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방법 논문

변형된 자가 조절 혈청의 생산 및 쥐 각막 상피에서의 치유 가능성에 대한 생체 외 평가

3.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64911

⸱

2023년 3월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Education, Chang Gung Memorial Hospital Linkou, 2School of Medicine, Chang Gung University, 3Department of Chemical Engineering and Biotechnology, National Taipei University of Technology, 4Cell Therapy Center, Tri-Service General Hospital, 5Department of General Surgery, Bo-Ai Clinic, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital Linkou, 7Institute of Clinical Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 공정을 단순화하고 자가 컨디셔닝 세럼(ACS) 준비 비용을 낮추는 프로토콜에 대해 설명합니다. 특별한 주사기 또는 표면 코팅 유리 구슬이 필요하지 않습니다. 더욱이, 변형된 ACS(mACS)는 생체 외에서 쥐 눈의 각막 상처 치유에 있어서 종래의 자가 혈청에 비해 경쟁 우위를 갖는다.

초록

인간 혈액 유래 국소 요법은 최근 수십 년 동안 임상의에게 큰 도움이 되었습니다. 자가 혈청(AS)과 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)은 각막 상처 치유에 필수적인 상피친화성 성장 인자를 풍부하게 함유하고 있습니다. AS와 달리 PRP는 차등 원심분리 시스템을 기반으로 하여 더 많은 혈소판 유래 성장 인자를 생성합니다. 자가 컨디셔닝 세럼(ACS)은 AS 및 PRP의 준비를 보존할 뿐만 아니라 염증성 질환에서 중요한 면역 조절 특성에 중점을 둡니다.

표준화된 프로토콜의 부족과 높은 준비 비용은 ACS의 임상 적용에 대한 한계입니다. 이 비디오 실험은 변형된 자가 컨디셔닝 혈청(mACS) 점안액을 준비하기 위한 표준 작동 절차를 보여줍니다. 먼저, 글리세롤은 저산소 배양 동안 혈액 세포 안정제로서 헤파린 주사기에 첨가되었습니다. 혈액 세포를 활성화시키기 위해, 37°C에서 4시간 인큐베이션을 개시하였다. 이어서, 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 3,500 × g 에서 원심분리하였다. 상층액을 0.22 μm 필터를 통해 여과한 후, mACS 점안액을 완전히 제조하였다.

mACS의 치료 효과에 대한 잠정적인 시험은 생체 외 마우스 눈에서 각막 상처 치유에서 기존 AS에 비해 경쟁 우위를 가질 수 있음을 보여주었습니다. 본 연구에 사용된 AS는 발표된 연구와 본원의 임상 실습에 따라 작성되었습니다. 따라서 안구 표면 질환에 대한 mACS의 효능은 in vivo 동물 연구 및 임상 시험을 통해 향후 연구에서 평가될 수 있습니다.

서론

안구건조증에서 자가 혈청(AS)의 치료 효과는 1980년대 Fox et al.1에 의해 처음 보고되었습니다. 자연 눈물을 모방한 AS의 윤활 특성과 필수 상피친화성 생화학적 성분 모두 각막 상피 세포의 증식에 도움이 되는 것으로 믿어집니다. 지난 수십 년 동안 여러 연구가 이를 기반으로 수행되었습니다. 영양 성분은 표피 성장 인자 (EGF), 비타민 A, 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 및 다른 사이토카인을 포함한다. 흥미롭게도, 혈청은 TGF-β 및 비타민 A가 풍부하며, 이들은 표피 증식에 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다 2,3,4,5. 또한, 안구 표면 질환 환자를 치료할 때, 여러 연구에서 환자가 보고한 결과, 기타 객관적인 안구건조증수치 6,7 및 세포 밀도와 같은 현미경적 소견에서 AS 점안액의 몇 가지 이점을 보여주었다8. 메타 분석 연구에 따르면 AS 점안액 치료로 환자의 증후군을 개선하는 데 몇 가지 이점이 있을 수 있지만 장기적인 결과와 관찰은 여전히부족합니다 9,10.

