실시간 보이드 스팟 어세이

Summary

이 기사에서는 기존의 공극 스팟 분석에 비디오 모니터링을 통합하여 마우스 배뇨 거동을 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보와 낮의 밝고 어두운 단계 동안 마우스 동작의 세부 정보를 제공합니다.

Abstract

정상적인 배뇨 행동은 신경계의 적절한 제어 하에 방광, 요도 및 요도 괄약근의 조정된 기능의 결과입니다. 마우스 모델에서 자발적인 배뇨 행동을 연구하기 위해 연구자들은 동물 케이지 바닥을 감싸는 여과지에 퇴적된 소변 반점의 수와 면적을 측정하는 방법인 공극 반점 분석(VSA)을 개발했습니다. 기술적으로 간단하고 저렴하지만 이 분석은 배뇨 사건의 시간적 분해능 부족과 겹치는 소변 반점을 정량화하는 데 어려움을 포함하여 종말점 분석으로 사용할 때 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 실시간 VSA(RT-VSA)라고 하는 비디오 모니터링 VSA를 개발했으며, 이를 통해 보이드 주파수를 결정하고, 보이드 볼륨 및 보이드 패턴을 평가하고, 낮의 어두운 단계와 밝은 단계 모두에서 6시간 동안 측정할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경행동적 측면을 탐구하는 다양한 마우스 기반 연구에 적용할 수 있습니다.

Introduction

소변 저장과 배뇨는 골반 및 하복부 신경을 통해 방광 충전 상태에 대한 정보를 수신하는 중추 회로(중추 신경계)에 의해 조정됩니다. 신장 골반에서 근위 요도까지 요로를 둘러싸고 있는 상피인 요로상피는 소변에 존재하는 대사 노폐물과 병원체에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 이것은 방광의 충전 상태를 감지하고 기저 조직과 구심성 신경에 전달하는 감각 웹의 필수 구성 요소입니다 ^1,2. 요로상피막의 파괴 또는 요로상피기계 전달 경로의 변화는 빈뇨, 절박뇨, 야뇨증, 요실금과 같은 하부 요로 증상과 함께 배뇨 기능 장애를 유발할 수 있다 3,4,5,6,7. 마찬가지로, 노화, 당뇨병, 하부 요로 감염, 간질성 방광염, 및 방광 또는 그 기능을 조절하는 관련 회로에 영향을 미치는 다른 질병 과정은 방광 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다 8,9,10,11,12,....

Protocol

Urothelial Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO , 유전자형: Piezo1 fl^/fl; 피에조2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) 및 대조군(Pz1/2-C, 유전자형: Piezo1 fl^/fl; 피에조2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-)는 Jax 실험실에서 얻은 부모 균주(Piezo1 fl^/fl 균주 #029213; Piezo2 fl^/fl 균주 # 027720; Upk2^CRE+/- 균주 # 029281). 암컷 (1.5-3 개월, 체중 17-20g)과 수컷 (2-4 개월, 체중 23-29g) 마우스를 실험에 사용했다. 시클로포스파미드 유발 방광염 실험을 위해 야생형 C57Bl/6J 암컷(생후 3개월, 체중 ~20g)을 사용했습니다(Jackson laboratories, 균주 #000664). 동물을 수용하고 실험은 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 하에 피츠버그 대학 동물 보호 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정....

Results

요로상피 Piezo1/2 녹아웃 마우스의 배뇨 행동

배뇨 주기의 저장 단계에서 요로상피는 방광에 축적된 소변에 의해 가해지는 긴장을 감지하고 이 기계적 자극을 장막 ATP 방출 ^1,3과 같은 세포 반응으로 변환한다는 가설이 있습니다. 우리는 이전에 기계적으로 활성화 된 PIEZO1 및 PIEZO2 채널이 마우스 요로 상피 ^3,36에서 발현된다는 것을 보여주었습니다. 요로상피 PIEZO 채널이 정상적인 배뇨 거동에 중요한지 확인하기 위해 요로상피 조건부 Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO) 마우스와 연령 및 성별 일치 대조군(Pz1/2-C; 그림 9

