세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

Summary

이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

재구성된 세포골격 복합체는 비평형 연성 물질을 연구하기 위한 귀중한 모델 시스템으로 부상했습니다. 이러한 3D 조밀한 네트워크의 역학을 충실하게 포착하려면 종종 형광 컨포칼 현미경과 관련된 광학 절편이 필요합니다. 그러나 최근 광시트 형광 현미경(LSFM)의 발전으로 비용 효율적이고 때로는 우수한 대안으로 자리 잡았습니다. 광학에 익숙하지 않은 세포골격 연구자들이 LSFM을 이용할 수 있도록 기성 부품으로 다용도 광시트 형광 현미경을 제작하는 단계별 초보자 가이드를 제공합니다. 기존 슬라이드 시료로 시료를 장착할 수 있도록 이 LSFM은 여기 및 방출 수집 모두에 단일 대물렌즈를 활용하는 단일 대물렌즈 광시트(SOLS) 설계를 따릅니다. 독자가 기기를 수정하고 특정 요구 사항에 맞게 설계할 수 있도록 SOLS의 각 구성 요소의 기능을 충분히 자세히 설명합니다. 마지막으로, 키네신 구동 미세소관 네트워크에서 과꽃을 시각화하여 이 맞춤형 SOLS 기기의 사용을 시연합니다.

Introduction

광시트 형광 현미경(LSFM)은 여기광이 시트 ^1,2로 형성되는 고해상도 형광 이미징 기술 제품군을 나타내며, 여기에는 SPIM(Selective Plane Illumination Microscopy), SCAPE(Swept Confocally-Aligned Planar Excitation) 및 OPM(Oblique-Plane Microscopy)^3,4,5,6,7이 포함됩니다. epi-fluorescence, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) 또는 confocal microscopy와 같은 다른 현미경 방식과 달리 LSFM에서는 광독성이 최소화되며 활발하게 이미징되는 샘플의 평면만 조명되기 때문에 더 긴 시간 척도에 걸쳐 샘플을 이미징할 수 있습니다 ^8,9,10. 따라서 LSFM 기법은 장기간에 걸쳐 3D 샘플을 이미징하는 데 매우 유용하며, 특히 컨포칼 현미경 기법을 사용하기에는 너무 두꺼운 샘플도 유용합니다. 이러한 이유로 LSFM은 2004년 최초 개발 이후 많은 생리학자, 발달 생물학자 및 신경과학자가 살아있는 제브라피시 및 초파리 배아와 같은 전체 유기체의 시각화를 위해 선택하는 이미징 기술이 되었습니다 3,4,6,11 . 지난 20년 동안 LSFM의 장점은 생체 내 및 시험관^{내 13,14,15,17} 모두에서 조직^11,12, 세포 및 세포 내 규모를 포함하여 점진적으로 더 작은 규모에서 구조와 역학을 시각화하는 데 활용되었습니다.

문헌에서 성공적인 사용 사례에 대한 보고에도 불구하고 상용 LSFM 시스템의 높은 비용(작성 당시 ~25만 달러)^18,19은 이 기술의 광범위한 사용을 방해합니다. DIY 빌드를 연구자에게 실현 가능한 대안으로 만들기 위해 오픈 액세스 노력인 OpenSPIM²²를 포함하여 여러 빌드 가이드 8,13,20,21이 게시되었습니다. 그러나 현재까지 광학 경험이 거의 없는 연구자들은 기존의 슬라이드 장착 샘플과 호환되지 않는 초기 LSFM 설계만 사용할 수 있습니다(그림 1A). 최근의 단일 대물렌즈, 광시트(SOLS) 구현은 여기와 검출 모두에 단일 대물렌즈를 사용하므로(그림 1C) 호환성 ^5,6,8,13,20과 관련된 한계를 극복했습니다. 그러나 SOLS 설계의 다양성에 대한 비용은 이미징을 위해 물체 평면을 카메라에 릴레이, 틸트 해제 및 이미지로 다시 이미지화하기 위한 두 가지 추가 대물렌즈가 필요하기 때문에 빌드의 복잡성이 크게 증가한다는 것입니다(그림 1D). 복잡한 SOLS 스타일 설정에 쉽게 액세스할 수 있도록 이 백서는 슬라이드 호환 SOLS 시스템의 설계, 구축, 정렬 프로세스 및 사용에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 이는 초급 광학 교육 과정만 알고 있는 연구자에게 유용합니다.

프로토콜 자체는 간결하지만 독자는 준비 단계에서 다른 리소스를 참조하여 디자인 또는 하드웨어 고려 사항의 특정 부분에 대해 자세히 알아보아야 합니다. 그러나 독자가 이 설계의 사양을 따르려는 경우 특정 광학 부품을 선택하는 방법을 이해할 필요가 없을 수 있습니다.

그림 1: 다양한 LSFM 구성의 특성. (A) 초기 LSFM 설계에서 공통적으로 사용되는 두 개의 직교 대물렌즈를 사용한 설정. 이 구성에서는 모세관 또는 겔 실린더를 사용하여 시료를 담는데, 이는 기존의 슬라이드 장착 기술과 호환되지 않습니다. (B) 다음을 보여주는 SOLS 광시트 설계의 개략도: (C) 샘플 평면(O1)에서 여기 및 방출 수집 모두에 사용되는 단일 대물렌즈; 이를 통해 기존 슬라이드를 상단에 장착할 수 있으며 (D) SOLS 방출 경로에 릴레이 대물렌즈 시스템을 장착할 수 있습니다. O2는 방출광을 수집하고 이미지를 확대합니다. O3는 카메라 센서에 올바른 기울기 각도로 평면을 이미지화합니다. 약어: LSFM = light-sheet fluorescence microscopy; SOLS = 단일 대물렌즈 광시트; O1-O3 = 목적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

1. 정렬 준비

1. 빌드를 시작하기 전에 필요한 문헌 검토를 수행하여 의도된 사용 사례(예: 이미징할 형광단, 필요한 이미징 볼륨, 해상도 요구 사항)를 명확하게 파악합니다. 특히, 아래의 대표 결과 섹션을 참조하여 여기에 설명된 정확한 설계를 따르는 것이 적절한지 여부를 결정하십시오. 이 경우 1.2단계로 건너뜁니다. 그렇지 않은 경우 Sheunglab SOLS 빌드 가이드²³에서 하드웨어 선택에 대한 제안 및 지침을 찾으십시오.
   참고: 사용자는 토론 섹션에서 이 특정 시스템의 사양에 대한 자세한 정보를 찾을 수 있습니다.
2. 재료 표에 자세히 설명된 대로 필요한 모든 광학, 광기계 및 전기 구성 요소를 수집합니다. 시스템을 수정하는 사용자의 경우 해당 부품을 모두 수집하십시오.
3. 그림 2A와 같이 정렬 레이저를 제작합니다. 전단 플레이트를 사용하여 보가 시준되었는지 확인합니다.
4. 그림 2B에 표시된 대로 이중 젖빛 유리 디스크 정렬 케이지를 구축합니다.
5. 형광 염료 코팅 테스트 샘플을 준비합니다.
   1. 동결건조 분말 0.2g에 증류수 1mL를 모두 용해될 때까지 서서히 첨가하여 포화 로다민 염료 용액을 만듭니다. 균질화하기 위한 소용돌이.
      알림: 이 솔루션은 빛에 민감합니다. 준비하는 동안 필요한 예방 조치는 없지만 용액을 준비한 후에는 어두운 곳에 보관해야 합니다.
      주의 : 로다민 분말을 취급할 때는 항상 장갑과 마스크를 착용하십시오.
   2. 테스트 슬라이드 중앙에 10μL를 피펫팅합니다.
   3. 액체 위에 22mm x 22mm 커버 유리를 놓고 형광 층이 최대한 얇아지도록 합니다.
   4. 투명한 매니큐어로 밀봉하십시오.
      참고: 이 샘플은 빛에 민감합니다. 샘플의 수명을 최대화하려면 슬라이드를 사용하지 않을 때 어두운 곳에 보관해야 합니다.
6. 3D 비드 샘플(겔에 내장된 1μm 비드)을 준비합니다.
   1. 양면 테이프를 사용하여 샘플 슬라이드에 4-5mm 너비의 수직 채널을 만들고 테이프 3겹 높이로 만듭니다.
   2. 슬라이드 중앙의 테이프 위에 22mm x 22mm 커버 유리를 놓습니다. 테이프와 커버 유리 사이가 잘 밀봉되도록 테이프로 감싼 부분을 세게 누릅니다.
   3. 면도날을 사용하여 여분의 테이프를 제거합니다.
   4. 점차적으로 gellan 실리콘껌 분말의 1개 g에 DI 물을 추가해서 포화된 gellan 실리콘껌 해결책의 125 mL를 준비하십시오. 이 용액은 실온에서 고체이고 65°C에서 액체입니다.
   5. 1mL의 젤란 검 용액을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 65 °C에 열판에 물의 콘테이너를 가열하고, gellan 실리콘껌이 눈에 띄게 점성이 있을 때까지 마이크로 분리기 관을 데우십시오.
   6. 10 μL의 1:1,000 희석액의 비드를 가열한 겔란 검 용액에 준비합니다.
   7. 가득 찰 때까지 용액을 챔버에 조심스럽게 피펫팅합니다. 이쑤시개를 사용하여 채널 양쪽에 소량의 에폭시를 두드려 구멍을 완전히 덮어 밀봉합니다. 적절한 밀봉을 위해 양쪽 끝을 육안으로 검사하여 에폭시가 채널의 각 끝에 약간 침투했는지 확인하십시오.

