생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

요약

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

초록

복막 조직에 상주하는 대식세포는 항상성 유지에 광범위한 기능을 하며 국소 및 인접 조직 내의 병리학에 관여합니다. 그들의 기능은 미시 환경 단서에 의해 결정됩니다. 따라서 생체 내 생리학적 틈새에서 그들의 행동을 조사하는 것이 필수적입니다. 현재 특정 복막 대식세포 표적화 방법론은 전체 마우스 형질전환 모델을 사용합니다. 여기에서는 렌티바이러스 입자를 이용한 복막 대식세포에서 mRNA 및 small RNA 종(예: microRNA) 발현의 효과적인 in vivo 조절을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 렌티바이러스 제제는 HEK293T 세포에서 제조하고 단일 슈크로스 층에서 정제하였다. 복강내 주사 후 렌티바이러스 효과에 대한 in vivo 검증에서 국소 조직에 국한된 대식세포의 우세한 감염이 밝혀졌습니다. 복막 대식세포의 표적화는 항상성 및 티오글리콜레이트 유발 복막염 동안 성공적이었습니다. 렌티바이러스의 복강 내 전달에 의해 유발되는 낮은 수준의 염증과 잠재적인 실험을 위한 시간 제한을 포함한 프로토콜의 한계에 대해 논의합니다. 전반적으로 이 연구는 생체 내 복막 대식세포의 유전자 기능을 신속하게 평가하기 위한 빠르고 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다.

서론

조직 상주 대식세포(Tissue-resident macrophage, Mφ)는 침입하는 병원체를 감지하고 이에 반응하는 식세포 면역세포의 이질적인 집단입니다 ^1,2. 또한 조직 발달, 리모델링 및 항상성 유지에 필수적인 역할을 합니다 ^1,3. 많은 조직 Mφ는 배아 발생 동안 난황낭 전구 세포에서 파생되며 평생 동안 조직에 남아 있습니다 ^4,5. 이들 세포의 표현형과 기능은 특정 전사 인자와 국소 미세환경 ^6,7,8,9의 협력적이고 계층적인 상호작용에 의해 결정된다. 이러한 의존성에 대한 이해가 증가함에 따라 생리학적으로 관련된 틈새 내에서 Mφ의 유전자 조작을 위한 효과적인 in vivo 방법에 대한 필요성이 증가하고 있습니다.

렌티바이러스 벡터는 생체 내 특정 세포 집단(^10,11,12)에서 핵산을 조작하기 위해 자주 사용되는 도구이며, 특히 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포를 모두 감염시키고 숙주 게놈^13,14에 안정적으로 통합할 수 있는 능력 때문에 더욱 그렇습니다. 지난 20년 동안 렌티바이러스 전달 기술이 최적화되었으며, 계통 특이적 표적화를 증가시키기 위해 대체 외피 및 합성 프로모터가 조사되었습니다 ^8,15. 수포성 구내염 바이러스는 광범위한 세포 영양성으로 인해 당단백질(VSV-G)을 둘러싸고 있습니다.^16,17은 렌티바이러스 기술에서 사용되는 "황금 표준" 외피가 되었습니다.

이 프로토콜¹⁸에서는 VSV-G pseudotyped lentiviral 입자를 사용하여 정상 상태¹⁹에서 생체 내에서 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 microRNA(miR)를 마우스 복막 Mφ(pMφ)에 표적화하고 효과적으로 전달하는 것을 입증합니다. 전이유전자 발현은 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 프로모터에 의해 주도되었습니다. 세포의 생산적 감염은 렌티바이러스 유래의 향상된 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현에 의해 정의되었습니다. 이 접근법을 활용하면 in vivo 렌티바이러스 실험에서 최적의 용량과 실험 기간을 정의하기 위해 쉽게 판독할 수 있었습니다. 마지막으로, 티오글리콜레이트 유발 염증 중 마우스의 생체 내 렌티바이러스 챌린지는 선택적 pMφ 감염에 대한 자연적인 경향을 드러냈습니다.

프로토콜

모든 동물 작업은 기관 및 영국 내무부 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 렌티바이러스에 대한 모든 in vivo 연구는 연구에서 동물의 윤리적 사용에 대한 지역 및 국가 지침에 따라 수행되어야 하며, 카테고리 II 감염 물질의 사용과 관련된 모든 규정을 준수해야 합니다. 동물 복지 또한 현지 규정에 따라 모니터링해야 합니다. 프로토콜의 이 단계에서는 렌티바이러스 입자 및 날카로운 물질로 작업할 때 극도의 주의를 기울여야 합니다.

1. transfection을 위한 HEK293T 세포 준비

참고: 멸균 조직 배양 생물 안전 작업대에서 다음 단계를 수행합니다.

1. 450mL의 DMEM과 10%(v/v) 태아 송아지 혈청(50mL) 및 최종 농도 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 결합하여 HEK293T 세포를 위한 완전한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(cDMEM)을 준비합니다.
2. 계획된 transfection 최소 1주일 전에 HEK293T 세포를 해동합니다. 건강한 성장 조건을 유지하고 trypsin + EDTA를 사용하여 플라스크에서 세포를 분리하는 2-3일마다 통과시킵니다.
3. transfection 하루 전, 세포에서 성장 배지를 조심스럽게 흡인하고 멸균 DPBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 플라스크에 1-5mL의 트립신을 넣고 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 2-5분 동안 배양합니다.
4. 5-10mL의 cDMEM을 추가하고 350 x g 에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 액체를 제거하고 세포 펠릿을 10mL의 cDMEM에 재현탁시킵니다. 세포를 세고 20mL의 cDMEM에서 T175 플라스크당 10-11 x 10⁶ 개의 생존 가능한 HEK293T 세포를 파종합니다.
5. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 배양하여 HEK293T 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 수 있도록 합니다.
6. 다음 날, 광학 현미경으로 세포의 밀도를 확인합니다.
7. 세포 단층을 방해하지 않고 25mL 혈청학적 스트리펫으로 플라스크에서 배지를 제거합니다.
8. DPBS 10mL를 부드럽게 추가하고 플레이트를 흔들어 세포를 세척하고 세포 단층을 방해하지 않도록 주의합니다.
9. 25mL 혈청학적 스트리펫으로 DPBS를 제거합니다.
10. 세포 단층을 방해하지 않도록 T175 플라스크당 벽에 15mL의 새 cDMEM을 추가하고 플레이트를 37°C에서 인큐베이터로 되돌립니다.

