Bis-3-chloropiperidines(B-CeP)는 in vitro에서 DNA 템플릿의 G-quadruplex 구조를 식별하고 특성화하는 데 유용한 화학 프로브입니다. 이 프로토콜은 B-CeP를 사용하여 프로빙 반응을 수행하고 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 반응 생성물을 분해하는 절차를 자세히 설명합니다.
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방법 논문
In Vitro (시험관) Bis-3-Chloropiperidines에 의한 G-Quadruplex DNA 구조의 화학적 매핑
이 논문에서
요약
초록
G-quadruplex(G4s)는 유전자 발현 및 질병에 중요한 역할을 하는 생물학적으로 관련된 비표준 DNA 구조로, 중요한 치료 표적을 나타냅니다. 잠재적인 G-quadruplex-forming sequences(PQS) 내에서 DNA의 in vitro 특성 분석을 위해서는 접근 가능한 방법이 필요합니다. B-CeP는 핵산의 고차원 구조 조사에 유용한 화학 프로브로 입증된 알킬화제의 한 종류입니다. 이 논문은 B-CeP와 구아닌의 N7의 특정 반응성을 활용한 후 알킬화된 Gs에서 직접 가닥 절단을 수행하는 새로운 화학 매핑 분석에 대해 설명합니다.
즉, G4 접힘과 풀린 DNA 형태를 구별하기 위해 B-CeP 1을 사용하여 G4 배열을 가정할 수 있는 15-mer DNA인 트롬빈 결합 압타머(TBA)를 조사합니다. B-CeP 반응 구아닌과 B-CeP 1의 반응은 알킬화된 구아닌에서 개별 알킬화 부가물 및 DNA 가닥 절단을 찾아 단일 뉴클레오티드 수준에서 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분해할 수 있는 산물을 생성합니다. B-CeP를 사용한 맵핑은 G-quadruplex 형성 DNA 염기서열의 in vitro 특성 분석을 위한 간단하고 강력한 도구로, G-tetrads 형성에 관여하는 구아닌의 정확한 위치를 파악할 수 있습니다.
서론
전형적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 이중나선 외에도, 핵산은 구아닌이 풍부한 서열로 인해 양자택일 G-4중(G4) 형태와 같은 다양한 2차 구조를 채택할 수 있습니다. G4 구조는 4개의 구아닌이 Hoogsteen 수소 결합을 통해 상호 작용하는 G-tetrads라고 하는 평면 사량체의 형성을 기반으로 합니다. G-tetrad는 구아닌 코어의 중심에서 조정되는 1가 양이온에 의해 적층되고 더욱 안정화됩니다(그림 1)1.
그림 1: G-quadruplex 구조 의 개략도. (A) G-tetrad의 개략적 표현. 평면 어레이는 Hoogsteen 염기쌍과 중심 양이온(M+)에 의해 안정화됩니다.
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프로토콜
1. 핵산 및 화학 탐침 준비
- 핵산
참고: "TBA"라는 올리고뉴클레오티드는 형광단 5-카르복시플루오레세인(FAM)에 의해 3'-말단에 표지된 15-mer DNA 서열 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'으로 겔에 시각화를 가능하게 합니다. 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드 "cTBA"는 DNA 상보적 서열 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'입니다. 표 1에 나타낸 바와 같이 3개의 상이한 구조를 얻기 위해 TBA 및 cTBA가 채용된다.- 오토클레이브 팁과 0.5mL 튜브를 사용하여 멸균 일회용품을 얻고 오염을 방지할 수 있습니다.
- 각 올리고뉴클레오티드를 초순수에 최종 농도 100μM까지 용해시키는 원액을 준비합니다. 제조업체에서 제공한 260nm의 흡광 계수를 사용하여 자외선 가시광선(UV-Vis) 분광 광도계로 정확한 올리고뉴클레오티드 농도를 결정합니다.
참고: 흡광 계수: TBA 및 cTBA에는 각각 164,300 M-1 cm-1 및 138,600 M-1 cm-1이 사용되었습니다. - TBA 및 cTBA 원액을 -20°C에서 보관하십시오(이러한 조건에서 몇....
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결과
그림 2는 세 가지 다른 구조로 접힌 TBA 올리고뉴클레오티드에 대한 B-CeP 1을 사용한 프로토콜에 설명된 대로 수행된 화학 매핑 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. TBA(G4-TBA)의 G-4중이중 배열은 BPE에서 올리고뉴클레오티드를 접고 K+ 양이온의 존재 하에서 얻은 반면, 동일한 TBA 서열의 단일 가닥 형태(ssTBA)는 칼륨이 없는 상태에서 접혔습니다. 이중-가닥 구조체(dsTBA)는 BPE 완충액에서 TBA를 이의 상보적 서열로 어닐링하여 제조하였다. B-CeP 1의 5 또는 50 μM 최종 농도를 G4-TBA(도 2B의 좌측 레인), ssTBA(도 2B의 중앙 레인) 및 dsTBA(도 2B의 우측 레인)의 2μM 샘플과 1시간, 4시간 및 15시간 동안 반응시켰다. 추가 대조군.......
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토론
G-quadruplex는 일반적으로 구아닌이 풍부한 DNA 염기서열 내에서 접히는 핵산 2차 구조이며, 유전적 제어 및 질병과의 연관성 때문에 중요한 연구 대상입니다. B-CePs에 의한 화학적 매핑은 생리학적 염분 조건에서 G-tetrads의 형성에 관여하는 구아닌 염기를 식별하는 데 사용할 수 있는 DNA G4의 특성 분석에 유용한 프로토콜입니다.
이 프로토콜에 사용된 화학 프로브는 B-CeP 1(그림 2A)이며, 이는 구아닌 핵염기의 N7과 특이적으로 반응하여 G-사중이중 테트라드의 형성에 관여하는 구아닌과 이러한 배열에 관여하지 않는 구아닌을 구별할 수 있습니다. 실제로, G-tetrads(그림 1)의 구아닌(guanine) 사이의 Hoogsteen 수소 상호 작용은 프로브와의 반응을 손상시킵니다. 프로빙 반응의 산물은 DNA 염기서열 내에서 알킬화 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 파도바 대학교 제약 및 약리학과(PRIDJ-BIRD2019)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 용액 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| 황산암모늄(APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| 분석 저울 | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | PBI 국제 | ||
| 붕산 | Sigma Aldrich | B0252 | |
| 브로모페놀 블루 브릴리언트 블루 R | 시그마 알드리치 | B0149 | |
| 디소듐 인산수소 도데카하이드레이트 | 플루카 | 71649 | |
| DMSO 시그마 알드리치 | 276855 | ||
| DNA 올리고뉴클레오티드 | 통합 DNA 기술 | 맞춤형 서열 | |
| 합성 EDTA 디소듐 | 시그마 알드리치 | E5134 | |
| 포름 아미드 | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| 겔 이미저 | GE Healtcare | STORM B40 | |
| 글리세롤 | 시그마 Aldrich | G5516 | |
| 마이크로 튜브 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| 염화칼 | Sigma Aldrich | P9541 | |
| 염기서열 분석 장치 | Biometra | 모델 S2 | |
| 실란화 용액 I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| 인산나트륨 일염기 | 성 Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac 농축기 | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| 요소 | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis 분광 광도계 | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
참고문헌
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and....
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재인쇄 및 허가
