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방법 논문

경미한 외상성 뇌 손상의 깨어 있는 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 시냅스 가소성의 변화 평가

3.6K 조회수

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DOI:

10.3791/64592

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2023년 1월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

이 논문에서

요약

여기에서는 해마의 시냅스 가소성에 대한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(r-mTBI)의 영향을 조사하기 위해 깨어 있는 폐쇄두부 손상 모델을 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 환자에서 r-mTBI의 중요한 특징을 복제하고 시험관 내 전기생리학과 함께 사용됩니다.

초록

경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)은 북미에서 만연한 건강 문제입니다. 임상 인구에 대한 번역 가능성을 높이기 위해 전임상 환경에서 폐쇄 헤드 mTBI의 생태학적으로 유효한 모델을 활용해야 한다는 압력이 증가하고 있습니다. 깨어 있는 폐쇄 머리 손상(ACHI) 모델은 수정된 제어된 피질 충격기를 사용하여 폐쇄 머리 손상을 전달하여 개두술이나 마취제 사용 없이 임상적으로 관련된 행동 결함을 유도합니다.

이 기술은 일반적으로 사망, 두개골 골절 또는 뇌출혈을 유발하지 않으며 경미한 부상과 더 일치합니다. 실제로 ACHI 절차의 온화한 특성으로 인해 반복적인 mTBI(r-mTBI)를 조사하는 연구에 이상적입니다. r-mTBI가 행동 증상, 신경병리학적 변화 및 신경퇴행을 유발하는 누적 손상을 초래할 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다. r-mTBI는 스포츠를 하는 청소년에게 흔하며, 이러한 부상은 강력한 시냅스 재구성 및 수초화 기간 동안 발생하므로 젊은 인구는 특히 r-mTBI의 장기적인 영향에 취약합니다.

또한, r-mTBI는 객관적인 선별 조치가 거의없는 친밀한 파트너 폭력의 경우에 발생합니다. 이 실험에서, 시냅스 기능은 ACHI 모델을 사용하여 r-mTBI를 경험한 어린 쥐의 해마에서 평가되었습니다. 손상 후, 조직 슬라이서를 사용하여 해마 슬라이스를 만들어 r-mTBI 후 1일 또는 7일에 해마의 양방향 시냅스 가소성을 평가했습니다. 전반적으로, ACHI 모델은 연구자들에게 mTBI 및 r-mTBI에 따른 시냅스 가소성의 변화를 연구하기 위해 생태학적으로 유효한 모델을 제공합니다.

서론

외상성 뇌 손상(TBI)은 캐나다와 미국에서 매년 ~200만 건의 사례가 발생하는 심각한 건강 문제입니다 1,2. TBI는 모든 연령대와 성별에 영향을 미치며 유방암, AIDS, 파킨슨병, 다발성 경화증 등 다른 어떤 질병보다 발병률이 높다3. TBI의 유병률에도 불구하고 병태생리학은 잘 이해되지 않고 있으며 치료 옵션은 제한적입니다. 부분적으로, 이것은 모든 TBI의 85%가 경증(mTBI)으로 분류되고, mTBI는 이전에 장기적인 신경정신과적 결과 없이 제한적이고 일시적인 행동 변화만을 일으키는 것으로 생각되었기 때문입니다 4,5. mTBI 회복은 몇 주에서 몇 년이 걸릴 수 있으며5,6 더 심각한 신경학적 상태를 촉발할 수 있으며4, 반복적인 "준충격" 충격도 뇌에 영향을 미친다는 것이 인식되고 있다7. 하키/축구와 같은 스포츠의 선수들은 경기/연습 세션 7,8,9,10당 >10번의 머리 뇌진탕 충격을 받기 때문에 이것은 놀라운 일입니다.

청소년은 mTBI의 발병률이 가장 높으며 캐나다에서는 십대 10명 중 약 1명이 매년 스포츠 관련 뇌진탕으로 치료를 받습니다11,12. 실제로, 뇌진탕 하 두부 충격 또는 mTBI는 뇌에 확산 손상을 일으킬 수 있으며, 이는 또한 후속 부상 및 / 또는 더 심각한 신경 학적 상태 13,14,15,16,17에 대해 더 취약한 상태를 만들 수 있습니다. 캐나다에서는 로완의 법칙을 통해 이전의 손상이 추가 손상에 대한 뇌의 취약성을 증가시킬 수 있다는 것이 법적으로 인정되지만18, r-mTBI에 대한 기계론적 이해는 여전히 비참할 정도로 부적절합니다. 그러나 단일 및 r-mTBI는 학년도 동안 학습 능력에 영향을 미칠 수 있음이 분명합니다 19,20, 성별에 따른 결과 21,22,23,2 4, 그리고 나중에 인지 능력을 손상시킬 수 있습니다16,25,26. 실제로, 코호트 분석은 생애 초기의 r-mTBI를 나중에 치매와 강하게 연관시킵니다27,28. r-mTBI는 또한 잠재적으로 만성 외상성 뇌병증 (CTE)과 관련이 있으며, 이는 과인산화된 타우 단백질의 축적 및 진행성 피질 위축을 특징으로 하고 상당한 염증에 의해 침전된다 27,29,30,31. r-mTBI와 CTE 사이의 연관성은 현재 논란의 여지가 있지만32개, 이 모델을 통해 전임상 환경에서 더 자세히 탐색할 수 있습니다.

