. HEK293T 세포의 냉동 바이알을 37°C의 수조에서 해동하고 5mL 피펫을 사용하여 세포를 직경 15cm 세포 배양 접시에 옮깁니다. 25mL 피펫을 사용하여 10%(v/v) 소 태아 혈청과 페니실린/스트렙토마이신 항생제(DMEM-FBS-PS)가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 20mL를 접시에 천천히 추가합니다. 세포가 80%-90% 합류점(~2 x 107 세포)에 도달할 때까지 5%(v/v)CO2로 가스가 공급된 37°C 세포 배양 배양기에서 세포를 배양합니다.
    2. 진공 공급원에 부착된 유리 피펫을 이용하여, 배지를 흡인하고, 20 mL의 멸균 PBS (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 및 8.9 mMNa2HPO4)를 25 mL 피펫을 사용하여 접시에 옮겨 세포를 헹구었다. 폐한 PBS를 흡인한 다음 5mL 피펫을 사용하여 3mL의 따뜻한(37°C) 프로테이나제 용액(재료 표 참조)을 접시에 옮기고 세포가 분리될 때까지(~3-4분) 세포 배양 배양기에서 접시를 배양합니다.
      알림: 효과적인 단백질 분해는 접시를 천천히 앞뒤로 기울여 접시의 모든 부분에서 움직이는 유체로 세포가 방출되는 것을 찾는 것으로 가장 잘 평가할 수 있습니다. HEK293T 세포는 연장된 프로테이나제 치료에 민감하며 프로테이나제 용액에 몇 분 이상 방치하면 죽습니다.
    3. 10mL 피펫을 사용하여 7mL의 DMEM-FBS-PS를 분리된 세포의 접시에 옮긴 다음 동일한 피펫을 사용하여 세포와 배지를 흡인합니다. 현탁 세포를 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음, 현탁액을 200 x g 의 저속 임상 원심분리기에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 진공 소스에 부착된 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다. 25mL 피펫을 사용하여 15mL의 DMEM-FBS-PS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
    4. 19mL의 DMEM-FBS-PS가 들어 있는 15cm 접시 각각에 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
    5. 조직 배양 인큐베이터에서 세포가 85%-90% 합류(~3-4일)에 도달할 때까지 성장시킵니다.
  2. 희석 된 바이러스 용액을 준비하십시오
    1. FBS 또는 항생제가 없는 45mL의 DMEM으로 채워진 50mL 원뿔형 튜브에 기존 바이러스 스톡(5-10IVP/세포)의 ~1.5 x 10 9에서 3 x 109 IVP를 추가합니다.
      참고: 더 낮은 농도의 바이러스(1-5 IVP/세포)를 사용할 수 있습니다. 그러나 바이러스 생산이 계속되는 데는 더 오래 걸릴 것입니다.
  3. 배양 된 세포를 바이러스로 감염시킵니다.
    1. 진공 소스에 부착된 유리 피펫을 사용하여 1.1.5단계에서 거의 합류한 셀에서 배지를 흡인합니다.
    2. 25mL 피펫을 사용하여 3.0mL의 희석된 바이러스 용액(1.2.1단계에서 준비됨)을 각 세포 배양 접시에 옮깁니다. 그런 다음 10mL 피펫을 사용하여 7.0mL의 DMEM 배지(FBS 또는 항생제 부족)를 각 접시에 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 60분 동안 배양한 다음 20%(v/v) FBS 및 2x PS를 포함하는 DMEM 10mL를 각 접시에 추가합니다.
      참고: 15개 접시 중 하나를 대조군(바이러스가 추가되지 않음)으로 사용하면 다음 단계에서 감염된 세포에서 바이러스 유발 세포 반올림 및 사멸을 더 쉽게 식별할 수 있습니다.
    3. 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 2-4일 동안 배양하여 대부분이 반올림되기 시작하고 세포의 >60%가 분리될 때까지 배양합니다.
      참고: 더 낮은 역가의 바이러스를 사용하는 경우 세포 사멸이 발생하는 데 최대 일주일이 걸릴 수 있습니다. 세포 사멸이 일주일 이내에 발생하지 않으면 더 높은 역가의 바이러스를 사용하여 과정을 반복해야 할 것입니다.
  4. 세포 용해물에서 바이러스 복구
    1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 접시의 바닥을 긁어 부착 된 세포를 배지로 방출합니다.