2. non-liposomal lipid transfection 시약을 사용한 HEK293T 세포의 transfection

1. 15mL 원심분리 튜브에서 렌티바이러스 성분인 2μg 렌티바이러스 플라스미드, 1.5μg pΔ8.91(pCMV-Δ8.91) 및 1μg pMD2.G(pCMV-MD2.G)를 Buffer EC(Transfection reagent kit)를 사용하여 최종 부피 600μL로 준비합니다.
2. 36μL의 인핸서 용액을 추가합니다. 1mL 피펫을 사용하여 액체의 일부를 반복적으로 빨아들이고 나머지 용액에 직접 한 방울씩 다시 넣어 구성 요소를 혼합합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 그대로 둡니다.
3. transfection 시약 120μL를 첨가하고 위와 같이 약 20회 혼합합니다. RT에서 10분 동안 배양합니다.
4. 5.2mL의 cDMEM을 추가하고 위와 같이 5mL의 혈청학적 스트리펫과 혼합합니다.
5. 일회용 전사 피펫을 사용하여 transfection 혼합물을 HEK293T 세포 단층에 직접 적하하여(플라스크 벽을 피하고) 혼합물을 플라스크의 다른 지점에 펴 바릅니다.
6. 플라스크를 좌우로 부드럽게 흔들어 플라스미드를 분포시킵니다. 플라스크 뚜껑에 액체가 들어가지 않도록 하십시오.
7. 플라스크를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 세포 이미징 형광 현미경으로 transfection을 모니터링한 후 24시간 이내에 형광 마커(여기서는 GFP)의 출현으로 HEK293T 세포의 효과적인 transfection을 확인합니다.
   참고: 형광 마커가 없는 구조체의 경우, 사용된 마커 유전자의 존재 여부를 검사하거나 적절한 기술(예: qPCR)에 의한 관심 유전자/단백질의 발현 변화에 의해 HEK293T 세포를 테스트해야 합니다. 또는, 성공적인 transfection은 위의 기법에 의해 프로토콜의 후기 단계에서 Jurkat 세포에 대한 렌티바이러스 수집을 테스트하는 동안 간접적으로 검증될 수 있습니다.
   주의: 형질주입된 HEK293T 세포는 감염성이 있는 것으로 간주되며, 이러한 세포를 취급할 때는 적절한 안전 예방 조치를 취해야 합니다. 현지 규칙을 따라야 하며, 여기에는 일반적으로 카테고리 II 생물학 안전 캐비닛에서 작업, 이중 장갑 사용, 소독을 위한 적절한 오염 제거 용액(예: 폐기물 표백제(2,000ppm) 농도 증가 또는 기관 생물 안전 지침에 따른 동등한 용액)이 포함될 수 있습니다. 렌티바이러스 제제와 접촉하는 모든 용액 및 플라스틱은 기관의 생물안전 절차에 따라 소독해야 합니다.

3. 렌티바이러스 입자 수집

1. 오염 제거 용액, 고농도(2,000ppm) 표백제(차아염소산나트륨) 용액 또는 기관 생물 안전 지침에 따라 이에 상응하는 약제를 양동이에 준비하여 생물학 안전 캐비닛에 넣습니다.
2. 빈 튜브 랙 등과 같은 과도한 품목을 제거하여 생물학 안전 캐비닛을 준비합니다.
3. T175 HEK293T 세포 플라스크에 따라 50mL 원심분리기 튜브에 사전 라벨을 부착하고 원심분리기 튜브에서 뚜껑을 제거합니다. 튜브를 안정적인 랙에 놓습니다.
4. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 488nm 레이저가 장착된 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인합니다(그림 1A). 신호의 강도는 절차와 사용된 구조체의 transfection 효율성에 따라 달라집니다.
5. 세포의 배지를 사전 라벨링된 50mL 원심분리 튜브로 수집합니다. 형질주입된 세포로 T175 HEK293T 플라스크를 기울여 배지가 플라스크의 하단 모서리에 모이도록 합니다. 25mL 혈청학적 스트리펫을 사용하여 세포 단층을 방해하지 않고 배지를 수집합니다. 이 시점에서 일부 부동 셀이 표시될 수 있습니다. 배지를 깨끗한 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 뚜껑을 닫습니다.
   1. 25mL의 혈청학적 스트리펫을 사용하여 플라스크에 신선하고 따뜻한 cDMEM 25mL를 추가합니다. 세포 단층을 방해하지 않도록 매체 흐름이 플라스크 벽에 향하도록 하십시오. transfection된 HEK293T 세포가 있는 플라스크를 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)로 되돌립니다.
      참고: 렌티바이러스의 두 번째 채취 및 추가 정제는 위 단계에 설명된 절차에 따라 추가 24시간 후에 수행할 수 있습니다.
6. 24시간 또는 48시간 후에 렌티바이러스 수집이 완료되면 세포에 오염 제거 용액을 추가하여 세포 단층을 덮도록 합니다. 다음 24시간 동안 플라스크를 수평으로 유지한 다음 적절한 카테고리 II 규정에 따라 폐기하십시오.

