복잡한 유전 회로는 설계, 테스트 및 최적화에 시간이 많이 걸립니다. 이 과정을 촉진하기 위해 포유류 세포는 단일 웰에서 회로 구성 요소의 여러 화학량론을 테스트할 수 있는 방식으로 형질감염됩니다. 이 프로토콜은 실험 계획, transfection 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류의 유전 회로는 광범위한 질병 상태를 감지하고 치료할 수 있는 잠재력을 입증했지만 회로 구성 요소 수준의 최적화는 여전히 어렵고 노동 집약적입니다. 이 과정을 가속화하기 위해 우리 연구실은 전통적인 포유류 형질감염의 고처리량 확장인 폴리 형질감염을 개발했습니다. 폴리형질감염에서 형질주입된 집단의 각 세포는 본질적으로 서로 다른 실험을 수행하여 서로 다른 DNA 복제 수에서 회로의 거동을 테스트하고 사용자가 단일 포트 반응에서 많은 수의 화학량론을 분석할 수 있도록 합니다. 지금까지, 세포의 단일 웰에서 3성분 회로의 비율을 최적화하는 폴리-형질감염이 입증되었다; 원칙적으로 더 큰 회로를 개발하는 데 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 폴리형질주입 결과는 일시적인 회로를 위한 동시 형질감염에 대한 DNA의 최적 비율을 찾거나 안정적인 세포주 생성을 위한 회로 성분에 대한 발현 수준을 선택하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.
여기서는 3성분 회로를 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 실험 설계 원칙으로 시작하여 폴리 트랜스펙션이 전통적인 공동 트랜스펙션 방법을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 다음에, 세포의 폴리형질감염을 수행하고, 며칠 후에 유세포 분석을 수행한다. 마지막으로, 데이터는 특정 성분 비율을 가진 세포의 하위 집합에 해당하는 단일 세포 유세포 분석 데이터의 슬라이스를 검사하여 분석됩니다. 실험실에서 폴리-트랜스펙션은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등을 최적화하는 데 사용되었습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 단축합니다.
서론
포유류 합성 생물학 분야는 배양된 세포주에서 간단한 감지 및 반응 부분을 개발하는 것부터 진단 및 치료의 실제 문제를 해결하기 위한 복잡한 유전자 네트워크의 최적화에 이르기까지 빠르게 발전했습니다1. 이러한 정교한 회로는 microRNA 프로파일에서 사이토카인, 저분자 약물에 이르기까지 생물학적 입력을 감지하고 트랜지스터, 대역 통과 필터, 토글 스위치 및 발진기를 포함한 논리 처리 회로를 구현할 수 있습니다. 그들은 또한 암, 관절염, 당뇨병 등과 같은 질병의 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었습니다 1,2,3,4,5. 그러나 회로의 복잡성이 증가함에 따라 각 구성 요소의 레벨을 최적화하는 것이 점점 더 어려워지고 있습니다.
유전 회로의 특히 유용한 유형 중 하나는 세포 상태를 감지하고 반응하도록 프로그래밍할 수 있는 세포 분류기입니다. 특정 세포 상태에서 단백질 또는 RNA 산출물의 선택적 생산은 세포와 오....
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프로토콜
참고: 표 1 과 표 2 는 이 프로토콜에 대한 중요한 참조 역할을 합니다. 표 1 은 반응에 대한 시약 스케일링을 보여주고, 표 2 는 프로토콜에 기술된 폴리형질감염의 예(상반부) 및 가능한 후속 실험(하반부)에 대한 DNA 비율 산술을 나타낸다.
1. 형질주입을 위한 세포 준비
- 프로토콜을 시작하기 전에 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 배양이 60%-80% 융합되는지 확인합니다. 이렇게 2일 전에 100 mm x 15 mm 조직 배양 페트리 디쉬에6 x 10 세포를 시딩하고, 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다.
참고: 당사의 프로토콜은 HEK293 세포에 중점을 두고 있지만 다른 세포 유형으로 대체될 수 있습니다. - 형질주입을 위한 배지 및 세포를 하기에 기재된 바와 같이 준비한다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 비필수 아미노산(NEAA; 재료 표 참조)을 갖는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)의 용액을 최소 20 m....