    2. 25mL 피펫을 사용하여 각 세포 배양 접시에서 배지, 세포 및 세포 파편을 수집하고 50mL 원뿔형 세포 배양 튜브에 풀링합니다.
      참고: 자원을 절약하기 위해 두 접시의 배지를 하나의 50mL 튜브로 결합할 수 있습니다.
    3. 저속 테이블탑 원심분리기를 이용한 원심분리에 의해 세포 물질을 펠렛화: 3,000 x g에서 실온에서 5분. 진공 장치에 부착된 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다.
    4. 분쇄와 결합된 10mL 피펫을 사용하여 생성된 모든 펠릿화된 물질을 10mM EDTA(Tris-EDTA 용액)를 포함하는 멸균 여과된 100mM Tris-HCl pH 7.4의 총 7mL에 통합합니다. 풀링된 물질을 멸균된 15mL 세포 배양 원뿔형 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 이 시점에서 바이러스 전처리는 -80°C에서 무기한 동결될 수 있습니다.
  5. 세포 용해물 준비
    1. 3 번의 동결 해동 사이클을 수행하여 나머지 세포를 파괴하여 형성된 바이러스 입자를 추가로 유리시킵니다. 튜브를 액체 질소(~1.4.4초)에 담가 30단계에서 풀링된 재료를 동결합니다. 튜브를 37°C 인큐베이터에 넣어 샘플을 빠르게 해동합니다. 샘플을 15초 동안 소용돌이친 다음 급속 냉동 및 해동 절차를 추가로 2회 반복합니다.
      알림: 바이러스 용액은 수조에서 37°C로 빠르게 해동할 수 있지만 온도 변화로 인해 튜브가 깨져 바이러스 용액이 수조로 방출될 수 있으므로 주의해야 합니다. 이러한 일이 발생하지 않도록 바이러스 상청액이 들어 있는 튜브를 더 큰 튜브에 넣은 다음 수조에 넣습니다.
    2. 10mL 피펫을 사용하여 3회 동결 해동된 세포 물질을 초고속 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 4°C 초고속 원심분리기에서 30분 동안 튜브의 재료를 원심분리하여 ~18,500 x g로 합니다.
    3. 10mL 피펫으로 ~7mL의 바이러스가 풍부한 상층액을 회수하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음 단계까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 이 시점에서 정제되지 않은 바이러스 상청액의 부분 표본을 새로운 바이러스 제제(또는 백업)를 시작하기 위한 프리앰블로 유지하는 것을 고려하십시오. 이 분취량을 -80 °C에서 보관하십시오.
  6. 밀도 구배 원심분리를 사용하여 바이러스를 분리하고 정제합니다.
    1. 12mL PET 얇은 벽의 투명한 초원심분리기 튜브( 재료 표 참조) 또는 이와 동등한 곳에서 CsCl의 불연속 구배를 준비합니다. 18G 바늘이 장착된 3mL 주사기를 사용하여 2.5mL의 1.4g/mL CsCl 용액을 튜브 바닥에 조심스럽게 주입한 다음 새 주사기/바늘을 사용하여 2.5mL의 1.25g/mL CsCl 용액을 겹칩니다.
      알림: 기존 레이어 위에 직접 용액을 떨어뜨리면 심각하고 원치 않는 혼합이 발생합니다. 대신 바늘의 비스듬한 부분을 튜브 가장자리에 대고 주사기 플런저를 아주 천천히 눌러 용액이 튜브를 채울 때 바늘의 위치를 높입니다.
    2. 7mL 주사기를 사용하여 유사한 방식으로 구배 위에 ~10mL의 바이러스 상청액을 로드합니다. 바이러스 상청액과 튜브 상단 사이에 2-3mm 이상의 공간이 있는 경우 2-3mm의 공간만 남을 때까지 추가 Tris-EDTA 용액을 추가하여 튜브를 채웁니다.
    3. CsCl 층을 포함하지만 바이러스 상청액을 Tris-EDTA 용액으로 대체하여 유사하게 준비된 균형 튜브를 만듭니다.
      알림: 두 튜브는 초원심분리기에서 잠재적으로 위험한 불균형 부하 상황을 방지하기 위해 동일한 무게(및 유사한 밀도)를 가져야 합니다.
  7. rate-zonal 초원심분리를 사용하여 바이러스를 분리합니다.