4. 렌티바이러스의 정제

1. 필터는 3.5 단계에서 매체를 수집합니다.
   1. 50mL 주사기에서 플런저를 제거하고 단백질 결합이 적은 폴리에테르 설폰 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 0.45μm 멸균 필터를 주사기 끝에 삽입합니다. 25mL 혈청학적 스트리펫을 사용하여 3.5.1단계에서 수집된 배지를 주사기에 추가하고 플런저를 부드럽게 되돌립니다.
   2. 플러그를 천천히 밀어 매체를 필터를 통해 새 50mL 원심분리기 튜브로 통과시킵니다. 유량이 크게 감소하면 필터가 위쪽을 향하도록 주사기를 놓고 필터에서 매체를 제거할 수 있을 만큼 플런저를 당겨 빼냅니다.
   3. 주사기의 필터를 새 것으로 조심스럽게 교체하고 사용한 필터를 오염 제거 용액에 폐기하십시오. 중간 여과를 계속합니다. 완료되면 필터를 물에 담그고 주사기에 오염 제거 용액을 채워 필터와 주사기의 오염을 제거합니다.
2. 온도를 4°C로 설정하여 초원심분리기를 사전 냉각하고 온도가 적응할 수 있도록 뚜껑을 닫습니다.
3. 20% 자당 용액 3mL(초순수에서 20% w/v, 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균)를 원추형 초원심분리기 튜브의 바닥에 추가합니다.
4. 25mL 혈청학적 스트리펫을 사용하여 여과된 배지를 자당 층 위에 오버레이하고 층을 방해하지 않도록 주의합니다.
   1. 피펫 보이에서 가장 낮은 속도 설정을 사용하십시오. 원뿔형 초원심분리기 튜브의 각도를 약 45°로 조정하고 4.1단계에서 여과된 렌티바이러스 함유 배지를 튜브 벽에 천천히 추가합니다. 매체와 자당이 혼합되지 않고 층의 명확한 분리가 보이는지 확인하십시오(그림 1B). 중간 층의 부피가 증가함에 따라 초원심분리기 튜브를 다시 수직 위치로 천천히 기울입니다.
5. 초원심분리기 튜브의 자당과 배지를 포함한 총 부피가 29mL 미만인 경우 회전 중에 튜브가 무너지지 않도록 새 cDMEM을 보충합니다. 여러 T175 mL 수집의 경우 여과된 배지 제제를 혼합하고 여러 개의 초원심분리기 튜브를 사용하십시오. 필요에 따라 최종 초원심분리기 튜브에 매체를 충전합니다.
6. 초원심분리기 버킷이 깨끗한지 확인하십시오. 양동이나 캡의 바닥에 매체 잔류물이 없습니다. 필요한 경우 ~70% 알코올로 닦아내십시오. 각 버킷의 바닥에 적절한 튜브 어댑터를 넣고(그림 1C) 초원심분리기 튜브를 버킷 안으로 부드럽게 내립니다.
7. 버킷을 단단히 닫고 스핀아웃 로터의 할당된 공간에 걸어둡니다.
8. 버킷이 동일한 양의 자당과 매체로 균형을 이루는지 확인하십시오. 스핀아웃 로터는 버킷 없이 작동해서는 안 되지만, 반대쪽 버킷은 비어 있을 수 있습니다²⁰ (그림 1D).
9. 로터를 초원심분리기에 조심스럽게 삽입하고 진공을 켭니다. 초원심분리기 가속 및 감속 속도를 가장 낮게 설정하고 렌티바이러스 전처리를 85,000 x g 에서 4°C에서 90분 동안 실행합니다.
10. 초원심분리기가 필요한 속도(약 3-5분)에 도달할 때까지 기다렸다가 로터가 제대로 삽입되고 회전이 종료되지 않는지 확인합니다.
11. 초원심분리기가 작동하는 동안 카테고리 II 안전 요구 사항에 따라 작업 공간을 청소하고 다음 단계를 위한 공간을 준비합니다.
12. 회전이 끝나면 진공을 비활성화하고 샘플을 방해하지 않도록 로터를 조심스럽게 제거합니다.
13. 초원심분리기에 유출물이 있는지 조사하고 버킷에서 누출이 없는지 확인합니다. 유출된 경우 이중 장갑을 끼고 원심분리기와 버킷의 외부 표면을 항바이러스 제품으로 오염을 제거하십시오.
14. 초원심분리기에서 버킷을 제거하고 버킷을 카테고리 II 생물학 안전 작업대로 조심스럽게 운반합니다.
    참고: 렌티바이러스 입자는 초원심분리기 튜브의 바닥에 모입니다. 펠릿은 육안으로 볼 수 없습니다.
15. 자당과 매체를 한 번의 부드러운 동작으로 오염 제거 용액과 함께 폐기물 용기에 직접 붓습니다.
16. 초원심분리기 튜브를 거꾸로 뒤집은 상태에서 조직의 이중층으로 옮기고 10분 동안 건조시킵니다. 그동안 물에 적신 티슈로 양동이 내부를 닦고 거꾸로 자연 건조시킵니다.
17. 초원심분리기 튜브 가장자리에 남아 있는 액체를 티슈로 조심스럽게 건조시킨 후 똑바로 세웁니다. 조직과 그 아래 표면을 소독합니다.
18. 추가 실험에 필요한 무혈청 배지 또는 용액 1mL에 바이러스 펠릿을 현탁시킵니다. 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 추가 실험에 필요합니다. 카테고리 II 생물학 안전 캐비닛 내부의 RT에서 15분 동안 그대로 두십시오.
19. 1.5mL 스크류 탑 튜브(예: 크라이오튜브)에 분취하기 전에 1mL 피펫을 사용하여 렌티바이러스 제제를 부드럽게 혼합합니다. in vivo 작업(100 μL의 다중성) 및 Jurkat T 세포(1 x 20 μL)에서 렌티바이러스 역가를 위한 부분 표본을 준비합니다(5단계 참조).
20. 동결-해동 주기를 피하십시오. 렌티바이러스 제제는 감염성에 부정적인 영향을 미치지 않고 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

5. Jurkat T 세포의 렌티바이러스 생산 적정

1. 500mL의 RPMI-1640에 10%(v/v) 태아 송아지 혈청을 보충하고 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신의 최종 농도를 보충하여 Jurkat T 세포를 위한 완전한 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지(cRPMI-1640)를 준비합니다.
2. Jurkat T 세포의 건강한 배양을 보장하기 위해 감염 전 최대 1주일 동안 세포를 배양 상태로 유지하십시오.
3. 렌티바이러스 적정 당일, cRPMI-1640 웰당 200 μL의 2 x 10⁵ 세포/웰로 24웰 플레이트에 생존 가능한 Jurkat T 세포를 플레이트링합니다.
4. 갓 채취한 렌티바이러스를 사용하거나 20μL가 함유된 렌티바이러스 바이알을 얼음 위에서 해동하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
5. cRPMI-1640에서 연속 희석을 사용하여 0.25 μL, 0.5 μL, 1 μL, 2.5 μL, 5 μL 및 10 μL의 렌티바이러스 스톡으로 Jurkat T 세포를 감염시킵니다. 렌티바이러스가 균등하게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 감염되지 않은 Jurkat T 세포는 음성 대조군 역할을 합니다.
6. 37 °C에서 플레이트를 배양합니다. 4시간 후 각 웰에 cRPMI를 총 400μL까지 보충합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 3일 동안 다시 넣습니다.
7. 감염 후 48시간 후 형광 이미징 시스템에서 GFP 발현을 확인합니다.
8. 감염 3일 후, 24웰 플레이트의 각 웰을 별도의 1.5mL 수집 튜브에 모으고 세포를 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
9. 상층액을 버립니다. DPBS에서 2%(w/v)로 준비된 2% 파라포름알데히드(PFA) 300μL에 펠릿을 재현탁시키고 어두운 얼음 위에서 15분 동안 그대로 둡니다.
10. 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 세포를 원심분리하고 펠릿을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 완충액(멸균 DPBS + 4% FCS + 1mM 멸균 EDTA)에 재현탁시킵니다.
11. 유세포 분석을 사용하여 감염된 렌티바이러스 및 그 대조 세포의 GFP 발현 빈도와 평균 형광 강도를 분석합니다(그림 2).

6. 조직 상주 복막 대식세포의 생체 내 렌티바이러스 감염

1. 카테고리 II 생물 안전 작업대에서 필요한 양의 렌티바이러스가 포함된 총 200μL의 무혈청 배지 배지를 인슐린 바늘에 로드합니다(일회용 바늘 사용, 동물 복지 및 바늘의 체액 손실을 방지하기 위해 30G).
2. 한 손으로 떠서 먹는 기법을 사용하여 바늘 칼집을 바늘에 다시 놓습니다. 바늘을 얼음 위에 놓고 30분 이내에 주입하십시오.
3. 동물 시설에서 주사 전에 카테고리 II 생물 안전 캐비닛을 설정합니다(그림 1E).
   1. 깨끗한 티슈 한 장을 깔아줍니다. 렌티바이러스가 들어있는 인슐린 바늘의 칼집을 풉니다.
   2. 작은 조직 조각과 클로르헥시딘 글루코네이트 기반 소독제가 들어 있는 페트리 접시, 오염 제거 용액(2,000ppm 표백제 용액)이 들어있는 50mL 튜브 및 날카로운 안전 용기를 준비합니다.
4. 목덜미²¹의 피부를 잡고 마우스를 제지합니다. 적절하게 구속된 마우스는 움직이지 않으며 이는 안전을 위해 필요합니다.
5. 복부가 위를 향하게 하여 동물의 머리를 약간 아래로 향하게 합니다. 렌티바이러스를 복강내 내 복강의 오른쪽 아래 사분면에 주입합니다. 이는 복막강 장기에 주사하는 것을 피하기 위함입니다.
6. 마우스를 놓기 전에 주사기에 오염 제거 용액을 채우고 날카로운 안전 상자에 안전하게 폐기하십시오.
7. 소독제에 적신 조직으로 쥐의 복부에 있는 주사 부위를 닦고 동물을 케이지로 되돌려 보냅니다.
8. 렌티바이러스가 주입된 마우스를 카테고리 II 스캔테이너 또는 개별 환기 케이지(IVC)(고효율 공기 여과 기능이 있는 격리 케이지)에 주입 후 최소 72시간 동안 보관합니다. 케이지 앞면에 적절한 정보 카드를 놓습니다.
9. 감염 후 72시간 후에 현지 안전 승인에 따라 마우스를 새로운 범주 I 홀딩 케이지로 이동합니다. 주입 후 총 3일 동안 매일 마우스를 모니터링합니다.

