아연 수송은 단백질 기능에 대한 인과 관계가 약하고 시간적 분해능이 낮기 때문에 측정하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 Zn 2+ 민감한 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 높은 시간 분해능으로 Zn 2+ 압출을 모니터링하여 Zn2+ 유출을 직접 측정하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Zn2+ 이온과 같은 전이 금속은 세포 독성으로 인해 엄격하게 조절되어야 합니다. 이전에는, Zn2+ 수송체의 활성은Zn2+의 상이한 농도 하에서 수송체의 발현 수준을 결정함으로써 간접적으로 측정되었다. 이는 면역조직화학을 이용하거나, 조직 내 mRNA를 측정하거나, 세포 Zn2+ 수준을 측정하여 수행되었습니다. 세포 내 Zn 2+ 센서의 개발로 아연 수송체의 활성은 현재 형광 프로브를 사용하여 검출된 세포 내 Zn 2+의 변화와 Zn2+ 수송체의 발현을 연관시킴으로써 주로 결정됩니다. 그러나 오늘날에도 세포 내 Zn2+의 동적 변화를 모니터링하고 이를 사용하여 아연 수송체의 활성을 직접 측정하는 실험실은 소수에 불과합니다. 문제의 일부는 ZnT10(망간 수송)을 제외한 ZnT 계열의 10개 아연 수송체 중 아연 수송체 1(ZnT1)만 원형질막에 국한되어 있다는 것입니다. 따라서 수송 활성을 세포 내 Zn2+ 농도의 변화와 연결하는 것은 어렵습니다. 이 글에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 기반으로 하는 분석을 사용하여 아연 수송 역학을 측정하는 직접적인 방법을 설명합니다. 이 염료는 에스테르 형태로 포유류 세포에 로드된 다음 세포 디에스테라제 활성으로 인해 세포질에 갇히게 됩니다. 세포는 Zn 2+ ionophore pyrithione을 사용하여 Zn2+로 로드됩니다. ZnT1 활성은 세포 세척 후 형광 감소의 선형 부분에서 평가됩니다. 470nm의 여기와 520nm의 방출에서 측정된 형광은 유리 세포 내 Zn2+에 비례합니다. mCherry 형광단으로 태그된 ZnT1을 발현하는 세포를 선택하면 수송체를 발현하는 세포만 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법은 세포에서 과잉 아연을 압출하는 진핵 세포막 관통 단백질인 인간 ZnT1의 수송 메커니즘에 대한 ZnT1 단백질의 다양한 영역의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.
서론
아연은 세포 환경에서 필수적인 미량 원소입니다. 그것은 모든 단백질의 1/3을 포함하며 촉매작용 1, 전사2 및 구조 모티프3와 같은 다양한 세포 과정에 관여합니다. 그러나 산화 환원 불활성임에도 불구하고 높은 아연 농도는 세포에 독성이 있기 때문에 아연 항상성을 조절하는 메커니즘이 없으면 포유류 유기체가 생존하지 못했습니다. 포유류에서는 세 가지 메커니즘이 이 과정을 담당합니다: (1) 높은 친화력으로 아연과 결합하여 과도한 유리 세포질 아연을 방지하는 세포질 시스테인이 풍부한 단백질인 메탈로티오닌4; (2) Zrt/Irt 유사 단백질(ZIP)은 원형질막 또는 세포 내 소기관을 통해 세포질로 아연 유입을 담당하는 아연 수송체입니다 4,5,6,7,8; (3) ZnT는 유비쿼터스 양이온 확산 촉진제(CDF) 계열의 포유류 하위 집합이며 ....
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프로토콜
1. 세포 transfection
- 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 37°C/5%CO2 의 가습 인큐베이터에서 10cm 플레이트(8.8 x 10 총6 개 세포)에 합류할 때까지 HEK293T배양합니다.
- 13웰 플레이트의 각 웰에 12mm 커버슬립을 하나씩 놓습니다. 1.1단계의 0.44 x 106 트립신 세포를 12mL의 완전한 DMEM에 희석합니다. 피펫팅을 3-5회 위아래로 하여 잘 섞습니다. 각 웰에 1mL의 혼합 용액을 채웁니다. 37 °C / 5 % CO2 의 가습 인큐베이터에서 밤새 성장합니다.