mTBI는 닫힌 두개골 내에서 발생하고 현대 영상 기술로도 감지하기 어렵기 때문에 종종 "보이지 않는 손상"으로 설명됩니다33,34. mTBI의 정확한 실험 모델은 두 가지 원칙을 준수해야합니다. 첫째, 임상 집단에서 일반적으로 관찰되는 생체역학적 힘을 요약해야 한다35. 둘째, 모델은 이질적인 행동 결과를 유도해야 하며, 이는 임상 집단에서도 매우 널리 퍼져 있습니다(36,37,38). 현재, 대부분의 전임상 모델은 개두술, 정위 머리 보호, 마취 및 조절된 피질 충격(CCI)을 포함하여 더 심각한 경향이 있으며, 이는 일반적으로 임상적으로 관찰되는 것보다 심각한 구조적 손상과 더 광범위한 행동 결함을 유발한다33. 두개골 절개술과 관련된 뇌진탕의 많은 전임상 모델에 대한 또 다른 우려는 이 절차 자체가 뇌에 염증을 일으키고 이것이 후속 손상으로 인한 mTBI 증상 및 신경병리를 악화시킬 수 있다는 것입니다39,40. 마취는 또한 염증감소 41,42,43, 소교 세포 기능 조절 44, 글루타메이트 방출 45, NMDA 수용체를 통한 Ca2+ 진입 46, 두개 내압 및 뇌 대사 47를 포함하여 몇 가지 복잡한 혼란을 유발합니다. 마취는 혈액뇌장벽(BBB) 투과성, 타우 과인산화 및 코르티코스테로이드 수치를 증가시키는 동시에 인지 기능을 감소시켜 혼란을 더욱 유발합니다 48,49,50,51. 또한, 미만성 폐쇄성 손상은 임상적 mTBI의 대다수를 차지한다52. 또한 성별21, 53세, 부상 간 간격15, 중증도54, 부상 횟수23 등 행동 결과에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인을 더 잘 연구할 수 있다.

가속력/감속력(수직 또는 수평)의 방향도 행동 및 분자 결과에 대한 중요한 고려 사항입니다. Mychasiuk와 동료들의 연구는 확산 폐쇄 머리 mTBI의 두 가지 모델, 즉 체중 낙하 (수직 힘)와 측면 충격 (수평 힘)을 비교했습니다 55. 행동 및 분자 분석 모두 mTBI 후 이질적인 모델 및 성별 의존적 결과를 나타냈다. 따라서, 선형 및 회전력을 통합하면서 수술 절차를 피하는 데 도움이 되는 동물 모델은 이러한 손상이 일반적으로 발생하는 생리학적 조건을 더 잘 나타냅니다33,56. ACHI 모델은 이러한 요구에 부응하여 만들어졌으며, 성별 차이를 편향시키는 것으로 알려진 절차(즉, 마취)를 피하면서 쥐에서 mTBI의 신속하고 재현 가능한 유도를 가능하게 했습니다57.

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프로토콜

모든 동물 절차에 대한 승인은 CCAC(Canadian Council on Animal Care) 표준에 따라 빅토리아 대학교 동물 관리 위원회에서 제공했습니다. 모든 수컷 Long-Evans 쥐는 사내에서 사육되거나 구입되었습니다( 재료 표 참조).

1. 주거 및 사육 조건

  1. 동물들이 1주일 동안 주거 환경에 적응할 수 있도록 한 후 출생 후(PND) 21에 젖을 뗀다.
  2. 표준 케이지 하우징의 쥐를 22.5°C ± 2.5°C로 유지하고 음식과 물에 임의 로 접근할 수 있도록 12시간 명암 주기로 유지합니다.
  3. 성별이 일치하는 새끼 두세 마리와 함께 동물을 그룹화하고 수용하고 무작위로 가짜 또는 r-mTBI 조건에 할당합니다.
  4. 오전 7시 30분에서 오후 11시 30분 사이에 모든 절차를 수행합니다.