Discussion

비디오 모니터링의 통합은 기존 VSA에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 비용 효율적인 수정입니다. 일반적으로 종말점 분석으로 사용되는 기존 VSA에서는 겹치는 공극 지점을 구별하기가 어렵습니다. 마우스는 일반적으로 케이지 모서리에서 몇 시간 동안 분석이 연장될 때 같은 영역에서 여러 번 소변을 보는 경향이 있기 때문에 이것은 사소한 문제가 아닙니다. 따라서, RT-VSA의 첫 번째 이점은 조사자가 부분적으로 또는 전체적으로 서로의 위에 퇴적된 개별 스팟을 쉽게 식별할 수 있다는 것이다. 이는 도 12에 도시된 실험에 잘 예시되어 있다. 이 경우 비디오 녹화는 마우스가 동일한 모서리에서 세 번 배뇨되어 겹치는 공극 반점을 퇴적하는 것을 확인합니다. VSA의 일반적인 방식으로 실험이 끝날 때만 여과지를 분석하면 한 지점만 구별할 수 있습니다. 따라서 고전적인 엔드포인트 VSA는 보이드 동작의 큰 차이를 식별하는 데 유용할 수 있지만 더 미묘한 표현형을 구별하지 못할 수 있습니다. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00인치 X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 –   10 인치	80/20	1010	금액 : 20
1.00 "로 절단 X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 –   12인치로 절단	80/20	1010	금액: 6
1.00" X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 –   40인치로 절단	80/20	1010	금액: 4
1.00" X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 – 14.75 인치	80/20	1010	금액 : 12
1.00 "로 절단 X 1.00인치 T-Slotted Profile - 네 개의 개방형 T-슬롯 – 32인치로 절단	80/20	1010	금액: 5
1/4-20 더블 슬라이드인 이코노미 T-너트	80/20	3280	금액: 16
1/4-20 트리플 슬라이드인 이코노미 T-너트	80/20	3287	금액: 18
10 & 25 시리즈 2 홀 - 18mm 슬롯 내부 코너 브래킷 듀얼 서포트 80	/20	14061	금액: 6
10 시리즈 3홀 - 스트레이트 플랫 플레이트	80/20	4118	금액: 8
10 시리즈 5 홀 - "L" 플랫 플레이트	80/20	4081	수량: 8
10 시리즈 5 홀 - "T" 플랫 플레이트	80/20	4080	금액: 8
10 시리즈 5 홀 - 티 플랫 플레이트	80/20	4140	수량: 2
10 시리즈 표준 리프트오프 힌지 - 오른손 조립	80/20	2064	금액: 2
10에서 15 시리즈 2 홀 - Lite 전환 내부 코너 브라켓	80/20	4509	수량: 6
24"-long UV 튜브 라이트	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	수량: 2 20W 전구 – 24" 파장 : 365nm
아크릴 미러 시트	전문 플라스틱		금액 : 1 82.5 cm x 26.5 cm
아크릴 미러 시트	전문 플라스틱		금액 : 2 26.5 cm x 30.5 cm
아크릴 미러 시트	전문 플라스틱		금액 : 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR 폴리 카보네이트 (자외선 저항)	80/20	65-2641	금액 : 2 4.5mm 두께, 투명, 38.5 cm x 26.5 cm
AR 폴리 카보네이트 (자외선 저항)	80/20	65-2641	금액 : 4 4.5mm 두께, 투명, 38.5 cm x 21.5 cm
AR 폴리 카보네이트 (자외선 저항)	80/20	65-2641	금액 : 4 4.5mm 두께, 투명, 26.5 cm x 21.5 cm
AR 폴리 카보네이트 (UV 저항)	80/20	65-2641	금액 : 4 4.5mm 두께, 투명 37.5 cm x 23.9 cm
AR 폴리카보네이트(UV 저항)	80/20	65-2641	양: 4 4.5mm 두께, 투명, 24.4 cm x 23.9 cm
크로마토그래피 종이(얇은 종이)	Thermo Fisher Scientific	57144
코스모스 압지(두꺼운 종이)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad 소프트웨어	버전 9.4.0	그래프 및 통계 소프트웨어
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		투명 필름
퀵 타임 플레이어 10.5 소프트웨어	Apple		멀티미디어 플레이어
보안 스파이	Ben 소프트웨어		비디오 감시 소프트웨어 시스템
표준 엔드 패스너, 1/4-20	80/20	3381	수량: 80
UV 전송 아크릴	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	수량: 2 38.5 cm x 26.5 cm
물 젤: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
웹캠	로지텍	C930e	금액: 4