그림 2: 정렬 도구 사진 (A) 시준 정렬 레이저. AL1: 얼라인먼트 렌즈 1, −50mm; AL2: 얼라인먼트 렌즈 2, 100mm(B) 이중 반투명 유리 디스크 얼라인먼트 케이지. 약어: RMS CP = RMS 나사산 케이지 플레이트; SM1 CP = SM1 나사산 케이지 플레이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 여기 경로 정렬

1. 광학 테이블 표면의 현미경 레이아웃을 스케치합니다. 가능한 한 정확하게 모든 거리를 측정하십시오.
   주: 시스템 내의 구성요소 위치는 그림 3 을 참조하십시오.
2. 여기 레이저를 테이블에 장착합니다. 두 개의 홍채를 레이저의 의도된 높이로 설정하고 미러 2(M3) 위치 뒤의 원하는 구멍 라인에 1-1피트 간격으로 장착합니다. 이 조리개를 사용하여 빔이 테이블 표면과 수평을 이루고 광학 테이블의 구멍 라인 중앙에 오도록 합니다.
   알림: 눈 보호를 위해 레이저 보안경을 착용하고 안전 예방 조치로 레이저 안전 스크린으로 표유 레이저 빔을 차단하십시오. 모든 구성 요소가 영구적으로 클램핑될 때까지 몇 시간 정도의 드리프트가 가능합니다. 하루가 끝날 때 정렬의 가장 먼 지점에 조리개를 설정하여 빌드로 돌아갈 때 드리프트를 빠르게 시각적으로 확인합니다. 진동, 부적절하게 부동된 광학 테이블 및 기류는 광학 드리프트의 가장 일반적인 원인입니다.
3. 여기 레이저에 최대한 가깝게 레이저 셔터를 장착합니다. 이 셔터를 사용하면 레이저를 반복적으로 켜고 끄는 대신 정렬 중에 레이저 광을 빠르게 차단할 수 있습니다.
4. ND 필터를 ND 필터 휠(ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 및 빈 슬롯)에 조립하고 레이저 셔터 뒤에 장착합니다.
5. 전동 액츄에이터를 하나의 번역 스테이지(TS1)로 전환한 다음 스테이지를 M1 위치 아래에 삽입합니다. stage가 레이저 광이 따라가는 동일한 구멍 라인을 따라 축 방향으로 변환됩니다. 초기 배치를 위해 범위의 중간에 스테이지를 설정합니다.
   1. 다음 단계 2.6-2.10에서 반사 광학 부품을 빔 경로에 한 번에 하나씩 삽입하여 테이블에 그려진 경로를 따라 레이저를 향하게 합니다. 정확한 높이로 설정된 조리개 쌍을 사용하여 원하는 출구 빔 경로를 정의하고 각 반사 요소의 배치 및 정렬을 안내합니다. 각 요소에 대해 마운트의 높이와 위치를 조정하여 들어오는 빔이 중앙에 닿도록 합니다. 그런 다음 마운트의 베이스를 회전하여 테이블의 그려진 빔 경로를 따라 빔이 양쪽 조리개를 통과하도록 하고 각 마운트 뒷면의 손잡이로 나가는 빔의 기울기를 미세 조정합니다.
      알림: 각 요소를 올바른 높이에 정렬한 후 포스트에 슬립온 칼라를 추가하여 높이를 고정합니다.
6. TS1 위에 M1을 장착하고 정렬합니다.
7. 이색성을 테이블에 장착하고 정렬합니다.
8. 제조업체의 지침에 따라 갈보를 전원 공급 장치 및 함수 발생기에 연결합니다.
9. 레이저가 거울의 정확한 중앙에 입사되도록 갈보를 장착합니다. 갈보의 전원을 켠 다음 파형 발생기의 AM 버튼을 길게 눌러 미러 틸트를 0V DC 전류(범위 중심)로 설정합니다. 이제 갈보를 홍채에 맞춥니다.
10. 미러 2(M2)를 장착하고 정렬합니다.
11. 대형 원통형 거울을 원통형 거울 마운트에 삽입합니다. 케이지 로드의 1을 사용하여 미러 3(M30) 위에 60-3mm 케이지 어댑터를 부착합니다. 미러 마운트의 손잡이를 사용하여 초기 배치를 위해 M3 미러의 기울기를 평평하게 합니다.
12. 이중 반투명 유리 정렬 케이지를 M3 위의 케이지 어댑터에 장착합니다. 정렬을 위해 사용할 때마다 정렬 케이지를 제자리에 고정하는 케이지 어댑터의 고정 나사를 조이십시오. M3를 테이블에 장착하고 빔이 두 젖빛 유리 정렬 디스크의 대략 중앙에 올 때까지 높이와 위치를 조정합니다. Clamp M3를 테이블에 연결하고 포스트 마운트, 3인치 포스트, 90° 클램프 및 M2 양쪽에 3인치 포스트를 사용하여 미러 마운트 양쪽에 있는 테이프 구멍을 사용하여 지지대를 추가합니다. 거울 뒷면의 손잡이를 사용하여 빔을 미세 조정합니다.
    알림: 이제 여기 경로의 모든 반사 요소가 설정되었으며 만져서는 안 됩니다.
13. 렌즈 1(L1)을 테이블에 장착합니다. 모든 초기 렌즈 배치의 경우 나사식 렌즈 타겟을 사용하여 들어오는 빔을 렌즈 전면의 중앙에 맞춥니다. 빔이 M1 위의 정렬 케이지에 있는 젖빛 유리판 두 개의 중앙에 올 때까지 렌즈 3(L1)의 기울기 및 측면 위치를 조정합니다.
14. 렌즈 2(L2)를 해당 위치에 장착하여 L4가 있는 1f 시스템을 만듭니다. L2를 축 방향으로 이동하여 시준된 빔을 얻고 여기 레이저와 전단 플레이트를 사용하여 시준을 확인합니다. L2의 기울기와 측면 위치를 조정하여 M3 위의 젖빛 유리 디스크 모두에 빔을 중앙에 맞춥니다.
15. 핀홀을 xy 변환 마운트에 장착합니다. 1D 변환 스테이지 위에 장착하여 미세한 축 방향 변환을 제공합니다. 핀홀과 스테이지를 포스트 및 포스트 마운트에 장착하고 L1과 L2 사이의 공유 초점에 놓습니다. 핀홀을 통해 레이저 광선이 보일 때까지 손으로 핀홀을 조정합니다.
16. 핀홀 바로 뒤에 파워 미터 센서를 장착하고 파워 미터의 디지털 콘솔에 있는 파장 버튼을 사용하여 여기 레이저의 파장을 선택합니다. 핀홀의 xy 위치를 조정하여 투과율을 최대화하고 TEM00에 가까운 빔 프로파일을 얻습니다. 그런 다음 1D 스테이지로 핀홀을 축 방향으로 조정하여 투과율을 더욱 극대화합니다.
17. 렌즈 4(L4)를 제자리의 테이블에 장착하고 마운트를 올바른 높이로 조정합니다. 여기 빔이 갈보 표면에 초점을 맞추도록 L4를 축 방향으로 조정합니다. L4의 기울기와 측면 위치를 조정하여 M3 위의 젖빛 유리 디스크 모두에 빔을 중앙에 맞춥니다.
18. 렌즈 3(L3)을 제자리의 테이블에 장착하고 마운트를 올바른 높이로 조정합니다. 여기 레이저와 전단 플레이트를 사용하여 L3 및 L4의 시준을 확인합니다. L3의 기울기 및 측면 위치를 조정하여 M3 위의 젖빛 유리 디스크 모두에 빔을 중앙에 맞춥니다.
19. L3을 임시로 제거합니다. 스캔 렌즈 1(SL1)을 테이블에 장착하고 축 거리를 조정하여 전단판으로 측정한 대로 L4로 시준된 망원경을 형성합니다. SL1의 기울기와 측면 위치를 조정하여 M3 위의 젖빛 유리 디스크 모두에 빔을 중앙에 맞춥니다.
20. L3을 다시 삽입합니다. 튜브 렌즈 1(TL1)을 장착하고 여기 빔과 전단 플레이트를 사용하여 SL1 및 TL1을 시준합니다. TL1의 기울기와 측면 위치를 조정하여 빔을 M3 위의 젖빛 유리 디스크 양쪽 중앙에 맞춥니다.
21. 어댑터 링을 사용하여 목표 1(O1)을 M3 위의 케이지 플레이트에 나사로 고정합니다. SL1을 일시적으로 제거하고 빔이 천장에 닿도록 합니다. 빔이 천장에 Airy 디스크를 형성할 때까지 케이지 시스템에서 O1의 높이(축 거리)를 조정한 다음 디스크 크기가 최소화될 때까지 계속 조정합니다.
22. O1이 제자리에 있는 상태에서 샘플 스테이지를 적절한 위치에 장착합니다.