2. 깨어 있는 폐쇄두부 부상 절차 설정

  1. 2.75인치를 배치합니다. 임팩터 아래에 저밀도 폼 패드(100cm x 15cm x 7cm)가 있어 헤드를 회전식으로 움직일 수 있습니다.
    알림: 폼 패드의 스프링 상수는 ~2,500N/m이지만 3,100에서 5,600N/m 사이로 변할 수 있습니다58. 견고성의 수준(낮음, 중간, 높음)은 부상 결과를 예측하지 못하는 것으로 나타났다59. 폼 패드는 비소모성 재료입니다. 일반적으로 매년 또는 더러워지거나 손상된 경우 교체됩니다.
  2. 수정된 피질 충격 장치(그림 1A)를 켜고 속도를 6m/s로 설정합니다.
    참고: 이러한 사양은 mTBI의 특징과 유사한 청소년 및 청소년 노령 쥐에서 급성 신경학적 장애를 유발하도록 설계되었지만 이러한 매개변수는 나이든 동물이나 다른 종(예: 생쥐 또는 흰 족제비)에는 적합하지 않을 수 있습니다. 일반적인 ACHI 매개 변수에 대한 검토는60을 참조하십시오.

3. mTBI의 유도

  1. 쥐가 PND 24에 도달하면 절차가 수행될 시술실로 옮깁니다. 이 방이 정상적인 주거 환경과 분리되어 있는지 확인하십시오.
  2. 쥐를 구속 원뿔에 부드럽게 놓고 주둥이와 콧구멍이 원뿔의 작은 구멍에 가까워지도록 하여 적절한 환기를 허용합니다. 플라스틱 머리핀을 사용하여 꼬리 끝에서 원뿔을 닫은 상태로 유지하여 쥐가 구속 원뿔에 놓인 후 움직임을 방지합니다.
    1. 구속 점수를 사용하여 구속 콘 및 ACHI 절차에 대한 동물의 순응도 또는 내성을 기록합니다.
      참고: 구속 점수는 동물의 스트레스 평가로 사용할 수 있습니다. 따라서, 과도한 스트레스 반응으로 인해 발생하는 피험자 간의 변동성을 줄이기 위해 억제 점수를 사용하여 제외 기준을 개발할 수 있습니다.
      1. 원뿔에 들어가려는 동물의 의지, 움직임 및 발성에 따라 0에서 4까지의 점수를 부여합니다. 구속에 대한 저항이 없으면 0점을 주고, 1점은 동물이 1-2배 회전하고 발성이나 꿈틀거림이 거의 또는 전혀 없는 것에 해당합니다. 동물이 2-3 배로 변하고 약간의 발성이나 꿈틀 거리는 모습을 보이면 2 점을줍니다. 동물이 5-10x로 변하고 더 많은 발성과 꿈틀거림을 보이는 경우 구속 점수 3을 줍니다. 마지막으로, 동물이 잦은 발성과 꿈틀거림으로 10배 이상 변한 경우 4점을 줍니다.
        참고: 이 정보는 채점표 자체(보충 표 S1 및 보충 표 S2)에도 있습니다.
  3. 쥐가 제지되는 동안 헬멧(그림 1B)을 정중선 위에 수동으로 배치하고 표적 디스크를 왼쪽 두정엽 위에 놓습니다(그림 1C,D).
  4. 쥐를 폼 패드에 놓고 임팩터 를 확장 위치로 수동으로 설정합니다. 임팩터 팁이 헬멧의 타겟팅 디스크와 접촉하도록 수동으로 내립니다. 임팩터 를 수동으로 후퇴 위치로 설정하여 임팩터가 헬멧 위로 10mm 뒤로 물러나도록 합니다.
  5. 스테트탁시컬 암의 다이얼을 사용하여 임팩트 팁을 10mm 낮추어 헬멧의 타겟팅 디스크에 다시 닿도록 합니다. 임팩트 스위치를 뒤집어 동물의 머리가 10m/s에서 6mm 동안 빠르게 가속되도록 합니다.
  6. 장치가 활성화되면 즉시 구속 콘에서 동물을 제거하고 즉각적인 신경학적 평가 프로토콜(NAP)을 수행합니다.
    참고: 현재 실험의 경우 이 프로토콜을 2시간 간격으로 총 8회 반복했습니다.

4. 가짜 부상의 유도

  1. 섹션 3에서 위에서 설명한 모든 실험 절차를 따르되 쥐를 임팩트 피스톤 경로에 인접하게 배치하여 부상을 입지 않도록 합니다.