- 각 웰의 전체 DMEM을 각 웰의 1mL의 무혈청 DMEM( 재료 표 참조)으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.
- 각 transfection well에 대해 mCherry 형광 단백질(보충 파일 1)로 태그된 관심 단백질을 포함하는 pAAV2....
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결과
ZnT1은 세포 원형질막(13) 상에 위치한 포유류 아연 수송체이다. 이는 세포질에서 세포외 밀리유(extracellular millieu)로 아연을 압출하는 양이온 확산 촉진제(cation diffusion facilitator, CDF) 단백질군의 일원이다14. ZnT1은 막을 가로질러 이온을 운반하는 막관통 도메인과 C-말단 도메인(14)의 두 가지 영역 아키텍처를 가지고 있습니다. 다른 알려진 CDF 단백질과 달리 ZnT1은 확장된 비구조화 C-말단 도메인(USCTD)을 가지고 있습니다. USCTD의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 위의 프로토콜을 사용하여 ZnT1 WT를 USCTD 없이 ZnT1과 비교하여 아연 수송 활성에 대한 관여를 평가했습니다.
HEK 293T 세포는 구조화되지 않은 C-말단(ΔUSCTD) 없이 ZnT1 WT 또는 Zn.......
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토론
상술한 방법은 높은 시간적 분해능으로 세포내 아연 농도를 직접 측정할 수 있게 한다. 다른 방법과 비교하여, 세포 내Zn2+의 변화를 모니터링하는 이 방법은 배경 소음을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 아연에 대한 염료의 선택성은 다른 금속 양이온과의 잠재적인 교차 상호작용을 제거한다(18,19). 마지막으로, 즉각적인 세포 독성이 없기 때문에 살아있는 세포 과정의 테스트를 가능하게합니다 19.
그러나 이 방법에는 특정 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 방법에 사용된 염료는 세포에 갇히도록 설계되었지만 영역이나 특정 프로세스로 유도할 수 없기 때문에 이 프로토콜을 사용하면 세포 내 역학을 검출하는 것이 상대적으로 더 어려울 수 있습니다. 다른 형광 염료는 세포 내의 특정 영역으로 유도될 수 있지만, 불행히도 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
Raz Zarivach는 이스라엘 과학 재단(보조금 번호 163/22)의 지원을 받습니다. 토머 엘리 벤 요세프(Tomer Eli Ben Yosef)와 아리 모란(Arie Moran)은 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation, 보조금 번호 2047/20)의 지원을 받고 있습니다. 벤구리온 대학교의 Daniel Gitler와 그의 그룹의 협력, 지원 및 전문 지식에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10cm 플레이트 | Greiner Bio-one | 664160 | |
| 12웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 13mm 커버슬립 | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22mm 커버 슬라이드 | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6웰 배양 플레이트 | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 소 혈청 알부민 | bioWorld | 22070008 | |
| 염화칼슘 무수, 과립 Sigma | Aldrich | C1016 | Ringer 용액 농도 : 1 mM |
| D-(+) -포도당 | Glentham Life Science | GC6947 | Ringer 용액 농도 : 10 mM |
| Dubelco ' s 수정 이글 미디어(DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti 도립 현미경 | Nikon | TI-DH | 제품 생산 중단 Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine Tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED 조명 시스템 | CoolLED | pE-4000 | |
| L-글루타민 | 생물학 산업 | 03-020-1B | |
| 염화마그네슘 육수화물 | Merck | 1.05833 | 링거 용액 농도 : 0.8 mM |
| N [2-Hydroxyethyl] piperazine-N '- [2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Ringer 용액 농도 : 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS 카메라 | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-ELEMENTS 이미징 소프트웨어 | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab Bio-Lab | Ringer 용액의 163823 농도: 5.4mM | |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Ringer 아연 용액 농도: 7 &뮤; M |
| 실리콘 그리스 키트 | 워너 인스트루먼트 | W4 64-0378 | |
| 염화나트륨 | Bio-Lab | 190305 | Ringer 용액 내 농도: 120 mM |
| 황산 아연 | Sigma Aldrich | 31665 | Ringer 아연 용액 농도: 7 μ 미디엄 |
참고문헌
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryoti....
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재인쇄 및 허가