그림 3: SOLS 시스템 내 구성 요소의 위치. (A) 모든 구성 요소에 레이블이 지정된 SOLS 시스템의 개략도 레이아웃. (B) 광학 테이블에 있는 물리적 SOLS 시스템의 하향식 사진(샘플 스테이지 영역 제외). (C) 샘플 스테이지 영역의 하향식 사진( 그림 3B로 확장). 여기 경로는 녹색으로 표시됩니다. 방출 경로는 빨간색으로 표시됩니다. 렌즈의 초점 거리: L1: 100mm; L2: 45mm; CL1: 50mm; CL2: 200mm; CL3: 100mm; 길이 3 : 150 밀리미터; L4: 100mm; SL1: 75mm; TL1: 200mm; SL2: 150mm; TL2: 125mm; TL3: 200mm입니다. 자세한 부품 사양은 재료 표를 참조하십시오. 약어: SOLS = 단일 목표 라이트 시트; ND 휠 = 가변 중성 밀도 필터 휠; L1-L4 = plano concave achromat lenses; CL1-CL3 = 원통형 렌즈; M1-M3 = 거울; TS1-TS2 = 변환 단계; DM = 이색성 거울; Galvo = 스캐닝 검류계; SL1-SL2 = 스캔 렌즈; TL1-TL2 = 튜브 렌즈; O1-O3 = 목적; EF = 방출 필터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 방출 경로 정렬