AS와 달리 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 준비 중에 항응고제를 첨가하여 파생되며, 혈소판의 추가 차등 원심분리 및 화학적 활성화가 있습니다. AS와 비교하여 TGF-β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 EGF와 같은 수많은 화학 물질 및 성장 인자가 PRP에 존재합니다. 또한 안구 표면 질환에도 적용되어 증상 완화에 임상적 이점이 있다11.

상피 결함과 염증 사이의 교차 결합은 복잡합니다. 특히, 면역병태생리학은 안구 표면 질환의 또 다른 중요한 문제입니다. IL-1β 및 IFN-γ과 같은 전염증성 사이토카인은 염증성 캐스케이드에서 중추적인 매개체인 것으로 여겨진다12. 따라서 면역 메커니즘에 대한 이해를 바탕으로 새로운 치료 방법이 열립니다. 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 및 기타 항염증성 사이토카인의 생산을 포함하여 이러한 염증 과정을 멈추게 하는 전략은 또한 안구 표면 질환에서 중요한 역할을 할 수 있다13,14,15.

1998년부터 상용화된 자가 컨디셔닝 혈청(ACS)인 오르토카인은 골관절염(OA), 류마티스 관절염(RA) 및 척추 질환을 앓고 있는 정형외과 환자에게 임상적으로 사용되어 왔다13. AS 및 PRP와 비교하여 화학적으로 코팅된 유리 비드로 처리하고 단핵구를 활성화하기 위한 저산소 배양은 ACS16의 특정 특징입니다. 이론적으로 세포에 생존 스트레스를 가함으로써 더 많은 항염증 인자를 분비할 수 있으며, 그 결과 IL-1Ra를 포함한 필수 면역 조절 성분의 농도가 높아집니다. AS와 비교하여 OA에서 ACS의 개선된 치료 효과 또한 보고되었다17. 안구 표면 질환은 어떤 면에서 정형외과적 염증성 질환과 유사한 면역 배경을 공유합니다. 따라서 정형외과 분야에서 인간 혈액 유래 치료의 성공적인 결과를 바탕으로 ACS는 상피친화성 및 면역 조절 특성에 의해 임상 실습에서 기존 치료법에 비해 이점을 가질 수 있습니다. ACS는 정형외과 염증성 질환에 널리 사용되어 왔지만 안과에서의 임상 적용은 여전히 탐색이 필요하며, 이는 높은 비용, 문헌 지원 부족, 준비 과정의 표준화 부족으로 인해 방해를 받을 수 있어 다양한 성능을 제공합니다.

이 비디오 기사에서는 변형된 ACS(mACS) 또는 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장을 생성하여 상용화된 ACS에 필적하는 실용적인 가치를 지닌 점안액 용액을 생성하는 새롭고 비용 효율적이며 편리한 방법을 시연했습니다. 항응고제를 첨가하고 스트레스 배양을 통해 혈액 세포가 항염증성 사이토카인을 분비하도록 하는 핵심 아이디어는 유지되었지만 CrSO4 코팅 유리 구슬 및 상업용 키트를 기반으로 하는 방법과 같은 화학적 유도 방법과 달리 이 방법에서는 저산소 배양에 의해 임계 스트레스 상태가 물리적으로 유도됩니다. 또한, 글리세롤은 혈액 세포막의 안정성 증가, 적절한 삼투성 세포외액 압력의 유지(18), 세포에 과도한 스트레스를 주지 않는 저산소 상태에서 적절한 영양소 공급원을 포함하여 추가적인 이점을 제공하기 위해 첨가되었다.

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프로토콜

연구는 프로토콜 섹션의 시작 부분에 있는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 프로토콜과 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board의 검토 및 승인을 받았습니다. 모든 지원자는 이 연구의 성격에 대해 통보받았고 포함되기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 전체 실험 절차에 필요한 소모품은 그림 1 과 그림 2 및 재료 표에 나와 있습니다.