    1. 1.6.2-1.6.3단계에서 형성된 그래디언트를 SW41 로터 또는 이와 동등한 것의 버킷에 로드합니다. 버킷 캡을 조이고 로터를 초원심분리기(4°C로 예냉)에 넣고 ~150,000 x g에서 1시간 동안 원심분리합니다.
    2. 원심분리하는 동안 아래 단계 1.9.1에 설명된 컬럼을 평형화합니다.
  8. 분리된 바이러스 입자 회수
    1. 원심분리 단계가 끝나면 로터에서 버킷을 조심스럽게 분리하고 세포 배양 후드에서 버킷 캡을 제거한 다음 튜브를 제거하고 랙에 놓습니다.
    2. 1.25g/mL와 1.4g/mL CsCl 용액 사이의 계면에 떠 있는 바이러스 입자가 풍부한 줄무늬 물질을 수집합니다. 세포 배양 접시의 아래쪽 절반에 그래디언트가 들어 있는 튜브를 잡고(엎질러진 물질을 걸러낼 수 있음) 3mL 주사기에 부착된 1인치 18G 바늘을 사용하여 줄무늬 바이러스 바로 아래에 있는 튜브에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 일반적으로 ~1mL로 회수되는 바이러스를 천천히 흡인합니다.
    3. 튜브에서 바늘을 제거하면 그래디언트에 남아 있는 물질이 튜브에서 세포 배양 접시의 아래쪽 절반으로 흘러 들어갑니다(모든 액체는 유해 폐기물로 처리해야 함).
    4. 주사기의 바이러스 용액을 얼음 위의 멸균 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
      알림: 이 단계에서 바이러스를 복구할 때 바늘이 바이러스가 풍부한 밴드 몇 mm 아래에 바늘이 열리도록 바늘의 내강이 위쪽을 향하도록 바늘을 배치합니다. 때때로 줄무늬 바이러스보다 2-3mm 위에서 관찰되는 부적절하게 조립된 바이러스의 얇은 띠에 의한 오염을 피하십시오( 그림 1A의 가는 검은색 화살표 참조).
  9. 겔 여과에 의해 샘플에서 CsCl을 제거합니다.
    1. PD-10 컬럼(Sephadex G-25M으로 사전 포장)을 지지대에 고정하고 10%(v/v) 글리세롤을 함유한 0.2μm 멸균 여과 PBS 50mL로 평형을 맞춥니다.
      참고: 초기 평형 단계는 완료하는 데 2-3시간이 걸리며 제조업체가 컬럼을 안정화하는 데 사용하는 방부제가 완전히 세척되도록 하는 데 필요합니다.
    2. 세척 용액이 프릿(컬럼 배지 상단의 흰색 물질로 된 보호 디스크) 아래로 물러나도록 한 다음 1.8단계에서 수집한 정제된 바이러스 용액을 컬럼 상단으로 조심스럽게 옮깁니다. 바이러스가 풍부한 용액이 프릿 아래로 물러나도록 한 다음 PBS-글리세롤로 컬럼을 채우기 시작합니다.
      참고: 프릿의 한 가지 기능은 컬럼이 마르는 것을 방지하는 것입니다. 그 결과, 더 많은 용리액이 컬럼에 추가되기 전에 짧은 지연이 허용됩니다.
    3. 12개의 멸균 미세원심분리기 튜브에 분획당 0.5mL씩 용리액을 수집합니다.
  10. 바이러스 수율을 결정하십시오.
    1. 분광광도법을 사용하여 피크 바이러스 분획을 측정합니다. PBS에서 각 분획의 1:100 희석액을 준비하고, 1:100 희석 완충액을 블랭크로 사용하여 분광광도계에서OD260 을 측정한다. 바이러스 입자는 분획 6 부근에서 시작하여 공극 부피에서 용리되어야 합니다. 가장 높은 OD260 판독값을 포함하는 분획을 풀링합니다.
    2. 풀링된 바이러스 분획을 1:100으로 희석하고 OD260을 다시 측정합니다. 다음 공식을 사용하여 바이러스 입자의 최종 농도와 풀링된 분획의 IVP 수를 계산합니다: mL당 바이러스 입자 = OD260 × 100(희석 계수를 보정함) ×10 12. 일반적으로 바이러스 입자의 1%가 IVP인 것으로 추정됩니다: IVP/mL = OD 260 × 100 × 10 10 또는 IVP/μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. 풀링된 바이러스 분획(5 x 107 내지 1 x 108 IVP 함유)을 멸균 미세원심분리기 튜브 또는 극저온 난실에 분취합니다. 샘플을 -80°C에서 보관합니다.