1. 정렬 레이저를 설정합니다.
   1. 여기 레이저 옆에 레이저와 동일한 높이에 두 개의 빈 케이지 플레이트를 장착합니다. 이 케이지 플레이트를 사용하여 정렬 레이저의 케이지 로드를 두 케이지 플레이트의 빈 구멍에 밀어 넣어 정렬 레이저를 장착합니다. 전원 버튼 주위를 테이프로 감거나 켜기/끄기 스위치를 배선하여 레이저를 켜짐 위치로 설정할 수 있는지 확인합니다.
   2. O1을 제거하고 젖빛 유리 정렬 케이지를 다시 삽입합니다. 하나의 Kinematic mirror mount와 하나의 드롭다운 미러를 사용하여 정렬 빔을 여기 빔 경로에 정렬합니다.
   3. 파워 미터를 사용하여 두 개의 미러를 미세 조정하여 핀홀 이후의 정렬 빔 신호를 최대화합니다. 빔이 젖빛 유리 정렬 케이지의 중앙에 유지되는지 확인합니다.
2. 정렬 케이지를 제거하고 O1을 다시 삽입합니다. 사각 거울을 O1의 샘플 스테이지에 놓고 이색성 후 빔 프로파일의 크기가 최소화될 때까지 거울을 축 방향으로 조정합니다.
3. Scan Lens 2(SL2), Tube Lens 2(TL2) 및 Objective 2(O2)를 간섭 없이 삽입할 수 있도록 하나의 조리개를 방출 경로에 장착하고 충분히 뒤쪽에 장착합니다. 이 조리개를 정렬 레이저에 맞춥니다. 젖빛 유리 디스크를 조리개 뒤에 최소 1인치 이상 장착하고 이것도 레이저 광선에 맞춰져 있는지 확인합니다.
4. 눈금자로 갈보에서 측정 한 정확한 거리에 SL2를 삽입하십시오. 들어오는 정렬 빔이 SL2의 중앙에 있고 나가는 빔이 조리개와 젖빛 유리 디스크를 통과하도록 SL2의 기울기 및 측면 위치를 조정합니다.
5. 눈금자로 SL2에서 측정한 대로 TL2를 올바른 거리에 삽입합니다. 들어오는 정렬 빔이 TL2의 중앙에 있고 나가는 빔이 조리개 및 젖빛 유리 디스크를 통과하도록 TL2의 기울기 및 측면 위치를 조정합니다.
6. 테이블에 TS2를 장착합니다. 스테이지가 O2의 광축을 따라 변환되는지 확인합니다.
7. O2를 xy 변환 마운트에 나사로 고정합니다. xy 마운트 아래의 포스트를 연결하여 O2를 번역 스테이지에 장착합니다. 나사식 타겟을 사용하여 O2의 뒷면을 적색 레이저의 중앙에 맞춥니다.
8. 빨간색 정렬 빔이 조리개와 젖빛 유리 디스크를 통과하도록 O2의 xy 노브와 기울기를 조정합니다.
9. 정렬 레이저를 O1 이상으로 이동하고 방출 경로로 아래쪽으로 향하게 합니다. 레이저를 켜고 이 빔이 방출 경로의 모든 렌즈 중앙에 있는지 확인합니다.
10. 홍채를 열고 젖빛 유리 디스크를 제거하여 O1과 O2의 동공면을 접합하여 O2에서 나오는 정렬 빔이 멀리 떨어진 표면이나 벽(>0.5m)에 방해받지 않고 계속되도록 합니다(그림 4). 빔이 표면에 작은 Airy 디스크를 형성할 때까지 TS2를 조정한 다음 TS2를 계속 조정하여 Airy 디스크의 크기를 최소화합니다.
    알림: 강하게 발산하는 빔은 O2의 잘못된 배치를 나타냅니다. 그러나 이 빔은 두 개의 대물렌즈를 통과하기 때문에 약간의 발산이 내재되어 있습니다. 따라서 Airy 디스크가 최고의 가이드입니다.
11. 기울기 불변 스캔을 위해 갈보 최적화: 파형 발생기의 FSK 버튼을 눌러 갈보에 대한 삼각파 신호를 선택하고 저주파(~1Hz)로 설정합니다. 동일한 먼 표면이나 벽에서 정렬 빔을 관찰하십시오.
    알림: 갈보를 잘못 배치하면 빔이 갈보 운동과 함께 표면에서 수평으로 스윕됩니다. 이것은 빔 변위를 눈으로 감지할 수 없을 때까지 갈보 베이스의 기울기와 xy 위치를 미세 조정(손으로)하여 해결할 수 있습니다.
12. 0°에서 이미징하여 시스템 품질을 확인합니다.
    1. O3를 xy 변환 마운트에 나사로 고정합니다. 1인치 렌즈 튜브를 케이지 변환 스테이지에 나사로 고정하고 xy 변환 스테이지를 튜브에 나사로 고정합니다. 두 개의 케이지 로드를 사용하여 케이지 전면을 연결합니다.tage 케이지 플레이트에 연결하고 케이지 플레이트를 기둥에 장착합니다. 목표 3(O3)을 O2 전면(~4-5mm)에 가깝게 0°로 장착하고 높이를 일치하도록 조정합니다.
    2. 눈금자로 측정한 대로 SL2와 TL2 사이의 공유 초점면에 반투명 유리 정렬 디스크를 장착합니다. 아크릴 형광 테스트 슬라이드를 스테이지에 장착하고 여기 레이저로 슬라이드를 비춥니다. O3의 뒷면을 살펴보고 O3의 높이와 축 위치를 모두 조정하여 방출광을 찾은 다음 방출광이 후면 조리개를 채울 때까지 O3를 축 방향으로 조정합니다(그림 5).
    3. O3 번역 스테이지의 뒤쪽에 두 개의 8인치 케이지 로드를 나사로 고정합니다. 젖빛 유리 디스크가 장착된 케이지 플레이트를 막대에 밀어 넣은 다음 xy 마운트를 사용하여 O3를 미세 조정하여 방출광이 O3 중앙에서 나오도록 합니다. 그런 다음 케이지 로드를 제거합니다.
    4. 카메라 센서의 대략적인 위치에 반투명 유리 디스크를 장착하고 디스크의 높이와 위치를 방출광에 맞춥니다.
    5. 튜브 렌즈 3(TL3)을 케이지 플레이트에 나사로 고정하고 O3 바로 뒤에 장착합니다. TL3를 들어오는 방출 조명의 중앙에 놓은 다음 TL3의 기울기를 조정하여 나가는 빛을 젖빛 유리 디스크에 맞춥니다.
    6. 자로 측정한 대로 튜브 렌즈에서 올바른 거리에 카메라를 장착합니다.
    7. 2 in 렌즈 튜브와 방출 필터를 모두 카메라에 나사로 고정합니다.
    8. SL2와 TL2 사이의 공유 초점면에 젖빛 유리 정렬 디스크를 다시 장착합니다. 형광 염료 테스트 샘플을 장착하고 여기 빔으로 샘플을 비춥니다.
    9. 카메라를 켠 다음 연결된 컴퓨터에서 Micromanager 프로그램을 엽니다. 라이브 를 클릭하여 라이브 뷰로 들어갑니다. Auto Once(자동 한 번 )를 클릭하여 초기 노출 설정을 지정한 다음 이미징할 때 필요에 따라 노출을 재설정합니다.
       참고: Micromanager는 카메라를 켠 후 열지 않으면 제대로 작동하지 않습니다.
    10. 유리 정렬 디스크의 작은 구멍이 시야(FoV) 내 중앙에 올 때까지 O3 마운트의 xy 변환 노브를 조정합니다. 구멍에 초점이 맞춰질 때까지 케이지 변환 스테이지로 O3를 축 방향으로 조정합니다. 가장자리가 날카로워야 합니다(그림 6).
    11. 시스템의 품질을 확인하기 위해 형광 비드를 이미지화합니다.
        1. 젖빛 유리 정렬 디스크를 제거하고, 3D 비드 샘플을 장착하고, 여기 빔으로 샘플을 비춥니다.
        2. 형광 비드가 FoV 중앙의 원형 영역을 채울 때까지 O1을 기준으로 샘플의 높이를 조정합니다.
        3. 점 확산 함수(PSF)가 둥글고(최소 수차를 나타냄) 밝아질 때까지(신호 대 잡음비가 양호함을 나타냄) xy 스테이지와 축 방향 변환 스테이지를 사용하여 O3의 위치를 미세 조정합니다(그림 7). O3를 조정하여 이를 달성할 수 없는 경우 구성 요소 O1과 O2 사이의 광학 시스템이 최적이 아닌 상태로 정렬될 가능성이 높습니다. 아래 3.13단계의 진단 검사를 따르십시오.
        4. 둥근 PSF를 얻을 수 있는 경우 진단 단계를 건너뛰고 이미징 시스템 기울기로 이동합니다.
13. 필요한 경우 진단 검사를 수행합니다.
    참고: 양호한 PSF를 얻으면 나머지 진단 단계를 건너뛸 수 있습니다.
    1. 명시야(BF) 조명을 O1 위에 장착합니다. 포지티브 그리드 테스트 타겟을 정렬 미러와 동일한 축 높이의 샘플 스테이지에 장착합니다. 10μm 그리드를 중앙에 배치하고 BF 조명으로 그리드를 비춥니다.
    2. 카메라에서 격자를 이미지화하고 격자에 초점이 맞춰질 때까지 샘플을 변환합니다. 그리드 이미지를 사용하여 FoV의 필드가 평평한지 확인합니다. 그렇지 않으면 그리드가 왜곡되고 구부러진 것처럼 보입니다. 잘못된 그리드 이미지를 수정하려면 O3의 xyz 위치와 기울기를 조정한 다음 그에 따라 TL3와 카메라를 조정합니다.
       참고: 평평한 그리드를 얻을 수 있는 경우 3.12.10단계를 반복한 다음 이미징 시스템 기울이기로 이동합니다.
    3. SL2가 센서에 이미지의 초점을 맞출 수 있도록 정렬 카메라 또는 이미징 카메라를 올바른 거리에 설정합니다. 중간 평면에서 그리드 대상을 이미지화합니다(그림 8). 이 그리드도 비뚤어지면 구성 요소 O1과 SL2 사이의 광학 시스템이 최적이 아닌 상태로 정렬될 가능성이 높으므로 다시 검토해야 합니다. 진행하기 전에 필요에 따라 정렬을 최적화합니다.
       참고: 카메라가 SL2와 TL2 사이에 맞지 않으면 추가 미러를 사용하여 SL90 후 이미지를 2° 바운스하고 카메라에 맞춥니다.
    4. 중간 평면에서 PSF 확인: 그리드를 확인한 후 또 다른 좋은 진단 검사는 동일한 중간 평면에서 PSF를 확인하는 것입니다. 그림 7 과 유사하지만 배율이 다른 이 평면의 양호한 이미지(그림 9)는 SL2를 통한 정렬이 양호함을 나타냅니다.
       참고: 중간 평면에서 평평한 그리드와 둥근 PSF를 얻을 수 있는 경우 3.13.2단계를 반복한 다음 3.12.10단계를 반복한 다음 이미징 시스템 기울이기로 이동합니다.
14. O3 이미징 하위 시스템을 30°로 기울입니다.
    1. O3, TL3 및 카메라를 제거합니다.
    2. 테이블의 선을 가이드로 사용하여 O3의 광축에 O30°를 2°로 다시 삽입합니다.
    3. SL2와 TL2 사이의 공유 초점면에 반투명 유리 정렬 디스크를 장착합니다. 아크릴 형광 테스트 슬라이드를 스테이지에 장착하고 여기 레이저로 슬라이드를 비춥니다. 다시 한 번 O3의 뒷면을 살펴보고 O3의 높이와 축 위치를 모두 조정하여 30°에서 방출광을 찾은 다음 방출광이 후면 조리개를 채울 때까지 O3를 축 방향으로 조정합니다.
    4. SL2와 TL2 사이에서 젖빛 유리 정렬 디스크를 제거하여 더 강한 방출 신호를 얻습니다.
    5. O3 번역 스테이지의 뒤쪽에 두 개의 8인치 케이지 로드를 나사로 고정합니다. 젖빛 유리 디스크가 장착된 케이지 플레이트를 막대에 밀어 넣은 다음 xy 마운트를 사용하여 O3를 미세 조정하여 방출광이 O3 중앙에서 나오도록 합니다. 그런 다음 케이지 로드를 제거합니다.
    6. 카메라 센서의 대략적인 위치에 반투명 유리 디스크를 장착하고 디스크의 높이와 위치를 방출광에 맞춥니다.
    7. O3 바로 뒤에 TL3를 장착합니다. TL3를 들어오는 방출 조명의 중앙에 놓은 다음 TL3의 기울기를 조정하여 나가는 빛을 젖빛 유리 디스크에 맞춥니다.
    8. TL3 카메라 거리를 보다 정확하게 설정하려면 O3의 나사를 조심스럽게 풀고 TL3에 의해 카메라에 초점이 맞춰지도록 정렬 레이저를 장착합니다. 레이저 강도가 <1mW가 되도록 필요에 따라 ND 필터를 사용합니다. 카메라 라이브 뷰를 시작하고 TL3를 축 방향으로 조정하여 카메라의 레이저 스폿을 최소화합니다.
    9. SL2와 TL2 사이의 공유 초점면에 젖빛 유리 정렬 디스크를 다시 장착합니다. 형광 염료 테스트 샘플을 장착하고 여기 빔으로 샘플을 비춥니다. 유리 정렬 디스크의 작은 구멍이 카메라의 FoV 내에 올 때까지 O3 마운트의 xy 변환 노브를 조정합니다. 케이지 변환 조정 stage는 구멍에 초점이 맞춰질 때까지 O3를 축 방향으로 이동합니다. 구멍이 0°에서와 비슷하게 나타나는지 확인합니다.
    10. 포지티브 그리드 테스트 타겟을 동일한 축 높이에 다시 장착하고 BF 조명으로 그리드를 비춥니다. 하나의 수직 섹션에만 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다(30° 기울기로 인해). 다시 한 번 그리드 이미지를 사용하여 초점이 맞지 않는 경우에도 FoV의 필드가 평평한지 확인합니다. 슬라이드가 축 방향으로 변환될 때 FoV(그리드 대상)의 초점이 맞춰진 부분이 화면을 가로로 가로질러 스윕되고 그리드 사각형은 일정한 크기를 유지하는지 확인합니다(그림 10).
        참고: 샘플에서 이미징 평면의 기울기로 인해 그리드가 x-평면에서 약간 늘어난 것처럼 보일 수 있습니다.