1. mACS 점안액 생산에 필요한 물질의 준비

  1. 250mL의 10% 글리세롤 용액을 준비하고 21G 나비 날개 주입 세트, 바늘이 없는 3mL 주사기, 헤파린 158 USP 단위가 들어 있는 6개의 10mL 진공 튜브를 준비합니다(그림 1).
  2. 21G 채혈 바늘을 3mL 주사기에 연결하고 준비된 주사기에 10% 글리세롤 용액 3mL를 빼냅니다.
    알림: 바늘을 삽입하기 전에 모든 재료를 멸균해야 합니다.
  3. 10% 글리세롤 용액을 각각 약 0.5mL의 10% 글리세롤 용액과 함께 진공 튜브에 순서대로 분배합니다(그림 3A).
    참고: 시험관의 음압 때문에 6개의 시험관에 글리세롤 용액 3mL를 고르게 분배하기 위해 바늘이 들어간 직후에 바늘이 나와야 합니다.
  4. 75 % 알코올 멸균 면봉으로 환자의 피부를 소독하십시오. 18G 채혈 바늘로 환자 상지의 표재성 정맥을 뚫습니다. 표재성 정맥에서 총 60-70mL의 정맥혈을 채취합니다.

2. mACS 점안액 준비

  1. 채취한 정맥혈 10mL를 6개의 진공 튜브 각각에 순차적으로 주입합니다(그림 3B).
    알림: 이 단계는 튜브를 채우기 위해 진공의 음압에 의존합니다. 혈액 세포 파괴 및 용혈을 피하려면 양압을 가하지 마십시오.
  2. 6개의 진공 튜브를 37°C의 일정한 온도로 4시간 동안 인큐베이터에 넣습니다(그림 3C).
    참고: 저산소 상태는 글리세롤을 받은 밀봉된 튜브에 남아 있는 음압에 의해 유지되고 안정화됩니다.
  3. 4시간 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 실온에서 10분 동안 3,500× g 에서 원심분리합니다.
  4. 이 시점에서 멸균된 점안액 병, 바늘이 있는 3mL 주사기, 0.22μm 필터, 18G 바늘 및 멸균 장갑 한 쌍을 포함하여 mACS 추출을 위한 재료를 준비합니다(그림 2).
    알림: 수술대는 무균 환경을 보장하기 위해 75% 알코올로 닦아야 합니다. 원심 분리 후 상청액은 이미 mACS의 반제품입니다.
  5. 튜브 랙에 6개의 튜브를 놓고 원심분리가 완료된 후 캡을 엽니다(그림 3D).
    알림: 이 단계에서는 무균 상태가 필요하지 않습니다.
  6. 멸균 장갑을 끼고 18G 바늘이 달린 3mL 주사기를 사용하여 mACS를 하나씩 빼냅니다.
    알림: 이 단계에서 하부 혈구층을 그리지 않도록 주의하십시오(그림 3E).
  7. 바늘을 당겨 0.22μm 필터에 연결하고 23G, 1.5인치 채혈 바늘을 원래 3mL 주사기로 아래 배출구에 연결합니다(그림 3F).
  8. 0.22μm 필터를 통해 바늘을 준비된 멸균 점안액 병에 부드럽게 밀어 넣습니다(그림 3G).
  9. 모든 mACS가 여과되어 점안액병에 보관될 때까지 위의 단계를 반복합니다(그림 3H).
  10. 즉시 사용할 수 있도록 mACS 점안액을 4°C에서 보관하십시오. 장기 보존을 위해 -20 °C에서 보관하십시오.
    알림: 2°C에서 4주 이상 보관하거나 -3°C에서 20개월 이상 보관하지 마십시오 9,19.

3. 쥐 각막 상피의 생체 외 상처 치유 모델

참고: 다음 생체 외 동물 모델은 각막 상피의 기계적 손상에 대한 Hung et al.의 이전 경험을 기반으로 합니다20. 다음 단계는 잘 제한되고 일관된 각막 상피 상처를 만들기 위해 현미경으로 수행해야 합니다.