5. 신경학적 평가 프로토콜

참고: NAP는 의식 수준과 인지 및 감각 운동 기능을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

  1. 기준선에서 mTBI 또는 가짜 손상의 유도 직후,56,61에 기재된 바와 같이 NAP를 사용하여 래트를 평가한다. 테이블 위에 쥐의 집 케이지와 회복 케이지를 100cm 간격으로 놓습니다. 밸런스 빔을 양쪽 케이지 위에 고르게 중앙에 놓습니다. 또한 밸런스 빔 아래에 접힌 수건이나 추가 쿠션을 놓습니다.
  2. 필요한 경우 의식 수준을 평가하십시오. mTBI 후 동물이 반응이 없는 경우 스톱워치를 사용하여 동물이 호흡을 재개하거나 앙와위에서 엎드린 자세로 몸을 바로잡는 데 걸리는 시간을 기록하여 무호흡( 호흡 중단) 및 교정 반사 의 지연을 평가합니다.
    참고: ACHI 모델에서는 교정 반사 및 무호흡 상실이 드물지만 어린 동물에서 때때로 관찰될 수 있습니다.
  3. 다음 테스트 순서를 사용하여 쥐의 인지 및 감각 운동 기능을 평가합니다. 의식 평가 후 이러한 테스트를 연속적으로 신속하게 시행하십시오.
    참고: 이 네 가지 테스트의 합계는 관찰된 행동 결함이 없는 경우 12점 만점의 총점을 산출합니다. 적자는 이 점수를 떨어뜨립니다.
    1. 깜짝 놀랄 반응
      1. 빈 회복 케이지에 쥐를 넣고 케이지 위에서 큰 소리로 (50cm) 박수를 치십시오. 다음 점수 시스템을 사용하여 소음에 대한 동물의 반응을 기록하십시오.
        3 = 소리에 대한 빠른 놀람 반응(예: 귀 움직임/경련, 점프, 전신 정지).
        2 = 소리에 대한 느린 반응 또는 약간의 동결 반응.
        1 = 귀의 움직임만 관찰됨.
        0 = 소리에 반응하지 않음.
    2. 사지 확장
      1. 들보(길이 100cm x 너비 2cm x 두께 0.75cm)를 쥐의 집과 회복 케이지를 가로질러 수평으로 놓고 꼬리 밑으로 쥐를 들어 올려 들보 근처에 잡습니다. 쥐가 쉽게 잡을 수 있을 만큼 가까이 있는지 확인하십시오. 다음 점수 시스템을 사용하여 양쪽 팔다리를 빔까지 확장하는 쥐의 능력을 평가합니다.
        3 = 양쪽 앞다리를 완전히 확장하고 빔을 잡습니다.
        2 = 한쪽 팔다리만 확장됩니다.
        1 = 앞다리의 간헐적 확장 또는 후퇴.
        0 = 앞다리가 절뚝거리거나 확장되지 않음.
    3. 빔 워크
      1. 홈 케이지를 향한 50cm 표시의 수평 빔 중앙에 동물을 놓습니다. 빔이 쥐의 집 케이지와 회복 케이지 사이에 균등하게 배치되었는지 확인합니다(~80cm 간격으로 배치). 쥐가 들보를 가로질러 걸을 수 있도록 합니다. 다음 점수 시스템으로 쥐의 균형 잡기 및 보행 능력을 평가하십시오.
        3 = 10초 이내에 2피트 미만의 미끄러짐으로 빔을 가로질러 성공적으로 걸었습니다.
        2 = 빔을 성공적으로 걸었지만 2개 이상의 풋 슬립이 관찰됩니다.
        1 = 비기관차 운동, '수영' 운동.
        0 = 빔을 따라 걸을 수 없거나 10초 이내에 이동할 수 없습니다.
    4. 회전 빔
      1. 쥐가 균형을 이루도록 빔 중앙에 쥐를 재배치합니다. 수건이나 푹신한 표면 위로 빔을 80cm 들어 올리고 4초 동안 초당 1회전(총 4회 회전)의 속도로 빔을 수동으로 회전하기 시작합니다. 다음 점수 시스템을 사용하여 빔이 회전할 때 빔에 남아 있는 쥐의 능력을 평가합니다.
        3 = 쥐는 네 번의 회전 모두에 대해 빔에 남아 있습니다.
        2 = 쥐가 네 번째 회전에 해당합니다.
        1 = 쥐가 두 번째 또는 세 번째 회전에 해당합니다.
        0 = 쥐가 첫 번째 회전 중에 떨어집니다.
  4. 낮잠이 끝나면 mTBI와 가짜 쥐를 집 케이지로 돌려 보냅니다. r-mTBI 절차에 대해 필요에 따라 반복합니다. 케이지 측 모니터링 체크리스트(보충 파일 1)를 사용하여 부상 후 동물의 웰빙을 모니터링합니다. 케이지 측 모니터링 중에 이상 징후(N이 아닌 점수)가 있는 경우 머리 충격 후 통증 척도 및 고급 모니터링 체크리스트(보충 파일 2)를 사용하여 전체 통증 점수를 가져와야 합니다.

6. 슬라이스 준비

참고: 현재 연구에서 시냅스 가소성은 mTBI 후 1일 또는 7일에 r-mTBI 후 동물에서 평가되었습니다. 이 날, 동물들은 희생 전에 덮개가 있는 우리에 넣어 실험실로 개별적으로 옮겨졌습니다.