그림 4: Laser-in-laser-out 기술. O1의 전면을 통해 시준된 테스트 빔을 보내고 멀리 떨어진 표면에서 O2를 빠져나가는 빔을 관찰합니다. 모든 구성 요소가 올바른 거리에 정렬되면 빔은 멀리 떨어진 표면에 작은 Airy 디스크를 형성합니다. 모든 약어는 그림 3과 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 정렬을 위해 방출 광을 활용합니다. (A) O2의 BFP 뒤에 있는 나사식 타겟의 아크릴 형광 슬라이드에서 방출되는 빛. (B) O3의 뒷면을 통해 시야로 방출광을 찾습니다. 약어: O2-O3 = 목적; BFP = 후면 초점면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 초점이 올바르게 맞춰진 반투명 유리 정렬 디스크의 카메라 이미지. 디스크는 SL2와 TL2 사이의 중간 평면에 배치되었습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: SL2 = 스캔 렌즈; TL2 = 튜브 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 3D 비드 샘플의 카메라 이미지. 이미지는 이미징 모듈이 0°로 설정되고 원통형 렌즈를 삽입하기 전에 원형 빔으로 조명된 1nm 비드를 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: SL2와 TL2 사이의 중간 평면에 올바르게 초점을 맞춘 포지티브 그리드 테스트 대상. 필드 전체의 평평한 그리드는 SL2 및 이전 구성 요소의 양호한 정렬을 나타냅니다. 눈금 막대 = 30μm. 약어: SL2 = 스캔 렌즈; TL2 = 튜브 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 3D 비드 샘플의 카메라 이미지. 이미지는 SL2와 TL2 사이의 중간 평면에 올바르게 초점을 맞춘 1nm 비드를 보여줍니다. 눈금 막대 = 30μm. 약어: SL2 = 스캔 렌즈; TL2 = 튜브 렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10: 그리드의 사각형과 일치하도록 일정한 크기의 노란색 사각형이 겹쳐진 포지티브 그리드 테스트 대상. (A) 왼쪽에 초점이 맞춰진 그리드. (B) 오른쪽에 초점이 맞춰진 그리드. 노란색 사각형은 FoV의 양쪽에 있는 그리드 상자의 크기와 일치합니다. 스케일 바 = 30 μm. 약어 = FoV = 시야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 비스듬한 라이트 시트 정렬

1. O1을 제거하고 이중 젖빛 유리 정렬 케이지를 제자리에 다시 삽입합니다. 빔이 시준되고 두 젖빛 유리 디스크의 중앙에 있는지 확인합니다.
2. 원통형 렌즈 1(CL1)을 회전식 렌즈 마운트에 나사로 고정합니다. CL1을 광학 경로에 장착하고 빔이 광학 테이블에 수직 방향으로 확장되도록 마운트를 회전합니다. 빔이 전면 중앙에 있고 두 젖빛 유리 디스크의 중앙 위치를 유지하도록 CL1의 기울기 및 측면 위치를 조정합니다.
3. 원통형 렌즈 2(CL2)를 회전 렌즈 마운트에 나사로 고정하고 CL2를 올바른 거리의 광학 경로에 장착하여 CL1과 함께 4f 시스템을 형성합니다. CL2를 CL1과 동일한 방향으로 회전시켜 빔이 광학 테이블에 수직 방향으로 늘어나고 시준되도록 합니다. 테스트 카드를 사용하여 여러 위치에서 원통형 보 프로파일의 높이를 측정하여 빔이 시준되었는지 확인합니다. 2단계에서 수행한 대로 CL4.2의 기울기 및 측면 위치를 조정합니다.
4. Cylindrical Lens 3 (CL3)을 회전식 렌즈 마운트에 나사로 고정하고 CL3을 올바른 거리의 광학 경로에 장착하여 L3이 있는 4f 시스템을 형성합니다. CL3을 CL1 및 CL2와 동일한 방향으로 회전하여 빔이 초점면에서 수평 시트 프로파일까지 초점을 맞추도록 합니다. 3단계에서 수행한 대로 CL4.2의 기울기 및 측면 위치를 조정합니다.
5. 슬릿 삽입: 4개의 4인치 케이지 로드와 CL3 케이지 마운트를 사용하여 자로 측정한 대로 CL3과 L3 사이의 초점면에서 수직 방향으로 슬릿을 장착합니다. 늘어난 여기 빔 프로파일을 사용하여 슬릿이 빔의 중심이 될 때까지 슬릿의 높이와 측면 위치를 조정합니다.
6. O1을 다시 삽입하고, 형광 염료 테스트 샘플을 장착하고, 여기 라이트 시트로 샘플을 비춥니다. 카메라 센서에서 0° 라이트 시트가 얇은 세로 시트로 나타나는지 확인합니다(그림 11A).
7. 형광 염료 테스트 샘플을 제거하고 O1을 깨끗이 닦습니다. 라이트 시트가 방해받지 않고 O1 위로 확장되도록 합니다. 전동식 평행 이동 스테이지 컨트롤을 사용하여 M1을 원통형 렌즈 쪽으로 이동시켜 광시트의 각도를 O1의 광축을 기준으로 약 60°로 설정합니다.
   참고: 광시트가 비슷하게 기울어진 이미징 평면에 정렬되도록 올바른 방향으로 기울어지는 것이 중요합니다(그림 12). 시스템이 이 특정 설계와 다르게 배치된 경우 기하학적 광선 추적을 통해 올바른 기울기 방향을 파악할 수 있습니다.
   참고: 참고로, M1을 슬릿 쪽으로 2.647mm 변환하면 이 설정에서 라이트 시트가 올바른 기울기로 설정됩니다.
8. 형광 염료 테스트 샘플을 다시 삽입하여 기울어진 시트를 이미지화합니다. 라이트 시트가 카메라에서 수직 빔 모양을 유지하지만 더 넓고 희미한지 확인합니다(그림 11B).
9. 형광 염료가 FoV 중앙과 화면 오른쪽 사이의 5가지 다른 깊이에서 라이트 시트에 의해 조명되도록 스테이지를 사용하여 샘플을 축 방향으로 변환합니다. 각 이미지를 저장합니다.
10. 피지에서 이미지를 엽니다. 각 이미지에 대해 [선 도구]를 선택하고 FOV의 중심에서 광원의 중심까지 수평선을 그립니다. 변위를 측정하려면 분석 | 선 의 길이를 보려면 측정합니다. 그런 다음 광시트의 변위를 표본 깊이의 함수로 플로팅하여 O1 위의 광시트 각도를 계산합니다.
11. M1을 약간 평행 이동합니다. 광시트의 각도가 O60의 광축에서 1°가 되어 이미징 평면의 각도와 일치할 때까지 4.9단계와 4.10단계를 반복합니다.

그림 11: 올바른 모양의 광시트로 비추는 형광 염료 테스트 샘플의 카메라 이미지. (A) 시트는 O1의 광축을 따라 똑바로 위로 90°, (B) 30°(O1의 광축에 대해 60°)로 기울어졌습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: O1 = 목적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12: O1의 이미징 평면에 맞추기 위한 광시트 기울기의 올바른 방향. 약어: O1-O3 = 대물렌즈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 이미징 및 데이터 수집을 위한 시스템 미세 조정

1. 3D 비드 슬라이드를 장착하고 비드가 카메라의 FoV를 채울 때까지 스테이지와 함께 샘플을 축 방향으로 변환합니다.
2. 수차를 최소화하고 이미지의 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해 xy 스테이지와 케이지 변환 스테이지를 사용하여 O3를 조정합니다(그림 13).
3. 수차를 최소화하고 이미지의 신호 대 노이즈 비율을 최적화하기 위해 O1의 보정환을 조정합니다.