7. 렌티바이러스에 감염된 쥐의 복막 세포 수집

주의: 렌티바이러스 주입 후 72시간 이내에 채취한 경우, 기관 카테고리 II 생물학적 안전 규칙을 따르십시오. 렌티바이러스 주입 후 처음 72시간 동안 감염된 동물이 보관된 침구 및 보관 케이지는 기관 카테고리 II 생물학적 안전 규칙에 따라 오염을 제거해야 합니다.

1. 예를 들어, 증가하는 CO₂ 농도를 흡입한 후 자궁경부 탈구에 의한 사망 확인을 통해 제도적 규정에 따라 마우스를 안락사시킵니다.
2. 70% 이소프로판올로 쥐의 복부를 청소하고 피부를 조심스럽게 잘라 복막이 노출되도록 합니다.
3. 10mL 주사기와 23G 바늘을 사용하여 6mL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액으로 복막강을 세척합니다. 장기에 구멍을 뚫지 마십시오.
4. 복막을 부드럽게 마사지하여 세포를 FACS 완충액으로 제거합니다.
5. 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 복막액을 채취합니다.
6. 바늘을 제거하고 세포를 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
7. 복막 세척을 얼음 위에 두십시오.
8. 기타 필요한 장기를 수집하여 연구에 적합하게 보관합니다.
9. 지역 동물 및 안전 지침에 따라 동물 사체를 처리하십시오.

8. 복막 세포 염색 및 분석

1. 복막 세척액을 4°C에서 350 x g 으로 5분 동안 원심분리하고, 오염 제거 용액에서 상층액을 버리고, 세포를 1mL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다.
2. 수집된 세포를 계산하고 V-바닥 96웰 플레이트에서 웰당 4 x 10⁵ 셀을 플레이트합니다.
3. 제조업체 지침에 따라 고정성 시약(예: 여기에 사용된 Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit)을 사용하여 생존도 염색을 수행합니다.
4. 세포가 지난 72시간 이내에 감염된 경우 얼음에서 15분 동안 2% PFA에 세포를 고정합니다. 동일한 양의 차가운 DPBS를 추가하고 4°C에서 350 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
5. 차단 완충액 준비: 표면 염색을 위해 FACS 완충액의 10%(v/v) 랫트 혈청에 4μg/mL 2.4G2 항체를 혼합하거나 세포 내 염색을 위해 투과성 완충액을 혼합합니다.
6. 세포 펠릿이 포함된 각 웰을 50μL의 차단 완충액에 재현탁시키고 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
7. 각 샘플당 50μL의 FACS 완충액(표면 염색용) 또는 투과성 완충액(세포 내 염색용)에 항체 혼합물을 준비합니다. 각 샘플의 최종 염색량은 50μL의 차단 완충액을 포함하여 100μL입니다. 이에 따라 항체 농도를 계산한다(표 1).
8. 시료에 50 μL의 항체 혼합물을 추가하고 대조군에 50 μL의 isotype 대조군 및 대조군 완충액을 첨가하여 대조군에 첨가합니다. 어두운 얼음 위에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 필요에 따라 염색되지 않은 세포와 isotype 컨트롤을 포함합니다.
9. 100-200 μL의 얼음처럼 차가운 DPBS로 각각을 잘 세척하고 플레이트를 350 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 이 단계를 반복하여 결합되지 않은 항체를 씻어냅니다. 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다.

9. 장기에서 세포 추출

1. 장기당 1mL의 분해 혼합물 준비: Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 2mg/mL 콜라겐분해효소 IV형 및 0.03mg/mL DNase I(폐 소화를 위한 히알루로니다제 1.5mg/mL 포함)을 혼합합니다.
2. 채취한 장기를 분해 믹스 1mL에 옮기고 가위로 다진다.
3. 40μm 스트레이너와 원심분리기를 통해 4°C에서 350 x g , 5분 동안 세포를 여과합니다.
4. 폐, 비장 또는 간에서 세포를 분리하는 경우 ACK 용해 완충액(150mM_NH4Cl, 10mM KHCO₃, 0.1mM_Na2EDTA pH = 7.4)을 사용하여 적혈구를 용해합니다. 40μm 스트레이너와 원심분리기를 통해 4°C에서 350 x g , 5분 동안 세포를 여과합니다.
5. 섹션 8에 설명된 대로 세포를 염색하고 분석합니다.

결과

이 프로토콜을 완전하고 정확하게 따를 경우, 단일 제제당 총 1.5mL의 고품질 렌티바이러스 스톡을 생성하며, 이는 이 연구에서 결정된 최적의 부피로 12회의 in vivo 주사에 충분합니다¹⁸. transfection의 성공 여부는 프로토콜 초기에 평가할 수 있습니다. 건강하고 융합된 HEK293T 세포는 플라스미드에 존재하는 경우 플라스미드 transfection 후 48시간 후에 쉽게 검출할 수 있는 마커 신호(예: 이 연구에서 사용된 GFP)를 표시해야 합니다(그림 1A). 프로토콜의 초기 단계에서 신호의 낮은 강도, 과도한 세포 분리 및 낮은 밀도는 세포 사멸을 나타낼 수 있으며 렌티바이러스 제제의 수율이 낮아질 수 있습니다. 선택적 수집 II(단계 3.5.1) 이전의 일부 셀 분리가 보이고 예상됩니다.

이 프로토콜에는 렌티바이러스 입자 생성을 위한 3개의 플라스미드가 사용됩니다: 구조적 HIV-1 단백질(Gag)을 암호화하는 pCMV-ΔR8.91 패키징 플라스미드, 보조 단백질 Tat 및 Rev, 역전사 효소 중합효소(Pol)²²; CMV 프로모터¹³ 하에서 VSV-G 엔벨롭을 인코딩하는 pMD2.G; 및 shRNA 또는 microRNA의 발현에 따라 변형된 pHR'SIN-cPPT-SEW 플라스미드(인코딩 향상된 GFP 마커)¹⁹ .