  1. 해마 조각을 만드는 데 필요한 모든 수술 도구(그림 2A)를 밤새 냉장(-20°C) 합니다: 표준 가위, 해부 가위, 집게, 롱거, 주걱 및 냉각 블록.
    알림: 조직 접착제와 배양 챔버는 냉장 보관해서는 안 됩니다.
  2. 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2 및 10 mM 포도당 (300 ± 10 mOsm; pH 7.2-7.4)을 포함하는 인공 뇌척수액 (aCSF)을 준비한다.
    참고: aCSF의 주요 용액은 프로토콜 기간 동안 카보겐(95% O 2/5% CO2)으로 지속적으로 버블링되어야 합니다.
  3. 동물을 안락사시키기 전에 (단계 6.8), 12.5 mL의 아가로스를 준비한다. 0.25 g의 아가로스를 12.5 mL의 인산염 완충 식염수 (1x PBS)에 용해시키고, 50 mL 원뿔형 튜브에서 10 초 단위로 전자레인지에 돌린다.
  4. 아가로스를 따뜻하게 유지(42°C)하고 가열판에서 흔들어 응고되지 않도록 합니다.
  5. 페트리 접시와 얼음처럼 차가운 aCSF(50°C)로 채워진 작은 비커(4mL)와 위에 젖은 여과지가 있는 뒤집힌 페트리 접시를 포함하여 얼음 위에 절단 스테이션을 설치합니다(그림 2A). 작은 비커에 aCSF를 카보겐으로 지속적으로 버블링합니다.
  6. 수조를 32°C로 데우십시오. 회수 챔버를 aCSF로 채우고 카보겐으로 지속적으로 버블링합니다(그림 2B).
  7. 동물을 실험실로 옮깁니다.
  8. 흡입제로 5 % 이소 플루 란을 사용하여 동물을 마취시킨 다음 (금단 반사가 없을 때까지) 작은 단두대를 사용하여 신속하게 목을 베십시오.
  9. 얼음처럼 차가운(4°C) aCSF로 채워진 페트리 접시에서 두개골에서 뇌를 해부하고 두개골을 aCSF에 잠긴 상태로 유지하여 조직을 빠르게 냉각시킵니다.
    참고: 이 절차는 일반적으로 5분 미만이 필요하지만 뇌가 냉장된 aCSF에 잠겨 있는 경우 뇌 제거 속도는 중요한 요소가 아닙니다.
  10. 뇌를 냉각 및 탄소화 aCSF의 작은 비커에 넣어 샘플을 추가로 세척하고 냉각시킵니다.
  11. 뇌를 거꾸로 된 페트리 접시로 옮기고 여과지 위에 놓습니다. 날카로운 메스를 사용하여 소뇌와 전두엽 피질을 제거하여 뇌를 "차단"합니다. 뇌의 정중선을 잘라내어 두 반구를 분리합니다.
    참고: 다음 프로토콜은 한 번에 한 반구에서 수행됩니다. 현재 준비되지 않은 반구는 얼음처럼 차가운(4°C) 탄수화물 aCSF의 비커에 잠겨 있어야 합니다.
  12. 횡단 해마 슬라이스를 만들려면 반구를 내측 표면에 놓습니다. 메스 칼날을 안쪽으로 ~30° 기울이고 뇌의 등쪽 표면에서 얇은 슬라이스를 제거하여 슬라이서가 사용하는 피스톤에 뇌를 장착할 수 있는 평평한 표면을 제공합니다. 뇌를 등쪽 표면으로 뒤집고 마른 여과지에 조직을 부드럽게 두드려 과도한 aCSF를 제거합니다. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 뇌의 등쪽 표면을 피스톤에 부착하고 복부 표면을 똑바로 세웁니다.
    알림: 접착제가 피스톤 가장자리 위로 흐르지 않도록 하면 접착제가 아가로스를 포함하는 데 사용되는 금속 튜브에 달라붙어 피스톤의 움직임을 방지할 수 있습니다.
  13. 피스톤의 바깥 쪽 튜브를 뇌 위로 확장하고 뇌가 완전히 덮일 때까지 액체 아가로스를 튜브에 붓습니다. 피스톤 튜브 위에 냉각 블록을 클램핑하여 아가로스를 빠르게 응고시킵니다(그림 2A).
  14. 피스톤을 슬라이서의 챔버에 놓고 나사로 챔버를 고정합니다. 블레이드를 고정하고 얼음처럼 차갑고 산소가 함유된 aCSF를 슬라이서 챔버에 추가합니다.
  15. 슬라이서(그림 2B)에서 절단 속도를 4로, 진동을 6으로 설정하고, 연속/단일 슬라이싱 스위치를 연속으로 전환합니다. 400 μm에서 뇌 절편을 시작하기 시작합니다.
  16. 슬라이서가 뇌를 절개할 때 큰 직경의 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 절편을 절개할 때 산소가 함유된 aCSF의 회수조로 옮깁니다(그림 2C).
    알림: 각 슬라이스를 절단할 때 회수 수조의 다른 웰에 순차적으로 배치할 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적으로 각 반구에 대한 해마를 포함하는 6-8 개의 슬라이스를 생성합니다. 래트 아틀라스(62 )는 래트 뇌에서 개별 슬라이스의 등쪽-복부 위치를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
  17. 슬라이스를 32°C에서 30분 동안 회복시킨 다음 실온(23°C)에서 추가로 30분 동안 회복되도록 둡니다.
  18. 이 단계를 반복하여 두 번째 반구에서 슬라이스를 만듭니다.