그림 13: 올바른 모양의 광시트로 비추는 3D 비드 샘플(1μm 비드)의 카메라 이미지. (A) O1의 광축을 따라 똑바로 위로 90°로 시트하고 (B) O1의 광축을 향해 30°로 기울어집니다. 노란색 상자는 평평하고 일관되며 사용 가능하고(80μm x 80μm) 신뢰할 수 있는 데이터를 캡처할 수 있는 FoV 부분을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: O1 = 목적; FoV = 시야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 시스템의 배율 보정

1. 포지티브 그리드 테스트 타겟을 샘플 스테이지에 장착하고 명시야 조명으로 조명합니다.
2. 그리드 슬라이드를 스테이지와 함께 축 방향으로 이동하여 그리드 슬라이드에 초점을 맞춥니다. 격자의 중심에 초점을 맞춥니다.
3. 이미지를 캡처하고 저장한 다음 피지에서 엽니다.
4. 피지의 [선] 도구 와 측정 기능을 사용하여 두 격자선 사이의 거리를 픽셀 단위로 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 값을 알려진 거리(10μm)로 나누어 픽셀-미크론 보정을 결정합니다.
5. 측정된 픽셀 크기와 방정식 (1)을 사용하여 픽셀의 알려진 크기를 사용하여 시스템의 배율(M)을 계산합니다.
   (1)

7. 체적 스캔 획득

1. 샘플을 배치합니다.
   1. 카메라 미리보기, 갈보, 함수 발생기, 전원 공급 장치, 스테이지 및 여기 레이저를 켭니다.
   2. 샘플을 장착한 다음 함수 생성기의 FSK 버튼을 클릭하여 삼각파를 설정합니다. 샘플을 찾으려면 함수 생성기를 사용하여 400mV 피크-피크 진폭 ( 증폭 버튼 사용), 0 오프셋 ( 오프셋 버튼 사용) 및 200mHz 주파수를 설정합니다. Micromanager 창을 사용하여 100ms 노출 시간을 설정합니다.
   3. 샘플 평면에 도달할 때까지 z를 수동으로 스크롤합니다. 체적 스캔에 원하는 영역이 한 주기 동안 화면을 통과하도록 z 설정을 최적화합니다.
2. 스캔 매개변수를 선택합니다.
   1. 스캔 기간 동안 미리보기에 초점이 맞춰져 있는지 육안으로 확인하여 피크 대 피크 진폭이 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 스캔의 한쪽 끝에 가까워질수록 이미지 품질이 다른 쪽 끝보다 더 빨리 저하되는 경우 함수 생성기의 오프셋을 편집하여 스캔의 중심을 더 나은 영역으로 이동합니다.
   2. Micromanager 프로그램에서 노출 시간을 선택하고 Multi-D Acq.를 클릭하여 Multi-Dimensional Acquisition 창을 엽니다. 카운트 상자를 사용하여 프레임 수를 선택하면 총 획득 시간이 설정됩니다. 프레임 사이의 간격(프레임 속도)은 간격 상자에 더 긴 간격을 지정하지 않는 한 노출 시간에 의해 설정됩니다. 함수 생성기에서 주파수를 설정하여 삼각파 함수 주기의 절반(한 방향으로 선형 스캔)만큼 전체 볼륨 스캔을 생성합니다.
      참고: 프레임 속도와 주파수가 너무 낮으면 볼륨 스캔에 너무 적은 프레임이 수집되고 프레임 수가 낮으면 후처리 과정에서 눈에 띄는 아티팩트가 생성됩니다. 참고로 그림 13 은 스캔에서 ~100개의 프레임 으로 구성되었고, 그림 14 는 ~800개의 프레임으로 구성되었습니다. 파라미터를 선택할 때 샘플 자체를 고려하는 것도 중요합니다. 샘플이 충분히 여기되지만 포화되지 않도록 노출 시간이 설정되어 있는지 확인하십시오. 여기 레이저 강도도 이를 위해 조정할 수 있습니다. 사용자가 시간에 따라 변하는 프로세스를 3D로 특성화하기 위해 일련의 체적 스캔을 획득하는 경우 스캐닝 날짜 표시줄이 시스템의 시간 표시줄 역학을 초과하는지 확인하십시오.
3. 비디오 수집: 볼륨의 전체 스캔 1회에 해당하는 삼각형 웨이브의 전체 램프 업 또는 램프 다운의 지속 시간 이상을 캡처하는 타임랩스를 획득합니다.

8. 사후 처리 절차

1. 체적 이미지 스택 기울이기
   1. 볼륨 스캔의 기울기를 보정하여 기울어진 평면의 이미지 스택을 실제 xyz 좌표의 일련의 이미지로 변환합니다.
      참고: 광시트 이미지 후처리 및 오픈 소스 소프트웨어에 대한 많은 훌륭한 가이드가 존재하며, 이는 기존 볼륨 스캔의 지연보정을 수행할 뿐만 아니라 지연보정을 수행하고 획득 중에 기울기 보정된 이미지를 저장하는 것입니다²⁴.
   2. 볼륨 스캔을 기울게 하려면 두 프레임 사이의 실제 거리(픽셀(d))와 프레임 평면과 x-y 평면 사이의 각도(θ는 경사 광시트의 각도(이 시스템에서는 30°)로 설정됨)의 두 가지 매개변수를 얻습니다. 프레임 사이의 거리는 이미징 광학 장치와 획득 설정에 따라 달라집니다.
2. d 매개 변수 찾기
   1. 시스템이 실질적으로 재정렬될 때마다 프레임 사이의 거리를 보정합니다. 형광 비드 이미지 스택으로 이 보정을 수행하면 문제 진단에 가장 쉽게 사용할 수 있습니다.
   2. 영상 스택을 획득하고 d 파라미터에 대한 초기 추측값을 사용하여 지연시간 보정 코드를 실행합니다. ImageJ에서 기울기 보정된 이미지 스택을 열고 스택을 스크롤합니다. d 가 실제 값에서 크게 떨어진 경우 x 또는 y에서 비드가 인위적으로 길어지고 사용자가 z의 프레임을 스크롤할 때 개별 비드가 xy 평면에서 이동하는 것처럼 보입니다(동일한 중심점에서 초점을 맞추고 초점을 흐리지 않음). 이러한 문제가 더 이상 명백하지 않을 때까지 d 매개 변수를 여러 번 반복합니다.
   3. d 파라미터가 true 값에 상당히 가까운 것으로 보이면 x 방향과 y 방향을 따라 영상 스택의 최대 강도 투영을 계산합니다. 회절 한계 근처의 직경을 가진 비드는 z에서 길쭉하게 보일 수 있지만 이상적으로는 원뿔형으로 보이거나 대각선으로 길쭉해서는 안 됩니다. 이러한 기준이 새로운 반복으로 크게 개선되지 않을 때까지 지연시간 보정 파라미터를 미세 조정합니다. 참고로, 도 13에 도시된 데이터는 d=2.50 픽셀에서 어큐되었고, 도 14의 데이터는 d=1.0 픽셀에서 어큐를 취하였다.
      참고: 프레임 사이의 거리는 스캔 진폭, 주파수 및 프레임 속도에 따라 선형적으로 달라집니다.

Results

우리는 gellan 검에서 끼워넣어진 1개 μm 구슬의 부피 측정 검사를 실행했습니다. 그림 14 는 x, y, z 방향에 따른 기울기 보정 체적 스캔의 최대 강도 투영을 보여줍니다.

그림 14: 겔란 검에서 1μm 형광 비드의 체적 이미징. 기울기 보정된 체적 스캔의 최대 강도 투영이 표시됩니다. 스케일 바 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 단일 대물렌즈 광시트 현미경을 사용하여 미세소관 과꽃 샘플의 체적 스캔을 수행하여 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 방법을 시연했습니다. 간단히 말해서, 로다민-표지된, 탁솔-안정화된 미세소관은 GTP에 의해 재구성된 이량체로부터 중합되었다; 그런 다음 중합 후 스트렙타비딘 기반 키네신 모터 클러스터를 ATP와 함께 샘플에 혼합하여 6μM 미세소관, 0.5μM 키네신 이량체 및 10mM ATP의 최종 농도를 높였습니다. 탁솔-안정화된 미세소관 및 키네신 운동 클러스터의 제조를 위한 광범위한 프로토콜 및 가이드는 Mitchson Lab 및 Dogic Lab 웹사이트^25,26에서 찾을 수 있습니다. 샘플을 현미경 슬라이드에 부드럽게 피펫으로 넣고 밀봉한 다음 이미징하기 전에 8시간 동안 그대로 두어 운동 활동이 중지되도록 하여 샘플이 과꽃과 유사한 안정적인 구조 상태에 도달하도록 했습니다.