2. 설치류 방광의 형질 도입

참고: 이 기술을 처음 접하는 경우 한 번에 형질도입되는 동물의 수를 2-4개로 제한하는 것이 좋습니다. 이것은 특히 2.2 단계에서 세제를 처리한 다음 2.3 단계에서 바이러스 배양 동안 각 동물의 시작 시간을 엇갈리게 하여 달성할 수 있습니다. 숙련된 조사관은 한 번에 최대 6마리의 동물을 형질도입할 수 있습니다.

  1. 방광 카테터 삽입
    1. 노즈 콘이 부착된 기화기를 사용하여 암컷 C57Bl/6J 마우스(일반적으로 8-10주령, ~20-25g) 또는 암컷 Sprague Dawley 쥐(일반적으로 2-3개월령, ~250g)를 마취합니다. 기화기를 보정하여 마우스의 경우 3.0%(v/v) 이소플루란, 97%(v/v) O 2 또는 쥐의 경우 4.0%(v/v) 이소플루란, 96%(v/v) O2 를 생성합니다. 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하여 동물이 마취되었는지 확인합니다(일반적으로 1-2분 후).
    2. 동물을 가열 된 패드에 올려 놓아 동물의 체온을 유지하십시오. 형질도입 프로토콜 전반에 걸쳐 동물을 모니터링하여 동물이 마취되고 이 절차 동안 통증을 경험하지 않는지 확인합니다.
    3. 이소플루란을 생쥐의 경우 1.5%(v/v), 쥐의 경우 2.0%(v/v)로 줄이고 프로토콜 기간 동안 동물을 마취 상태로 유지합니다.
    4. 방광으로 공기가 유입되는 것을 방지하려면 IV 카테터의 플라스틱 카테터 부분( 재료 표 참조) 및 관련 허브를 이송 피펫을 사용하여 멸균 PBS로 채웁니다.
    5. 앙와위 자세로 외부 비도를 70 % 알코올로 닦고 멸균 카테터를 외부 비도, 요도, 방광에 삽입합니다.
      1. 이 작업을 수행하려면 미세한 집게를 사용하여 외부 비도를 형성하는 조직을 부드럽게 잡고 동물에서 멀리 수직으로 확장하십시오. 다른 손을 사용하여 카테터를 약 3-4mm 수직으로 요도 비도 (질 입구 바로 위의 살덩어리)에 조심스럽게 삽입하십시오. 그런 다음 요도가 구부러져 외부 비도에 삽입 된 카테터를 동물의 꼬리쪽으로 낮추면 치골 아래를 통과하는 요도 부분으로의 진입이 쉬워지고 궁극적으로 방광으로 쉽게 들어갈 수 있습니다
        . 알림: 특히 마우스의 경우 카테터가 너무 길 수 있으며 1.0-1.1cm 이상을 동물에 삽입해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 방광 점막이 손상됩니다. 이를 방지하려면 카테터를 끝 아래 ~1cm에 표시한 다음 이 표시 이상으로 카테터를 삽입하지 마십시오.
    6. 방광의 소변이 새어 나오도록하십시오. Credé의 조작을 수행하여 잔류 소변을 제거하십시오 : 마사지하고 하복부의 방광 범프를 부드럽게 누릅니다.
  2. 요로상피를 세제 용액으로 처리하여 형질도입을 수용하도록 합니다.
    1. PBS로 채워진 멸균된 1mL 주사기를 카테터 허브에 부착하여 마우스 또는 래트 방광을 세척합니다. 멸균 PBS 100μL를 마우스 방광에 주입합니다(또는 쥐 방광의 경우 450μL). 카테터 피팅에서 주사기를 분리하고 PBS 배수를 허용합니다. 필요한 경우 Crede의 조작을 수행하여 과도한 방광액을 제거하십시오.
    2. 멸균된 1mL 주사기를 사용하여 0.1%(w/v) N-도데실-β-D-말토사이드(DDM)(PBS에 용해되고 0.2μm 필터 멸균됨) 100μL를 마우스 방광에 주입합니다. 주사기를 제자리에 두고 DDM을 10분 동안 방광에 유지합니다. 쥐에서 DDM의 부피는 450 μL로 증가합니다.