  1. C57BL/6 마우스를 3%-4% 이소플루란으로 마취합니다. 쥐 중심 각막 위에 피부 생검 펀치를 움푹 들어가게 하여 상피에 균일한 상처 여백으로 얕은 원을 남깁니다.
    알림: 안구 파열이 발생하지 않도록 부드럽게 하십시오.
  2. 0.5mm 버가 장착된 각막 녹 고리 제거제를 사용하여 확인된 부위 내의 각막 상피를 Bowman's layer까지 괴사제거합니다.
  3. 기계적 각막 상처의 생체 외 동물 모델을 확립하기 위해 안구를 채취하고 배양을 잘 준비합니다.
    1. 먼저 생쥐를 안락사시킨다. 그런 다음 생쥐의 상부 및 하부 안와 테두리를 부드럽게 누르고 집게의 끝을 구후 공간 위에 삽입하고 안구를 빼내고 집게로 잡습니다.
    2. 각막 가위로 시신경과 안와 주위 연조직을 절단하여 안구를 완벽하게 분리합니다.
    3. 내부에 녹은 왁스가 들어있는 96 웰 플레이트를 준비하십시오. 집게의 끝을 사용하여 둥근 구멍을 빠르게 만든 다음 응고를 기다립니다.
  4. 테스트할 배지를 준비합니다: 0.5% mACS, 비교를 위한 0.5% AS, 음성 대조군으로서 생리 식염수, 및 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM).
    참고: mACS는 위에서 언급한 프로토콜을 사용하여 얻습니다.
  5. 생체 외 배양을 위해 수확한 안구를 준비된 96웰 플레이트에 놓습니다. 각 배지 200μL를 96웰 플레이트에 추가합니다.
  6. 96-웰 배양 플레이트를 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에 넣는다. 배양 배지가 24시간마다 교체되는지 확인합니다.
  7. 순차적인 상처 치유 효과를 확인하기 위해 플루오레세인 염색을 통해 현미경으로 8시간마다 상피 상처 부위를 모니터링합니다.
    1. fluorescein 종이에 fluorescein을 일반 식염수로 녹입니다.
    2. 플루오레세인 염료를 쥐의 중앙 각막에 떨어뜨린 다음 현미경으로 관찰하고 문서화합니다. 일반적인 결과는 그림 4에 나와 있습니다.
      참고: 플루오레세인 염료 한 방울(약 0.05mL)이면 관찰에 충분합니다.

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결과

그림 1과 그림 2는 실험에 필요한 재료를 보여주고, 그림 3은 mACS 준비 중 순차적인 단계와 성공적인 중간 생성물을 보여줍니다. 먼저, 0.5 mL의 10% 글리세롤 용액을 각 10 mL 멸균 시험관에 넣었다(도 3A). 그런 다음 환자로부터 60-70mL의 정맥혈을 채취하고 10mL의 혈액을 각 튜브에 주입했습니다(그림 3B). 환자의 혈액은 혈액의 질이 표준에 부합하는지 확인하기 위해 준비하기 전에 철저하고 정기적 인 실험실 검사를 받아야합니다. 가장 흔한 저품질 혈액 제제는 이상지질혈증으로 인한 것이며, 이는 원심분리 후 제거하기 어려운 혈청의 상층이 흐려지는 결과를 낳습니다. 점안액의 추가 준비는 계속할 수 없습니다 (

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토론

이 연구에서는 mACS를 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고 동물 모델의 상처 치유에서 mACS 점안액의 이점을 추가로 보여줍니다. 이 mACS 프로토콜의 중요한 수정은 각 시험관에 약 0.5mL의 10% 글리세롤 용액을 첨가하여 37°C에서 4시간 배양하는 동안 적절한 저산소 조건을 생성하는 것입니다. 이 설정은 AS에 적절한 스트레스를 제공하고 세포가 상처 치유에 도움이 되는 필요한 성장 인자를 분비하도록 유도합니다. 0.22μm 필터는 고분자 단백질, 혈액 세포 및 불순물을 제거하여 최종 제품을 순수하고 접착력이 떨어지게 하는 데 도움이 될 수 있습니다.