재구성된 세포골격 시스템에 대한 연구는 이미지 라벨링 필라멘트에 컨포칼 또는 에피형광 현미경을 가장 자주 사용합니다. 그러나, 이들 두 기술 모두 조밀한 3D 샘플을 이미지화하는 능력에 있어서 제한된다⁽²⁷). 샘플을 준^{2D 28,29}로 제한함으로써 체외 세포골격 기반 활성 물질 연구에서 많은 진전이 이루어졌지만, 세포골격 네트워크는 본질적으로 3D이며, 3D 샘플에서만 발생할 수 있는 효과를 이해하는 데 현재의 많은 노력이 놓여 있습니다(^29,30), 따라서 고해상도 3D 이미징의 필요성이 대두되고 있습니다.

그림 15: 단일 대물렌즈 광시트 현미경을 통한 재구성된 세포골격 샘플의 3D 시각화 촉진. (A) Leica DMi8 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 획득한 형광 미세소관 과꽃의 이미지. 이미지는 z-스캔의 다른 평면을 보여줍니다. 스케일 바 = 30 μm. (B) 동일한 샘플의 단일 대물렌즈 광시트 설정에서 수행된 체적 스캔에서 디컨볼루션된 기울기 보정 이미지. 눈금 막대 = 30μm. 여기서 기울기 보정된 이미지 영역은 그림 13B에 표시된 사용 가능한 FoV(노란색 상자)에 해당합니다. 공초점은 커버슬립 근처의 단일 평면을 이미징하는 데 탁월하지만, 형광 샘플의 밀도는 이미징 평면 아래에서 오는 추가 신호로 인해 더 높은 평면에서 이미징할 때 복잡성을 유발합니다. 광시트는 이미징 평면만 비추어 이 문제를 피하므로 z의 다른 평면에서 균일하게 선명한 이미징을 허용합니다. 약어: SOLS = 단일 목표 라이트 시트; FoV = 시야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 15에서는 키네신 운동 클러스터에 의해 과꽃과 같은 구조로 수축된 재구성된 미세소관 네트워크의 체적 이미징을 보여줍니다. 이전 연구^28,31에서 볼 수 있듯이 이러한 3D 구조는 중앙으로 갈수록 조밀해지는 경향이 있어 신호에서 우세한 밝은 형광 영역이 생성됩니다. 커버슬립(낮은 z 레벨) 근처의 이미징 평면에서 컨포칼 현미경(그림 15A)은 과꽃 주변부의 단일 필라멘트를 분해할 수 있으며, 위쪽의 초점이 맞지 않는 형광 신호로 인해 중앙을 향한 추가 배경을 확인할 수 있습니다. 그러나 z에서 몇 미크론을 움직이면 과꽃의 초점이 맞지 않는 조밀한 부분이 이미징 평면의 신호에서 우세하기 때문에 이미지 품질이 빠르게 저하됩니다. 광시트의 단면 조명(그림 15B)은 이미징 평면 위와 아래의 과꽃의 조밀한 부분에서 초점이 맞지 않는 신호를 제거하여 평면 간에 유사한 이미지 품질을 허용합니다. 고품질의 신뢰할 수 있는 체적 스캔 데이터를 생성하는 광시트의 기능은 재구성된 세포골격 시스템에서 3D 현상을 시각화하고 특성화할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

Discussion

이 프로토콜과 관련된 두 가지 중요한 세부 사항은 시스템의 전체 비용과 예상 빌드 및 정렬 시간입니다. 정확한 비용은 가변적이지만 이 SOLS 또는 유사한 DIY 시스템의 토토 비용은 $85,000 USD 범위에 속할 것이라고 편안하게 추정할 수 있습니다. 이 견적은 모든 구성 요소의 소매 가격을 고려하므로 중고 구성 요소를 소싱하면 이 전체 가격이 크게 낮아질 수 있습니다. 구축 시간 측면에서 광학 경험이 거의 없는 사용자가 모든 구성 요소를 사용할 수 있고 준비된 경우 1-2개월 이내에 이 전체 SOLS 시스템을 구축하고 정렬할 것으로 예상하는 것이 합리적입니다. 프로토콜의 길이와 복잡성에도 불구하고, 우리는 비디오 프로토콜과 짝을 이루는 서면 원고의 세부 사항의 양이 이 프로토콜을 간단하고 빠르게 따라갈 수 있도록 해야 한다고 믿습니다.

이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 갈보의 배치는 3개의 개별 4f 렌즈 쌍의 일부이므로 많은 렌즈의 배치를 결정합니다. 갈보가 O1 및 O2의 후면 초점면과 결합되고 기울기 불변 스캔을 보장하기 위해 올바르게 중앙에 위치하는 것이 중요합니다. 둘째, 이미지 품질은 서로에 대한 O2와 O3의 정렬에 매우 민감합니다. 여기서 먼저 O3 대 O2의 정렬 각도가 여기 광시트의 기울기와 일치하여 유사하게 기울어진 FoV에서 최대한 평평한 조명을 제공하도록 주의를 기울여야 합니다. 둘째, O3는 가능한 한 큰 면적의 평평한 FoV를 유지하기 위해 올바른 축 거리에 배치되어야 합니다. 셋째, O3는 O2-O2 인터페이스를 통과하는 신호를 최대화하기 위해 O3에서 올바른 측면 거리에 배치되어야 합니다.

사용 가능한 FoV 측면에서 이 시스템은 80μm x 80μm 영역에서 일관된 조명으로 평평하고 안정적인 필드를 달성했습니다. 이 영역은 카메라에서 제공하는 최대 FoV보다 작기 때문에 사용 가능한 FoV는 그림 13의 노란색 상자로 표시됩니다. 분해능 측면에서 이 시스템은 x축을 따라 432nm, y축을 따라 421nm의 최소 분해능 거리를 달성했으며, 이는 양호한 FoV에서 가우스 피팅 대 점 확산 함수(PSF)의 평균 시그마 x 및 y를 찾고 2를 곱하여 측정되었습니다. 이 시스템은 총 NA 측면에서 최적화되지 않았으며, 이는 사용자가 이 시스템이 달성한 것보다 더 높은 분해능을 원할 경우 상당한 개선의 여지가 있음을 의미합니다. 이러한 유형의 SOLS 빌드에는 호환 가능한 대물렌즈 옵션이 많이 있으며, 그 중 다수는 더 높은 시스템 해상도에 기여하지만 릴레이 인터페이스 8,11,13,20에서 더 높은 비용, 더 작은 FoV 또는 더 복잡한 정렬 기술의 단점이 있습니다. 이와는 별도로, 사용자가 더 큰 FoV를 원하는 경우, 2D 스캐닝을 허용하기 위해 두 번째 갈보를 통합하면 이러한 목표를 달성할 수 있지만, 추가적인 광학 및 제어 메카니즘이 설계⁽³²)에 통합될 것을 요구할 것이다. 우리는 디자인 프로세스²³에 관한 다른 유용한 리소스에 대한 링크와 함께 웹 사이트 페이지에서 시스템 수정에 대한 자세한 내용을 제공했습니다.

이 특정 설계에 대한 특정 구성 요소를 개선하는 것 외에도 이 빌드에 다른 고해상도 현미경 기술이나 양식을 추가하는 것이 매우 실현 가능할 것입니다. 이러한 개선 사항 중 하나는 다중 파장 조명을 통합하는 것인데, 이는 추가 여기 레이저를 원래의 여기 경로⁸에 정렬하는 것을 포함합니다. 또한 이러한 유형의 SOLS 설계는 샘플에 접근할 수 있기 때문에 광학 핀셋, 미세유체역학 및 유변 물성 측정을 포함하되 이에 국한되지 않는 추가 기능을 현미경에 추가하는 것은 비교적 간단합니다 ^2,33.