렌티바이러스 제제는 감염성이 높기 때문에 Jurkat T 세포주에서 적정됩니다²³. 성공적인 렌티바이러스 제제는 5μL의 적은 용량으로도 95% 이상의 감염률을 달성할 수 있습니다(그림 2A). 감염된 세포의 평균 형광 강도는 선량이 높을수록 계속 증가합니다(그림 2B,C). 필요한 경우, 통합된 바이러스 구성 요소(예: SFFV 프로모터)의 Real-Time PCR을 사용하여 바이러스 역가를 측정할 수 있으며, 이는 GFP 발현 세포의 비율과 선형적으로, GFP MFI와 대수적으로 상관 관계가 있습니다(그림 2D). 구조체에 따라, 특히 큰 삽입물(²⁴)을 가진 것들에 따라, 일부 렌티바이러스 제제는 이 연구에서 사용된 Cre-GFP 구조체에 대해 입증된 바와 같이 Jurkat T 세포에서 감소된 감염성을 나타낼 수 있습니다(그림 2E, F). 이러한 경우, 렌티바이러스 입자의 여러 제제를 결합하여 1mL에 재현탁시킬 수 있습니다. 실험 전에 이러한 제제에 대한 면역 반응을 in vivo 검증하는 것이 좋습니다. 당연히 여기에 사용된 VSV-G에 대한 대체 진입 수용체를 가진 렌티바이러스 제제는 세포의 수용체 발현에 따라 Jurkat T 세포주에서 다른 감염 효율을 나타낼 수 있습니다. 적정에 사용되는 세포주는 렌티바이러스 입자가 세포에 유입되는 데 사용하는 수용체를 발현하도록 선택해야 하며, 제한 인자(restriction factor)²⁵의 발현이 우선적으로 부족하거나 매우 낮을 수 있도록 해야 합니다.

렌티바이러스 입자의 성공적인 생산은 pMφ(CD11b⁺ F4/80⁺ 및 Tim4⁺ 집단으로 정의됨)¹⁸의 감염에 의해 더욱 입증되었습니다(그림 3A). 우리는 100 μL 렌티바이러스 제제의 복강 내 주입(총 200 μL의 무혈청 배지 용량)이 이러한 세포에서 GFP 신호의 가장 높은 비율과 강도를 생성한다는 것을 확인했습니다(그림 3B, C). 더 높은 용량의 주입 (150 μL 및 200 μL의 렌티바이러스 제제)은 pMφ의 GFP 발현에 유익한 영향을 미치지 않았습니다. 100μL 렌티바이러스를 복강내(i.P) 주사 후 4시간, 3일, 7일, 14일째 시점의 시간 경과 실험에서 3일째와 7일째에 GFP 발현 상주 pMφ의 상당한 비율이 나타났고, 14일째에 감염 집단이 사라졌습니다(그림 3D, E). 흥미롭게도, GFP 발현 pMφ는 감염 후 14일째까지 대부분 사라지는데, 이는 부분적으로 GFP 마커의 면역 인식 때문입니다. 실제로, T-Reg 선택적인 Foxp3-DTR-eGFP 마우스에서 GFP 마커를 사용한 렌티바이러스 실험은 적어도 21일까지 감염된 resident pMφ의 거부 반응을 방지합니다(그림 3F). Jurkat 세포에서 효과가 감소한 렌티바이러스 제제의 경우, in vivo 감염률을 달성하기 위해 더 많은 양이 필요합니다. 그러나 Cre-GFP 렌티바이러스 제제에서 입증된 바와 같이 구조 설계에 따라 i.p 주입 후 7일에 300μL를 투여해도 좋지 않은 결과를 얻을 수 있습니다(그림 3G). 우리는 이전에 렌티바이러스 shRNA 매개 Map3k8 및 Gata6 knockdown, Gata6 과발현¹⁹를 포함하여 마우스 pMφ에서 in vivo 유전자의 과발현 및 knockdown에 이 프로토콜을 성공적으로 사용했음을 입증했습니다. 여기에서는 이 프로토콜이 murine microRNA 146b(mmu-miR-146b)의 과발현과 상주 pMφ에서 렌티바이러스 유래 shRNA를 사용하여 세포 간 접착 분자 1(ICAM1, CD54)의 knockdown에도 성공적으로 사용될 수 있음을 보여줍니다(그림 3H,I).

대식세포와 같은 일차 세포의 감염은 더 많은 렌티바이러스 투입을 필요로 하는데, 이는 아마도 이러한 세포에 제한 인자가 존재하기 때문일 것입니다. 제한 인자는 역전사 또는 통합과 같은 바이러스의 수명 주기 단계를 방해하는 세포의 자연적인 보호 메커니즘으로, 구성물에서 유전자 발현을 억제합니다.

또한, 프로토콜의 in vivo 검증에서는 i.p 렌티바이러스 전달이 복막 면역 세포 생존력에 미치는 영향이 없음을 보여주었으며(그림 4A), 상주 pMφ 하위집단(CD73 및 Tim4 마커의 발현으로 정의됨)의 뚜렷한 감염성을 나타냈습니다(그림 4B,C). 중요한 것은 챌린지 후 7일 후 장간막 림프절(mLN), 폐, 간 또는 비장 Mφ에서 유의한 GFP 발현이 부족하다는 것이 입증된 바와 같이 생산적인 렌티바이러스 감염이 주사 부위의 상주 Mφ로 제한되었다는 것입니다(그림 4D). 많은 경우에 염증성 조건에서 Mφ의 유전적 표적화를 수행해야 한다는 점을 고려하여, 4% 티오글리콜레이트 0.1mL로 복강내 도전 마우스에서 이 프로토콜의 효과를 조사했습니다. 티오글리콜레이트 주사는 염증성 단핵구 유래 Mφ 및 단핵구 세포의 유입을 유발하며, 이는 5개의 별개의 개체군으로 나눌 수 있습니다(그림 4E). 유세포 분석 결과 인간 세포에서 이전에 발견된 렌티바이러스 감염에 대한 단핵구 유사 세포(Ly6C^hi populations 1 및 2)의 불응성 표현형이 밝혀졌습니다²⁶. 대조적으로, 거주자 Mφ 및 단핵구(그룹 3-5)는 감염에 가장 취약한 상태로 남아 있었습니다(그림 4F).

상세한 유세포 분석은 주로 상주 복막 Mφ 및 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II⁺ 상주 pMφ(MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺)에서 GFP 발현을 검출했습니다(주입 후 3일째에 최대 60%)(그림 5A). 골수 유래 복막 Mφs/DC(MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), B 세포(CD19⁺), T 세포(CD3⁺), 비만 세포(CD11b^-, FcεR1⁺), 호산구(Siglec-F⁺), NK 세포(CD19^-, NK1.1⁺) 및 호중구(Ly6G⁺)를 포함한 다른 복막 세포 집단에서는 GFP 신호가 거의 또는 전혀 검출되지 않았습니다(그림 5A, B). 모든 집단에서 GFP 발현 수명(그림 5C)은 상주 복막 Mφ(그림 1D)의 이를 따랐습니다. 렌티바이러스(그림 5D)의 100μL(총 200μL의 무혈청 배지) 주입 후 4시간 후 호중구 빈도의 일시적인 증가가 기록되었으며, 이는 문제가 있는 동물에서 초기 경미한 염증이 존재함을 나타냅니다. 마지막으로, 레지던트 pMφ는 감염 후 7일에서 14일 사이에 빈도가 크게 감소했으며(그림 5E), 이는 주입 후 3일에서 7일 사이에 최상의 실험 창구를 시사합니다.