7. 현장 전기생리학

참고: 치아이랑(DG)에서 세포외 현장 기록을 얻으려면 다음 단계를 수행하십시오. 60분 회복 후, 개별 해마 절편은 세포외 현장 기록을 위한 준비가 됩니다.

  1. 시판되는 마이크로피펫 풀러를 사용하여 외경 1.5mm, 내경 1.1mm의 10cm 붕규산 유리 모세관에서 기록 전극(1-2MΩ)을 당깁니다.
    알림: 기록 전극의 저항은 ~1MΩ이어야 하고 팁의 크기는 ~1mm여야 합니다. 전극 파라미터의 일관성은 좋은 녹음을 위해 중요합니다.
  2. 녹음에 사용할 컴퓨터와 장비를 켭니다: ampliifier, 디지타이저, 자극기, 미세 조작기, 온도 조절기, 현미경 조명 및 진공 펌프.
  3. 비커에 aCSF를 채우고 중력 제어 관류 시스템에 연결합니다. 관류 시스템의 aCSF 밸브를 열어 관류 챔버를 통해 aCSF의 흐름을 시작합니다. 약 1-2 drips/s 또는 2 mL/min의 유속을 유지합니다. 전기생리학적 기록 기간 동안 지속적으로 aCSF를 탄산화합니다.
    참고: 현장 기록 중에 탄수화물 aCSF의 일정한 적하 속도를 유지하는 것이 필수적입니다. 또한 기준 전극이 aCSF에 완전히 잠겨 있어야 합니다.
  4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 해마 절편을 회수욕에서 관류 챔버로 옮기고, 이 챔버는 탄소화한 aCSF로 지속적으로 관류되고 30 ± 0.5°C로 유지됩니다. 치상회와 과립 세포층이 시야에서 보이도록 뇌 절편의 방향을 지정합니다. 구부러진 와이어 무게로 슬라이스를 안정화합니다. 데이터 수집을 위해 컴퓨터 소프트웨어를 시작합니다.
    알림: 이 단계에서 진공 펌프를 끄면 조직을 자유롭게 조작할 수 있습니다. 너무 많은 조작은 조직을 손상시킬 수 있으므로 신속하게 수행해야합니다. 또한 관류 챔버에 aCSF가 너무 오래 걸리면 넘칠 수 있습니다. 조직의 방향이 적절하고 안정화되면 진공 펌프를 켭니다.
  5. 정립 현미경을 사용하여 경사 광학 장치로 DG를 시각화합니다. 동심 양극성 자극 전극을 배치하여 분자층의 중간 1/3에 내측 천공 경로(MPP) 섬유를 활성화합니다. 그런 다음 MPP에 aCSF로 채워진 유리 마이크로피펫을 배치합니다(그림 3A, B). 조직을 만지면 섬유가 손상될 수 있으므로 전극을 더 멀리 떨어진 상태에서 시작하십시오(즉, CA3 근처의 자극 전극과 DG 속 바로 위의 기록 전극).
    알림: 최적으로 모든 기록에는 전극이 세포층에서 약 200μm 떨어진 곳에 배치되어야 합니다.
  6. 자극 전극과 기록 전극이 배치되면 증폭기, 디지타이저 및 기록 소프트웨어를 사용하여 유발된 필드 응답을 시각화합니다.
  7. 적절한 현장 흥분성 시냅스 후 전위(fEPSP)를 찾으려면 사용자가 반응을 찾는 데 능숙할 때 0.2Hz(5초마다)에서 0.12ms 전류 펄스로 조직을 자극하거나 덜 능숙한 사용자의 경우 0.067Hz(15초마다)에서 과도한 자극을 피하기 위해. fEPSP의 최소 진폭이 0.7mV이고 fEPSP보다 작은 투명 파이버 발리가 있는지 확인합니다.
    참고: 최대 필드 응답을 얻기 위해 두 전극을 세포층에서 등거리에 배치하고 작은 광섬유 발리를 생성할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져(즉, ~200μm) 배치하는 것이 중요합니다. 전극 위치를 약간만 조정하면 반응의 진폭을 향상시키는 데 도움이 될 수 있지만 조직 손상을 방지하기 위해 최소한으로 유지해야 합니다.
  8. 자극 강도를 높여 최대 fEPSP 진폭을 결정한 다음 fEPSP가 최대 진폭의 70%가 되도록 시뮬레이션 강도를 설정합니다.
    참고: 최대 진폭은 장기 우울증(LTD) 연구의 경우 70%, 장기 강화(LTP) 연구의 경우 50%로 설정됩니다. 최대 진폭은 fEPSP의 진폭이 더 이상 증가하지 않을 때까지 자극 강도를 조정하여 결정됩니다. 최대 진폭이 2mV인 fEPSP의 경우 반응 크기를 LTD 연구의 경우 1.4mV, LTP 연구의 경우 1.0mV로 조정하여 fEPSP가 (각각) 억제되거나 강화될 수 있는 공간을 허용합니다.
  9. 0.067Hz에서 전달되는 0.12ms 펄스로 20분 동안 안정적인 프리컨디셔닝 기준선을 설정합니다. 슬라이스가 안정적인 것으로 간주되려면 fEPSP의 초기 기울기에서 <10%의 변동성을 찾고 표시된 fEPSP 기울기를 통과하는 최적선의 기울기가 <0.5인지 확인합니다. EPSP가 20분 동안 안정적인 것으로 확인되면 기록의 다음 단계를 진행합니다.
    참고: 다양한 수용체 길항제를 aCSF에 추가하여 LTD 및 LTP를 차단하거나 향상시킬 수 있습니다. 필요한 경우 이 기준 기간 동안 슬라이스가 이러한 약리학적 제제에 노출되고 안정적인 기록에 대한 요구 사항이 충족되는지 확인합니다. 예를 들어63,64,65를 참조하십시오.
  10. 먼저, paired-pulse 자극을 사용하고 자극-반응 입력-출력 곡선을 구성하여 기본 시냅스 특성의 변화를 결정합니다. 쌍 펄스 테스트의 경우, 0.033Hz에서 50ms의 인터펄스 간격으로 일련의 쌍을 이루는 펄스를 적용합니다. 입력-출력 곡선의 경우, 0.033Hz에서 자극 강도가 증가하는 시리즈(10)를 0.033Hz에서 적용하여 fEPSP 응답 크기 변화를 플로팅합니다.
  11. 주로 CB1 수용체64,66의 활성화에 의존하는 LTD를 연구하려면 10Hz 프로토콜(10Hz에서 6,000펄스)을 사용합니다. 이 프로토콜은 관리하는 데 10분이 걸립니다.
  12. 후처리 기록의 경우 추가 60분 동안 단일 펄스 자극(0.067Hz 주파수에서 0.12ms)을 사용하여 다시 시작합니다.
  13. 후조절 녹음 후, 쌍을 이루는 펄스 자극을 다시 투여한 다음 입력-출력 곡선을 투여합니다. 이를 기준선 기록과 비교하여 시냅스전 방출 특성의 변화를 관찰하고 장기 기록을 위해 슬라이스의 상태를 평가하는 데 도움이 됩니다.
  14. 분석하는 동안 개별 슬라이스의 데이터를 시냅스 가소성 데이터 세트에 유지해야 하는지 여부를 결정할 때 보수적이고 제외 기준을 준수하십시오. 프리컨디셔닝 베이스라인(기울기 >0.5), 프리컨디셔닝 베이스라인의 불안정성(>10% 변화) 및 사후 컨디셔닝 기간의 불안정성(사후 컨디셔닝 50-60분 동안 기울기 >1.5)에 가장 적합한 선에서 큰 기울기를 표시하는 슬라이스는 제외합니다.