혈액을 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 추가의 원심분리 및 여과를 수행한다. 적절한 온도에서 최종 제품을 준비하고 보관하는 동안 무균에 대한 엄격한 주의도 중요합니다. 최종 혈청 제품의 높은 영양소 함량은 박테리아에 대한 우수한 배양 배지입니다. 따라서 준비 중 부적절한 보관 또는 오염은 점안액을 망칠 수 있습니다...

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자는 훌륭한 기술 지원을 해준 Ya-Lan Chien과 Chia-Ying Lee, 그리고 언어판에 대해 OnLine English 회사에 감사드립니다. 이 연구는 Chang Gung Medical Research Project(보조금 번호 CMRPG3L1491)에서 부분적으로 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  96-웰 배양 플레이트Merck KGaA, 독일CLS3997
Barraquer 뚜껑 speculumkatenaK1-535515 mm
Barraquer 바늘 홀더KatenaK6-3310잠금 장치 없음 
Barron Vacuum Punch 8.0 mmkatenaK20-2108여과지 절단용
BD 10.0 mL 진공 튜브 헤파린 158 USP 단위Becton, Dickinson and Company, US367880후속 실험을 위해 혈액을 수집하고 혈액 응집을 피하기 위해 필요한 최소 6 개의 튜브
BD 21 G 나비 날개 주입 세트Becton, Dickinson and Company, US367281글리세롤 용액
C57BL/6 마우스의 균일한 분포를 위해 국립 연구소 동물 센터RMRC11005마우스 모델
Castroviejo 펜치 0.12 mm카테나 K5-2500
원심분리기Eppendorf, 독일58110004283,500 x g 10
분 Cheng Yi 10.0mL 멸균 안구 병Cheng Yi Chemical, 대만CP405141멸균 및 최종 제품의 저장 용기로
0.5mm 버가 있는 각막 녹 고리 제거제Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TXCHI-675각막 상피 제거용
Dulbecco의 변형된 최소 필수 매체Merck KGaA, GermanyD6429
여과지 도요 로시 Kaisha, Ltd.1.11
플루오레세인 나트륨 안과 스트립 U.S.POPTITECHOPTFL100 각막 상피 결손 염색 
인큐베이터Firstek, 대만S300S37 ° C 4 시간
Kanam 멸균 장갑Kanam Latex Industries, IndiaEN455무균 작동
용 Merck 0.22 µ m filterMerck KGaA, GermanyPR05359mACS 여과용 필터 최소 2
Nang Kuang 250 mL 10% 글리세롤 용액Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan19496혈액 세포에 적합한 막 안정화 효과 및 세포 외 삼투압 제공
생리식염수 TAIWANBIOTECH CO., LTD.100-120-1101
피부 생검 펀치 2mmSTIEFEL22650
실체 현미경Carl Zeiss Meditec, Dublin, CASV11수술
용 현미경 Terumo 18G 바늘Terumo, 대만SMACF0120-18BX3.0 mL 주사기, 원심 분리 후 상층액을 추출하는 18G 바늘
Terumo 20.0 mL 주사기Terumo, 대만MDSS20ES초기 원심 분리 후 혈청을 수집하고 2 차 원심 분리에 사용하는 데 사용할 수 있습니다.
23G 바늘이 있는 Terumo 3.0mL 주사기,대만 Terumo,MDSS03S23253.0mL 주사기를 사용하여 원심분리 후 상층액을 추출합니다. 그런 다음 필터와 23G 바늘을 연결하여 점안액 병에 주입합니다.
Westcott Tenotomy 가위 미디엄katenaK4-3004
개

참고문헌

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