그림 1: HEK293T 세포에서의 렌티바이러스 생산. (A) 성공적인 transfection 후 48시간 후 HEK293T 세포의 대표적인 면역형광 사진(형광 현미경[488nm 여기 피크, 510nm 방출 피크], 20배 배율, 스케일 바 = 400μm). (B) 20% 자당 층(하단, 투명)과 형질주입된 HEK293T 세포에서 수집된 배지 층(상단, 빨간색)을 포함하는 초원심분리기 원추형 튜브의 사진. (C) 어댑터를 포함하여 원뿔형 초원심분리기를 버킷에 올바르게 삽입한 사진. (D) 초원심분리기 로터의 올바른 균형과 잘못된 균형을 보여주는 사진. (E) 오른손잡이를 위한 생체 내 주입을 위한 Cat II 캐비닛 및 재료의 최적 설정 사진. 이 그림은 Ipseiz N et ^al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: Jurkat T 세포의 렌티바이러스 적정. (A) GFP 플라스미드를 함유한 렌티바이러스의 용량 증가로 감염 72시간 후 Jurkat T 세포의 대표적인 유세포 분석은 GFP⁺ 세포(GFP⁺), (B) GFP⁺ 세포의 평균 형광 강도(MFI) 및 (C) GFP 발현의 대표적인 히스토그램의 백분율을 보여줍니다. (D) MFI(왼쪽 Y)와 GFP 발현 렌티바이러스에 감염된 세포의 비율(오른쪽 Y) 대 DNA pg(x축)당 검출된 바이러스의 복제 수를 보여주는 산점도. (E) 차선의 Cre-GFP 렌티바이러스(Cre-GFP LV) 준비 및 대조군을 통한 Jurkat T 세포 감염의 대표 히스토그램 및 (F) Cre-GFP 렌티바이러스에 감염된 Jurkat T 세포(GFP⁺)의 백분율을 보여주는 요약 데이터. 이 그림은 Ipseiz N et ^al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 상주 pMФ의 감염 효율. (A) 상주 pMφ(CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) 및 Tim4^-, F4/80⁺ 셀의 게이팅 전략. 세포는 단일항에 게이트된 후 CD11b⁺에 의해 제어되었습니다. (B) 대표적인 점도표, (C) 다양한 양의 GFP 렌티바이러스 제제로 생체 내 감염 3일 후 분리한 GFP⁺ 세포의 감염 빈도(% GFP+ 세포) 및 강도(MFI)에 대한 요약. (D) 대표적인 점도표, (E) 총 200μL의 무혈청 배지 배지에서 100μL의 렌티바이러스로 생체 내 감염 후 서로 다른 시점에서 분리된 GFP+ 세포의 감염 빈도(% GFP+ 세포) 및 강도(MFI)의 요약. (F) Foxp3-DTR-eGFP 마우스에서 GFP 발현 렌티바이러스의 복강 내 전달 후 7일, 14일, 21일째의 세포 수 요약은 GFP 발현 pMφ 및 염증성 대식세포 및 수지상 세포(InfMØs/DCs [F480^low])의 수를 보여줍니다. (n= 그룹당 1-2). (G) i.p 주입 7일 후 300μL의 Cre-GFP 렌티바이러스를 사용한 Gata6-KO ^{mye 19} resident pMφ의 차선의 생체 내 감염의 대표적인 점도표. (H) murine microRNA-146b(miR-146b) 또는 대조군(C)을 인코딩하는 100μL 렌티바이러스로 생체 내에서 도전받은 상주 복막 Mφ의 mmu-miR-146b-5p 발현의 RT-qPCR 정량화. 상주 pMφ(흰색 원) 및 Tim4^-, F4/80⁺ 셀(회색 원). (I) 표적 shRNA를 함유한 렌티바이러스의 i.p 주입 7일 후, 암컷 129S6 마우스에서 pMφ에 대한 ICAM1의 성공적인 하향 조절에 대한 대표적인 점도표. Control shRNA가 표시됩니다. 오버레이는 isotype 제어를 보여줍니다. 평균 ± SEM, n≥2 마우스로 표현된 데이터. 이 그림은 Ipseiz N et ^al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 상주 pMφ 하위 집단의 감염 효율. (A) 100μL 무혈청 배지(-) 또는 GFP 렌티바이러스(+) i.p 주입 후 7일 동안 생존 가능한 총 단일 세포 및 상주 Mφ의 비율. (B) 생체 내에서 발견되는 pMφ의 4가지 주요 집단인 CD73⁺Tim4⁺, CD73-Tim4-, CD73⁺Tim4-, CD73-Tim4⁺를 보여주는 게이팅 전략 및 (C) 이러한 집단의 해당 감염 빈도(% GFP+ 세포) 및 강도(GFP+ 세포의 MFI). (D) 100μL 렌티바이러스 i.p 주입 후 7일 동안 여러 장기에서 GFP+ 세포의 비율. 약어: mLN, 장간막 림프절. (E) 마우스에 4% 티오글리콜레이트 0.1mL를 5일 동안 주입한 후 렌티바이러스를 i.p로 주입했습니다. 렌티바이러스 i.p 주입 후 3일 후 pMφ 및 단핵구의 게이팅 전략. (F) GFP+ 단핵구(Ly6C⁺) 및 Mφ(Ly6C^-)의 감염 빈도, MFI 및 세포 수 분석. 평균 ± SEM, n≥3 마우스로 표현된 데이터입니다. 이 그림은 Ipseiz N et ^al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 렌티바이러스 주사가 복막 염증에 미치는 영향. 마우스에 렌티바이러스를 발현하는 GFP를 생체 내에서 주입하였다. (A) 다양한 양의 렌티바이러스 주입(50 μL, 100 μL, 150 μL 또는 200 μL) 후 복막강 내 세포 집단의 감염 빈도. (B) i.p 주입 후 7일에 생산적으로 감염된 세포 집단에서 GFP 발현의 강도. (C) i.p 주입 후 다양한 시점에서 복막강 내 세포 집단의 감염 빈도. (D) 및 (E) i.p 주입 후 다양한 시점에서의 세포 비율. 모든 렌티바이러스 주입은 무혈청 배지로 완료된 동일한 총 200μL로 수행되었습니다. 달리 명시되지 않는 한, 100μL 렌티바이러스 용량을 사용하였다. 대조군 마우스("C")는 200μL의 깨끗한 무혈청 배지 배지를 받았습니다. 평균 ± SEM, n≥3 마우스로 표현된 데이터입니다. 이 그림은 Ipseiz N et ^al.18의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항체 표적	형광단	클론	희석 사용	최종 농도 [μg/mL]
HIV-1 핵심 항원	RD1 (RD1)	FH190-1-1 시리즈	1/100	1
I-A/I-E	퍼CpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
라이6G	퍼CpCy5.5	1A8	1/400	0.5
CD3e (CD3e)	퍼CpCy5.5	17A2	1/200	1
CD3e (CD3e)	PE/사이7	500A2	1/400	0.5
CD11c (CD11c)	PE/사이7	N418 시리즈	1/800	0.25
CD11c (CD11c)	BV605 시리즈	N418 시리즈	1/400	0.5
CD226 시리즈	AF647	10 E 5	1/400	1.25
팀4	AF647	재질 보기 RTM4-54	1/600	0.83
CD4 (CD4)	증권 시세 표시기	GK1.5 시리즈	1/400	0.5
CD11b (CD11b)	AF700 시리즈	M1/70분	1/700	0.71
CD11b (CD11b)	퍼CpCy5.5	M1/70분	1/400	0.5
F4/80	퍼시픽 블루	비엠8	1/700	0.71
F4/80	BV605 시리즈	비엠8	1/400	0.25
F4/80	BV711 시리즈	비엠8	1/400	0.5
CD73 시리즈	e플루오르450	타이/11.8	1/400	2.5
CD19 시리즈	V450 버전	1D3	1/400	0.5
CD19 시리즈	증권 시세 표시기	1D3	1/400	0.5
CD8a	e플루오르450	53-6.7	1/400	0.5
시글렉F	BV421 시리즈	재질 보기 E50-2440	1/400	0.5
북한1.1	APC/사이7	PK136 시리즈	1/400	0.5
FceR1	e플루오르450	3월-1	1/400	0.5
아이캠1	체육	1A29	1/100	2
Rat IgG1, κ 동형 대조군	체육		1/100	2