    3. 주사기를 분리하고 배출되도록 하여 방광에서 DDM을 제거합니다. 필요한 경우 Crede의 기동을 수행하십시오.
  3. 방광에 바이러스를 도입하십시오.
    1. 멸균된 1mL 주사기를 카테터 허브에 부착하고 마우스의 경우 멸균 PBS 100μL, 쥐의 경우 450μL로 희석한 아데노바이러스(단계 1에서 제조)의 0.5 x 107 에서 1 x 108IVP 를 방광에 주입합니다. 바이러스 용액이 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 주사기를 카테터에 부착 된 상태로 두십시오.
    2. 30분 후 주사기를 분리하고 바이러스 용액이 방광을 일회용 패드로 배출하도록 합니다. 흡수성 물티슈로 잔류 바이러스 용액을 닦아내고 패드를 버리고 생물학적 유해 폐기물로 닦아냅니다.
      참고: 글리세롤은 세포 독성이 있습니다. 따라서 마우스에 주입된 바이러스 용액의 최대 부피는 5μL로 제한됩니다(PBS 100μL로 희석하면 최종 글리세롤 농도가 ~0.5%[v/v]가 됨). 또한, 주입된 IVP의 수를 증가시키고 바이러스 배양을 45분으로 연장함으로써 형질도입 효율을 향상시킬 수 있습니다.
    3. 선택적 단계: 방광은 위의 단계 2.2.1에 설명된 대로 PBS로 헹굴 수 있습니다. 그러나 이 작업은 필요하지 않습니다.
  4. 동물이 회복되도록하십시오.
    1. 이소플루란의 흐름을 중단하고 특히 동물이 집단 수용된 경우 새장으로 되돌리기 전에 동물이 회복되고 완전히 움직일 수 있도록 합니다.
      참고: 바이러스 형질도입 자체는 관찰 가능한 하부 요로 증상이나 통증을 유발하지 않기 때문에 일반적으로 수술 후 치료가 필요하지 않습니다. 그러나 암호화된 이식유전자가 독성이 있는 경우 기관에서 요구하는 대로 시술 후 진통제 또는 항생제가 필요할 수 있습니다.
  5. mRNA in situ hybridization, western blot 또는 immunofluorescence 9,10,23과 같은 방법을 사용하여 처리 후 12-72시간 후에 이식유전자 발현의 효과를 분석합니다(대표적인 결과 참조).

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결과

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바이러스 준비
밀도 구배 원심분리에 의한 바이러스 정제의 예가 도 1A에 제시되어 있다. 로드된 세포 물질과 1.25g/mL CsCl 층의 계면에서 발견되는 연한 분홍색 띠는 주로 파괴된 세포와 그 파편으로 구성됩니다( 그림 1A의 자홍색 화살표 참조). 그것은 프로토콜의 1.5 단계에서 이월되는 소량의 배양 배지에서 분홍빛이 도는 색을 띤다. 유백색 띠로 나타나는 관심 바이러스 입자는 1.25g/mL CsCl 및 1.40g/mL CsCl 용액의 계면에서 발견됩니다( 그림 1A의 노란색 화살표 참조). 농축된 바이러스 입자 위로 2-3mm 위에 떠 있는 물질 띠를 관찰할 수도 있습니다( 그림 1A의 가는 검은색 화살표 참조). 조립되지 않은 바이러스와 파편으로 구성되고 IVP가 거의...