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결과
그림 1에서 우리는 co-transfection과 poly-transfection을 비교합니다. 공동형질감염에서, 모든 플라스미드는 동일한 형질주입 혼합물로 전달되어, 임의의 단일 세포가 받는 각 플라스미드의 양 사이에 높은 상관관계를 초래한다(도 1A). 각 세포에 전달되는 총 플라스미드의 수는 크게 다르지만, 집단 전체에 걸쳐 개별 세포에 있는 두 리포터 단백질의 형광은 상관관계가 있으며, 이는 두 플라스미드가 상당히 일정한 비율로 동시 전달되고 있음을 나타냅니다. 형질주입된 세포는 거의 또는 다수의 복합체를 흡수할 수 있지만, 각각의 복합체는 각각의 플라스미드의 상관된 양을 갖기 때문에, 공동-형질감염은 단지 2개의 플라스미드 사이의 농도 공간의 작은 대각선 영역만을 탐색한다. 대조적으로, 폴리형질감염에서, 플라스미드는 다중 형질주입 복합체로 전달되고, 그 결과 상이한 형질주입 혼합물에서 플라스미드의 비상관관계 전달이.......
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토론
CAD(Computer-Aided Design), 브레드보드 및 3D 프린팅과 같은 신속한 프로토타이핑 방법은 기계, 전기 및 토목 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 주어진 과제에 대한 가능한 많은 솔루션을 신속하게 검색할 수 있는 능력은 해당 분야의 발전을 크게 가속화합니다. 우리는 폴리 트랜스펙션이 생물 공학과 유사한 기술로, 유전자 회로의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다고 믿습니다. 또한 다른 래피드 프로토타이핑 기술은 가능한 여러 솔루션을 순차적으로 직접 반복해야 하는 반면, 폴리 트랜스펙션은 많은 솔루션을 동시에 탐색할 수 있습니다. 폴리형질감염은 유전자 회로 성분 비율의 많은 조합이 단일 웰에서 시험될 수 있게 하고, 몇몇 공개된 유전자 회로를 최적화하기 위해 사용되어 왔다10,11,13. 실험 프로토콜은 표준 공동 형질감염의 간단한 확장으로, 많은.......
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공개 사항
RW는 Strand Therapeutics와 Replay Bio의 공동 설립자입니다. R.W.와 R.J.는 세포 유형 분류기와 관련된 임시 특허를 출원했습니다.
감사의 글
우리는 폴리 형질 주입 방법 및 세포 분류제에 대한 적용을 주도하거나 기여한 전 Weiss Lab 구성원 인 Jeremy Gam, Bre DiAndreth 및 Jin Huh에게 감사드립니다. 추가 분석법 개발/최적화에 기여한 다른 Weiss 연구소 구성원: Wenlong Xu, Lei Wang 및 Christian Cuba-Samaniego; Josh Leonard 교수와 Patrick Donahue 및 Hailey Edelstein을 포함한 그룹 구성원은 poly-transfection을 테스트하고 피드백을 제공했습니다. 그리고 이 원고를 초대하고 피드백을 제공한 Nika Shakiba 교수. 또한 국립 보건원 [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]에도 감사드립니다. 국립 과학 재단 [1745645]; 이 작업에 자금을 지원하기 위해 NCI 및 국립 보건원 [P30GM14051]의 암 센터 지원 (핵심) 보조금 [P50CCA14051, 부분적으로].
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재료
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| 소 태아 혈청 | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK 세포 | ATCC | CRL-1573 | 실험에 적합한 세포 유형을 사용하십시오. HEK 세포는 매우 효율적으로 transfection하는 경향이 있습니다. |
| HeLa 세포 | ATCC | CRL-12401 | 실험에 적합한 세포 유형을 사용하십시오. |
| Lipofectamine 3000 및 P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | 세포 유형에 맞는 시약을 사용하십시오. transfection 및 enhancer 시약 |
| LSRFortessa 유세포 분석기 | BD Biosciences | N/A | |
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| 회사Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | 감소 혈청 배지 |
| 인산염 완충 식염수 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
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| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
참고문헌
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al.
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