표 1: 항체 목록

토론

조직에 상주하는 대식세포는 생리^{적 환경6,7,8,9}에 의해 좌우되는 다양한 항상성 및 염증성 조직 특이적 기능^(1,2)을 수행한다. 이 프로토콜에서는 렌티바이러스 입자를 사용하여 생체 내에서 복막 상주 대식세포를 조작하는 효과적인 방법¹⁸을 도입하여 생물학적 미세환경에서 대식세포 기능을 조사했습니다.

프로토콜의 성공을 위해서는 건강한 HEK293T 세포를 사용하는 것이 필수적입니다. 세포 회복과 좋은 수를 보장하기 위해 이 프로토콜이 시작되기 최소 일주일 전에 세포를 해동하는 것이 가장 좋습니다. 세포는 계획된 transfection 하루 전에 적절한 양의 배지에 파종해야 하며 transfection 당일에 약 80%의 밀도에 도달해야 합니다. 과소 또는 과도하게 융합된 세포 제제는 렌티바이러스 수율을 감소시킵니다. 최상의 결과를 위해 제조업체의 지침에 따라 transfection 시약으로 HEK293T 세포를 transfection하는 것이 좋습니다. transfection의 필수 단계에는 플라스미드와 시약의 적절한 혼합과 혼합물을 HEK293T 세포 단층에 직접 적가하는 것이 포함됩니다. HEK293T 세포^27,28의 칼슘 포스페이트 형질주입이 이 프로토콜에 사용될 수 있다. 그러나, 사용자는 이 방법의 효과가 다양할 수 있으며, 이로 인해 transfection 효율이 감소할 수 있음을 인지해야 합니다.

안전 예방 조치는 세포 transfection을 HEK293T한 날부터 프로토콜에서 고려해야 합니다. 여기에는 카테고리 II 안전 작업대에서 작업하고, 오염된 물질을 취급할 때 이중 장갑을 착용하고, 최소 4시간 동안 오염된 물질(오염 제거 용액, 예: 2,000ppm 표백제 용액 사용)의 적절한 표백이 포함됩니다. 사용자는 카테고리 II 병원체 및 폐기물 작업에 관한 기관 규정을 참조해야 합니다.

이 프로토콜에서는 먼저 0.45μm 필터를 사용하여 렌티바이러스 제제를 정제하여 세포 파편HEK293T 제거합니다. 더 작은 필터(0.22μm)와 셀룰로오스 에스테르 멤브레인의 사용은 렌티바이러스 입자의 손실을 초래할 수 있으므로 피해야 합니다. 단백질 결합이 적은 폴리에테르 설폰 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터를 사용하는 것이 좋습니다²⁹. 두 번째 정제 단계는 초원심분리기에서 단일 20% 슈크로스 층에서 수행되어 잔류 불순물을 제거하며, 이는 렌티바이러스 제제의 결과적인 생체 내 투여에 특히 중요합니다. 초원심분리기를 사용할 수 없는 기관에서는 표준 실험실 원심분리기를 사용한 자당 기반 렌티바이러스 정제를 설명한 다른³⁰ 명이 있습니다. 이것은 대안으로 이 프로토콜에서 구현될 수 있습니다. 렌티바이러스 제제는 마커 신호(예: 이 프로토콜에 사용된 GFP)의 발현에 따라 Jurkat T 세포에서 적정됩니다. 마커가 없는 구조체의 경우, 물리적 렌티바이러스 입자는 ELISA 키트(³¹)에 의한 HIV-1 p24gag 단백질의 정량화, HIV-1 코어 항원(¹⁸)의 유세포 분석 또는 표적 유전자의 변화 측정(개별 세포의 변화를 측정할 수 있는 방법, 예를 들어, 유세포 분석 또는 현미경 검사)을 우선적으로 사용하여 평가할 수 있습니다. Jurkat T 세포에서 대조군과 렌티바이러스의 적정이 크게 다른 경우, in vivo 연구에 사용되는 부피를 조정하여 렌티바이러스 제제 간의 가장 유사한 감염에 도달할 수 있습니다.

프로토콜의 주요 제한 사항은 i.p 렌티바이러스 주입 후 14일 이내에 GFP⁺ 상주 복막 Mφ가 사라지는 것이 관찰되었다는 것입니다. 장기 연구를 위해 특정 세포 유형 또는 조직에서 안정적인 유전적 변형을 가진 마우스 계통을 고려해야 합니다³². 예를 들어, 복막 대식세포는 Foxp3(T-Reg 단백질)를 발현하지 않기 때문에 Foxp3-DTR-eGFP 마우스(³³ )를 사용하여 감염 후 21일째에 복막 Mφ에서 GFP의 발현이 유지되는 것을 확인했습니다(그림 3F). 그러나 렌티바이러스에는 다른 외부 성분이 포함되어 있으며 Foxp3-DTR-GFP 마우스에서 감염된 세포의 지속성에서의 이러한 확장은 영구적이지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 방법의 또 다른 약점은 렌티바이러스 주입 후 복막강에서 관찰할 수 있는 낮은 수준의 염증으로, 주사 후 4시간 후 호중구의 유입에서 볼 수 있으며(그림 5D), 이는 반복적인 감염이 GFP 발현 상주 복막 Mφ의 염증 관련 손실을 가속화할 수 있음을 의미할 수 있습니다. 복막강에서 I형 인터페론(IFN)을 검출하지는 못했지만, VSV-G pseudotyped lentivirus 입자는 검출 가능한 IFN이 없는 상태에서 인간 Mφ에서 일부 IFN 자극 유전자를 유도하는 것으로 이전에 입증되었습니다³⁴. 항바이러스 면역 반응을 조사하는 실험에 이 프로토콜을 사용할 때 이를 고려해야 합니다. 렌티바이러스 제제의 i.p 주사 후 급성 및 지속적인 염증의 발생은 제제의 오염을 나타낼 수 있습니다.