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토론

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Ramesh et al. 방광암 치료에 아데노바이러스 형질도입을 사용하기 위한 전략 개발에 초점을 맞추었지만 18, 보다 최근의 보고서에서는 정상적인 요로상피 생물학/생리학 및 병태생리학을 연구하는 데 이러한 기술의 유용성을 입증했습니다 10,18,19,20,21 . 이 접근법의 중요한 특징은 다음과 같다 : (i) 설치류 방광벽 전체에서, 요로 상피 만이 형질 도입된다10,19,20,21,22

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 P30DK079307(MGD에게), NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에), NIH 보조금 R01DK129473(GA에), 미국 비뇨기과 협회 경력 개발 상 및 Winters Foundation 보조금(NM)을 통한 파일럿 프로젝트 상, 피츠버그 신장 연구 센터(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어, 그리고 S10OD028596(G.A.에게)에 의해, 이 원고에 제시된 이미지 중 일부를 캡처하는 데 사용되는 컨포칼 시스템의 구매 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 mL 피펫Corning Costar (Millipore Sigma)CLS4488멸균, 혈청학적 피펫, 개별 포장
12 mL 초원심분리 튜브ThermoFisher06-752PET thinwall 초원심분리기 튜브
15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브Falcon (Corning)352097멸균
18 G 바늘BD 30519618 G x 1.5 in needle
20 mL 피펫Corning Costar (Millipore Sigma)CLS4489steril, 혈청학 피펫, 개별 포장
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브Falcon (Corning)352098sterile
5 mL 피펫Corning Costar (Millipore Sigma)CLS4487sterile, 혈청학 피펫, 개별 포장
CavicideHenry Schein6400012항바이러스 용액
세포 배양 접시 - 15cmFalcon (Corning)353025멸균, 조직 배양 처리  (150mm × 25mm 접시)
셀 스크레이퍼Sarstedt893.1832핸들 길이 24 cm, 블레이드 길이 1.7 cm
CsClMillipore SigmaC-4306분자 생물학 등급 ≥ 98%
DMEM 배양 배지(고포도당)Gibco (ThermoFisher)119650924.5 g/L 포도당 + L-글루타민 + 페놀 레드
EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra 등급 ≥ 99%
태아 소 혈청 Hyclone (Cytiva)SH30070.03defined serum
Glass pipetteFisher Scientific13-678-20A5.75 in glass pipette, 오토클레이
브 글리세롤Millipore SigmaG-5516Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 세포ATCCCRL-3216HEK293T세포는 SV40 대형 T-항원 이소플루란을 발현하는 HEK293 세포의 변형체입니다
Covetrus29405
IV 카테터 - 마우스Smith Medical Jelco306324 G x 3/4 in Safety IV 카테터  방사선 투과성
IV 카테터 - 랫Smith Medical Jelco306022 G x 1 인치 안전 IV 카테터 방사선 불투과
KClMillipore SigmaP-9541분자 생물학 등급 ≥ 99%
KH2PO4Millipore SigmaP5655세포 배양 등급  ≥ 99%
Na2HPO4• 7 H2O밀리포어 시그마431478  &지; 99.99%
NaClMillipore SigmaS3014분자 생물학 등급 ≥ 99%
N-도데실-&베타;-D-말토사이드 밀리포어 시그마D4641  &지;
98%다양한 동물을 위한 노즈콘맞춤형 설계상업 옵션에는 Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 컬럼에서 나온 것이 포함됩니다 GE 헬스케어17-085-01사전 포장된 칼럼이 Sephadex G-25M
페니실린/스트렙토마이신 항생제 (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063100x 집중 용액
분광광도계Eppendorf BioPhotometer
스탠드 및 클램프Fisher Scientific14-679Q 및 05-769-8FQ수많은 공급업체에서 제공
멸균 필터 장치Fisher Scientific (Nalgene)09-740-65B0.2 µ m 급류 필터 장치 (150 mL)
멸균 필터 장치 0.2 µ m (주사기)Fisher Scientific SLGV004SLMillipore 시그마 Milex 0.22 &마이크로; 주사기에 부착되는 m 필터 유닛
초고속 원심분리기Eppendorf 5810R과 Eppendorf F34-6-38 고정 각도 로터 (12,000 rpm)
주사기 (1 mL)BD 3096281-mL 주사기 Luer-lok 팁 - 멸균
주사기 (3 mL)BD 3096563-mL 주사기 슬립 팁 - 멸균
탁상용 원심분리기 (저속)Eppendorf 5702스윙 버킷 로터
전송 피펫Fisher Scientific13-711-9AM폴리에틸렌 3.4 mL 전송 피펫
Tris-baseMillipore Sigma648310-M분자 생물학 등급 
TrypLE select 프로테아제 솔루션Gibco (ThermoFisher)12604013TrypLE 익스프레스 효소 (1x), 페놀 레드 없음
초원심분리기Beckman CoulterOptima L-80 XPwith Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer 일반 마취 서비스, Inc.Tec 3Isoflurane 기화기
와류 믹서VWR10153-838아날로그 와류 믹서
.성

참고문헌

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