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결과

깨어 있는 폐쇄 머리 손상 모델은 어린 쥐에서 r-mTBI를 유도하는 실행 가능한 방법입니다. ACHI 모델로 r-mTBI에 노출된 쥐는 명백한 행동 결함을 나타내지 않았습니다. 이 실험의 피험자는 r-mTBI 절차 중 어느 시점에서도 우측 또는 무호흡에 대한 잠복기를 나타내지 않았으며, 이는 이것이 실제로 경미한 TBI 절차임을 나타냅니다. NAP에서 미묘한 행동 차이가 나타났습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 쥐는 0에서 3까지의 척도로 4개의 감각 운동 작업(놀람 반응, 사지 확장, 빔 보행 및 회전 빔)에 대해 점수를 매겼으며, 3은 작업에 장애가 없음을 나타냅니다. 따라서 NAP 점수가 낮을수록 동물이 더 손상되었습니다. 기준선에서 가짜 쥐와 r-mTBI 쥐 사이의 NAP 점수에는 차이가 없었습니다. 모든 ACHI 세션 후, r-mTBI 쥐는 가짜와 비교할 때 NAP 작업 내에서 상당한 장애를 보였습니다(그림 4). 그러나 여러 날(즉, 2일 또는 4일)에 걸쳐 전달...