문제 해결 영역은 다음과 같습니다: 1) 낮은 렌티바이러스 역가의 경우 HEK293T 세포의 건강과 효과적인 transfection(예: HEK293T 세포에서 마커 발현)을 보장합니다. 감염률이 낮게 유지되면 구조물의 크기를 고려하십시오. 더 큰 삽입체 또는 더 복잡한 2차 구조를 가진 구조체는 최종 렌티바이러스 역가 및 감염성에 영향을 미칠 수 있다²⁴. 따라서 각 구성은 독립적으로 그리고 각각의 제어 벡터와 병렬로 테스트해야 합니다. 2) 많은 양의 렌티바이러스가 필요한 경우 여러 개의 T175 플라스크를 준비하여 HEK293T세포를 준비하고 그에 따라 생산을 확대하는 것이 좋습니다. 렌티바이러스 제제의 변형을 피하려면 분취 및 보관 전에 최종 컬렉션을 병합하는 것이 가장 좋습니다. 이러한 대량 생산의 경우, 성분의 효과적인 혼합을 보장하기 위해 plasmids mix(section 2)를 50mL 튜브에 준비해야 합니다.

광범위한 영양성에도 불구하고, VSV-G pseudotyped lentiviral 입자는 이전에 폐포³⁵에 대해 입증된 바와 같이 주로 조직 대식세포를 표적으로 하며, 여기서는 각 경로에 의해 투여될 때 pMФ에 대해¹⁸ 을 표적으로 합니다. 렌티바이러스 입자의 외피를 변경하면 경우에 따라 in vivo³⁶ 에서 대식세포의 transduction이 감소할 수 있으며 이 프로토콜에는 필요하지 않습니다. 대식세포에서 in vivo 유전자 조작을 위한 다른 바이러스 접근법과 비교하여(³⁷에서 검토됨), 렌티바이러스 벡터의 사용은 조직 대식세포³⁵에서 전이유전자의 안정적인 통합, 효율적인 전이유전자 발현 및 가장 큰 벡터 크기 제한(약 8Kb)을 제공합니다.

복막 Mφ는 복부암, 췌장염 및 복막염을 포함한 다양한 질병의 예방, 발병, 진행 및 해결에 중요한 역할을 합니다³⁸. 이 프로토콜은 생리학적으로 관련된 미세환경 내에서 이러한 병리학 이면의 생물학적 과정을 조사할 수 있도록 쥐 pMφ의 유전자 변형을 위한 효과적인 도구를 설명합니다. 렌티바이러스 벡터 자체가 임상적 중재를 위한 관심 도구가 되고 있지만³⁹ 면역결핍 바이러스의 기원과 안정적인 게놈 통합으로 인해 안전성 우려가 치료 구현을 방해하고 있습니다. 렌티바이러스 유전자 조절에 대한 대식세포 반응에 대한 추가적인 이해는 임상 환경에서 이 매우 효과적인 도구의 적용을 발전시킬 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신-EDTA (1x) (트립신 500 mg/L 또는 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μ m 멸균 millex GP 필터	Merck	SLGS033SS
0.45 μ m 멸균 millex GP 필터	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 인슐린 주사기와 바늘, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps 용기	N/A	N/A
2.4G2 항체 (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ m 스트레이너	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV 배지(연구 등급), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	,
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% 원액, 물에서 준비, 오토클레이브 및 냉동 유지.
CD11b	Biolegend	101222	희석 및 농도는 표 1 참조
CD11b	BD	550993	희석 및 농도는 표 1 참조
CD11c	Biolegend	117317	희석 및 농도는 표 1 참조
CD11c	Biolegend	117333	희석 및 농도는 표 1 참조
CD19	BD	560375	희석 및 농도는 표 1 참조
CD19	Biolegend	152410	희석 및 농도는 표 1 참조
CD226	Biolegend	128808	희석 및 농도는 표 1 참조
CD3e	BD	560527	희석 및 농도
CD3e	Biolegend	152313	희석 및 농도는 표 1 참조
CD4	Biolegend	100412	희석 및 농도는 표 1 참조
CD73	eBioscience	16-0731-82	희석 및 농도는 표 1 참조
CD8a	eBioscience	48-0081-82	희석 및 농도는 표 1 참조
세포 배양 플라스크 (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
원심분리기 튜브, 원추형 하단 튜브 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
원심분리기	Beckman Coulter		초원심분리기 및 TC 원심분리기
콜라겐분해효소 IV형	Sigma-Aldrich	C5138
원추형 원심분리기 튜브(15 mL 및 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	또는 cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µ M L-글루타민	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene 형질 주입 시약	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	희석 및 농도는 표 1 참조
F4/80	Biolegend	123133	희석 및 농도는 표 1 참조
F4/80	Biolegend	123147	희석 및 농도는 표 1 참조
FceR1	eBioscience	48-5898-80	희석 및 농도는 표 1 참조
태아 송아지 혈청(FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	56°C에서 30분 동안 열 비활성화; C 및 멸균 0.22 &mu를 통해 여과; m 필터
유세포 분석기	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
유세포 분석법(FACS) 완충액	사내에서
형광 조직 배양 현미경	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
겸자	해당 없음 해당	없음	사용자 선호
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T 세포주			형질주입 전 최소 일주일 동안 성장했습니다. 마이코플라스마 무함유
HIV-1 코어 항원	벡크만 쿨터	6604667
히알루로니다아제	시그마-알드리치	H3506
하이드렉스 수술용 스크럽, 클로르헥시딩 글루코네이트 4% w/v 스킨 클렌저	이콜랩	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	희석 및 농도는 표 1 참조
ICAM1	Becton Dickinson	554970
Jurkat T 세포주의			. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	석 및 농도에 대해서는 표 1을 참조하십시오
마우스			C57BL/6 암컷, 8-12주 (Charles Rivers)를 사용했으며, 다르게 지정되지 않는 한
Microcapillary pipettes (부피 범위 0.5-1,000 μ L)	피셔 사이언티픽 & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	의 희석 및 농도는 표 1을 참조하십시오
. R8.91 패키징 플라스미드		Zuffrey, R., et al. 1997	거대세포바이러스 프로모터에 의해 구동되는 Gag-Pol HIV 단백질을 암호화합니다. 암피실린 저항성.
페니실린/스트렙토마이신(100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
페트리 디쉬	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW 플라스미드		Rosas, M. et al. 2014	shRNA 및 miR 발현 연구를 위해 수정됨. EGFP 마커 다운스트림 SFFV 프로모터 및 Woodchuck 간바이러스 인핸서의 업스트림을 인코딩합니다. 암피실린 저항성.
pMD2.G 플라스미드		Naldini, L. et al. 1996	수포성 구내염 바이러스 g-당단백질(VSV-G) 외피를 암호화합니다. 암피실린 저항성.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	희석 및 농도에 대해서는 표 1 참조
쥐 혈청	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
		준비된	적혈구 ACK 용해 완충액
RPMI 1640 매체 (1x) + 400 uM L-글루타민	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	석 및 농도는 표 1 참조
차아염소산나트륨 정제(표백제, 2,000ppm)	게스트 메디컬	H8818
멸균 24웰 세포 배양 플레이트	Greiner Bio One	662160
멸균 Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ 및 Ca2+ - 무료	Thermo Fisher Scientific	14190144
멸균 EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
멸균 VWR 일회용 이송 피펫(23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
수술용 가위	해당 사항 없음	사용자	선호
주사기(50 mL 및 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	희석 및 농도는 표 1 참조
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180