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토론

대부분의 전임상 연구는 임상 모집단에서 볼 수 있는 생체역학적 힘을 요약하지 않는 mTBI 모델을 활용했습니다. 여기서, ACHI 모델이 어린 쥐에서 r-mTBI를 유도하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. r-mTBI의 이 폐쇄형 모델은 보다 침습적인 절차에 비해 상당한 이점이 있습니다. 첫째, ACI는 일반적으로 두개골 골절, 뇌출혈 또는 사망을 일으키지 않으며, 이 모든 것은 임상 집단에서 "경미한" TBI의 금기 사항이 될 것입니다61. 둘째, ACI는 두개골 절개술을 사용할 필요가 없으며, 이는 증상 및 신경 병리를 악화시킬 수있는 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 중요합니다67. 셋째, ACI는 마취를 필요로하지 않습니다. 이것은 또한 마취가 신경 보호 특성을 가질 수 있고 학습 및 기억 성능 48,49,50,51,68 외에도 시냅

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 프로토콜의 개발에 기여한 과거와 현재의 빅토리아 대학교 크리스티 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 캐나다 보건 연구소(CIHR: FRN 175042) 및 NSERC(RGPIN-06104-2019)의 자금으로 지원되었습니다. Figure 1 두개골 그래픽은 BioRender로 제작되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3D 프린팅 헬먼트 Christie 실험실에서 설계 및 시공(Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience의 사양 참조) 
아가로스 Fisher Scientific (BioReagents)BP160500
마취실홈 메이드N/A플렉시글라스 컨테이너
자동 히터 컨트롤러워너 전기TC-324B
Axon Digidata분자 장치1440A저소음 데이터 수집 시스템
밸런스 빔 건설 또는 구매 가능 (길이 100cm x 너비 2cm x 두께 0.75cm)
Calcium ChlorideBio Basic Canada Inc. CD0050aCSF
카메라Dage MTINC-70
카보겐 탱크PraxairMM OXCD5C-K이산화탄소 5%, 산소 95%
Clampex 소프트웨어분자 장치Clampex 10.5 버전
Compresstome 진동 마이크로톰정밀VF 310-0Z
동심 양극 전극FHC Inc.
덱스트로오스 (D-글루코스)Fisher Scientific (화학)D16-3aCSF
디지털 자극 절연 증폭기   악기 받기, Inc. 모델 4D
인산이나트륨피셔 과학(화학)S373-500PBS
해부 도구
깃털 양날 블레이드전자 현미경 과학72002-10
여과지Whatman 11001-055
화염/갈색 마이크로피펫 풀러셔터 기기P-1000
헤어 클로 클립은 모든 백화점에서 얻을 수
홈 및 복구 케이지일반 쥐 케이지는 동물 관리 시설에서
Hum Bug Noise Eliminator퀘스트 사이언티픽 726300
Isoflurane USPFresenius KabiCP0406V2
Isotemp 215 디지털 수조Fisher Scientific 15-462-15
Leica Impact One CCI 유닛Leica Biosystems팁은 7mm 고무 충격 팁을 담을 수 있도록 수정되었습니다
Long-Evans 쥐, 수컷Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
저밀도 폼 패드3" 폴리우레탄 폼 시트 
염화마그네슘Fisher Scientific (Chemical)M33-500aCSF
수컷 롱 에반스 쥐찰스 리버 연구소찰스 리버 연구소에서 주문한 동물 또는 빅토리아 대학교에서 자란 강아지
MultiClamp 700B 증폭기분자 장치모델 700B
pH 테스트 스트립VWR 화학 물질 BDHBDH83931.601
염화칼Fisher Scientific (화학)P217-500aCSF, PBS
인산칼시그마P9791-500GPBS
푸시 버튼 컨트롤러Siskiyou Corporation MC1000e4축 폐쇄 루프 컨트롤러 푸시 버튼
샘플 디스크ELITechGroupSS-033증기압 삼투압계와 함께 사용
작은 수건
중탄산나트륨Fisher Scientific (화학)S233-500aCSF
염화나트륨Fisher Scientific (화학)S271-3aCSF, PBS
나트륨 PhosphateFisher Scientific (화학)S369-500aCSF
소프트 플라스틱 구속 콘Braintree Scientific모델 DC-200
스톱워치를 위해 iPhone을 사용합니다
 NAP 및 ACHI
얇은 벽 붕규산 유리(필라멘트 포함)Sutter InstrumentBF150-110-10외경: 1.5mm; 내경 : 1.10 mm; 길이: 10cm
정립 현미경OlympusOlympus BX5OWI5x MPlan 0.10 NA 대물 렌즈
증기압 삼투압계Vapro모델 5600aCSF는 300-310 mOSM이어야 합니다
Vetbond 조직 접착제3M1469SB
Vibraplane 진동 절연 테이블Kinetic Systems9101-01-45
CBAPC75 있습니다 얻을 수 있습니다.. 륨 륨 많은 실험실 구성원들이 이 테이블이나 가장자리가 올라간 큰 카트.

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