지금까지 공개된 수많은 라이트 시트 가이드와 비교했을 때, 이 프로토콜은 광학 경험이 많지 않은 사용자도 도움이 될 수 있는 수준의 지침을 제공합니다. 기존의 시료 슬라이드 장착 기능을 갖춘 사용자 친화적인 SOLS 빌드를 더 많은 청중이 이용할 수 있도록 함으로써 장비가 활용되었거나 활용될 수 있는 모든 분야에서 SOLS 기반 연구의 응용 분야를 더욱 확장할 수 있기를 바랍니다. SOLS 기기의 응용 분야가 ^2,34,35 번으로 빠르게 성장하고 있음에도 불구하고 SOLS 유형 기기의 많은 이점과 활용이 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있다고 생각하며 이러한 유형의 기기가 앞으로 나아갈 가능성에 대한 흥분을 표현합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" 플라노-오목렌즈 f = -50 mm	Thorlabs	LC1715-A-ML	정렬 레이저 예상 비용: $49.5
1" 무채색 이중선 f = 100 mm (x3)	Thorlabs	AC254-100-A-ML	L2, L4 및 정렬 레이저 예상 비용: $342.42
1" 무채색 이중선 f = 125 mm	Thorlabs	AC254-125-A-ML	SL2 예상 비용: $114.14
1" 무채색 이중선 f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	L3 예상 비용: $114.14
1" 무채색 이중항 f = 150mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	TL2 예상 비용: $114.14
1" 무채색 이중선 f = 45mm	Thorlabs	AC254-045-A-ML	L1 예상 비용: $114.14
1" 무채색 이중선 f = 75mm	Thorlabs	AC254-075-A-ML	SL1 예상 비용: $114.14
1" 원통형 렌즈 f = 100mm	Thorlabs	LJ1567RM	CL3 예상 비용: $117.62
1" 원통형 렌즈 f = 200mm	Thorlabs	LJ1653RM	CL2 예상 비용: $111.22
1" 원통형 렌즈 f = 50mm	Thorlabs	LJ1695RM	CL1 예상 비용: $117.62
1" 장착 핀홀, 30 &마이크로; m 핀홀 직경	Thorlabs	P30K	예상 비용: $77.08
1" 실버 미러(x3)	Thorlabs	PF10-03-P01	M1, M2, 정렬용 1개 예상 비용: $168.78
2" 타원형 미러	Thorlabs	PFE20-P01	M3 예상 비용: $179.98
2" 포스트 홀더(x11)	Thorlabs	PH2	맞춤형 레이저 마운트, ND 휠, 안전 스크린 예상 비용: $98.45
2" 게시물 (x47)	Thorlabs	TR2	맞춤형 레이저 마운트 및 광학 부품 예상 비용: $277.3
3" 게시물 (x4)	쏘랩스	TR3	M3 지지대 및 기타 마운트용 예상 비용: $24.6
3" 포스트 홀더 (x4)	Thorlabs	PH3	예상 비용: $38.48
30에서 60mm 케이지 어댑터	Thorlabs	LCP33	O1 장착 예상 비용: $45.42
30mm 케이지 필터 휠	Thorlabs	CFW6	ND 필터 장착 예상 비용: $172.36
30mm 케이지 플레이트(x6)	Thorlabs	CP33	정렬 케이지 및 정렬 레이저 구축 예상 비용: $114.54
30mm 직각 키네마틱 미러 마운트(x3)	Thorlabs	KCB1	M1 및 M2 장착 및 정렬 레이저 예상 비용: $463.95
4" 포스트 홀더 (x30)	Thorlabs	PH4	예상 비용: $320.1
561 nm 레이저 및 전원 공급 장치	Opto Engine LLC	MGL-FN-561-100mW	여기 레이저 예상 비용: $6000
60mm 케이지 플레이트(x2)	Thorlabs	LCP01	TL1 및 M3 마운트 장착 예상 비용: $88.52
60mm 직각 키네마틱 미러 마운트	Thorlabs	KCB2	M3 장착 예상 비용: $187.26
90° 플립 마운트	Thorlabs	TRF90	정렬 레이저 예상 비용:
외부 C-마운트 스레드와 내부 SM1 스레드가 있는	Thorlabs	SM1A9	렌즈 튜브를 카메라에 연결하려면 예상 비용:
외부 SM1 나사와 내부 C-마운트 나사가 있는	Thorlabs	SM1A10	튜브 렌즈를 렌즈 마운트에 연결하려면 예상 비용:
외부 SM1 스레드 및 내부 M25 스레드가 있는 어댑터 (x2)	Thorlabs	SM1A12	O1 및 O2를 장착하려면 예상 비용:
외부 SM1 스레드 및 내부 M26 스레드가 있는 어댑터	Thorlabs	SM1A27	O3 장착하기 위해 예상 비용: $22.38
정렬 디스크	Thorlabs	SM1A7	예상 비용: $20.45
정렬 레이저	BISKEE		https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM 예상 비용: $16.98
자동 조명 플라스틱 슬라이드, 빨간색	Chroma	92001	예상 비용: $20
빔 셔터	쏘랩스	SM1SH1	레이저 광선을 차단하려면 예상 비용: $65.8
케이지 회전 마운트 (x3)	Thorlabs	CRM1T	CL1-3 를 장착하기 위해 예상 비용: $282.15
케이지 시스템 로드 1" (x8)	Thorlabs	ER1	M3 및 O1 장착하기 위해 예상 비용: $44.8
케이지 시스템 로드 3" (x2)	Thorlabs	ER3	O3 장착하기 위해 예상 비용: $14.28
케이지 시스템 막대 4" (x4)	Thorlabs	ER4	슬릿 장착 예상 비용: $30.76
케이지 시스템 로드 8" (x2)	Thorlabs	ER8	튜브 렌즈 정렬 예상 비용: $25.3
케이지 시스템 로드 12"(x8)	Thorlabs	ER12	정렬 케이지 예상 비용: $145.36
카메라	Andor	Zyla 4.2 sCMOS	예상 비용: ~$14,000
클램핑 포크(x35)	Thorlabs	CF125	포스트 마운트를 고정하려면 예상 비용: $338.8
커버 유리, 22 x 22mm	Corning	2850-22	슬라이드 샘플 예상 비용: $265
Dichroic	AVR	DI01-R405/488/561/635-25x36	절제/방출 경로 분할 예상 비용: $965
Dovetail Translation Stage	Thorlabs	DT12	핀홀을 번역하려면 예상 비용: $90.55
방출 필터	Thorlabs	FELHO600	예상 비용: $140.99
젖빛 유리 정렬 디스크(x2)	Thorlabs	DG10-1500-H1	정렬 케이지 및 중간 평면의 경우 예상 비용 : $ 75.14
함수 생성기	Hewlett-Packard	HP 33120A 15 MHz	galvo 를 제어하려면 예상 비용 : $ 900
검류계 - 1D 대형 빔 직경 시스템	Thorlabs	GVS011	예상 비용 : $ 1715.78
검류계 전원 공급 장치	Siglent	SPD3303C	예상 비용 : $ 300
Gelrite	Research Products International	G35020-100.0	Gellan 껌 3D 비드 샘플 예상 비용: $68.25
FIJI 소프트웨어	오픈 소스		다운로드 https://imagej.net/software/fiji/downloads 예상 비용: 무료
핫 플레이트/교반기	Corning	6795-220	샘플 솔루션 준비용 예상 비용: $550
K-Cube 브러시 모터 컨트롤러	Thorlabs	KDC101	드라이브 Z825B 예상 비용: $757.51
Kinematic Mount	Thorlabs	KM100S	이색성 마운트 예상 비용: $92.01
Kinesis Software	Thorlabs		https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 에서 다운로드 예상 비용: 무료
레이저 광 차단제	쏘랩스	LB1	ND 필터 반사용 예상 비용: $57.65
레이저 마운트	맞춤 제작		3D 프린트 예상 비용: N/A
레이저 안전 스크린 (x2)	Thorlabs	TPS4	미용 레이저 광 차단 예상 비용: $92.02
레이저 스캐닝 튜브 렌즈	Thorlabs	TTL200MP	TL1 예상 비용: $1491
렌즈 마운트(x10)	Thorlabs	LMR1	모든 렌즈 및 추가 정렬 미러를 장착합니다. 예상 비용: $164.7
마그네틱 룰	Thorlabs	BHM4	정렬을 확인하려면 예상 비용: $52.74
마이크로 매니저 소프트웨어	오픈 소스		다운로드 https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 예상 비용: 무료
현미경 슬라이드	Thermo Fisher Scientific	12550400	슬라이드 샘플 예상 비용: $123.9
현미경 스테이지	ASI	FTP-2000 사용자 정의 부품	샘플 세부 번역을 위해 예상 비용: ~$16,000
Mini Vortex Mixer	VWR	10153-688	샘플 준비용 예상 비용: $152.64
모터화된 액추에이터	Thorlabs	Z825B	M1 를 미세 번역하려면 예상 비용: $729.07
장착된 표준 Iris (x2)	Thorlabs	ID20	정렬을 위해 최소 2개 예상 비용: $118.02
ND 필터 세트	쏘랩스	NDK01	여기 강도를 줄이려면 예상 비용: $726.73
대물 렌즈 1	Nikon	계획 Apo 60X/ 1.20 WI	O1 예상 비용: ~$15,000
대물 렌즈 2	Nikon	TU 계획 Fluor 100X/0.90	O2 예상 비용: ~$6,000
대물 렌즈 3	Mitutoyo	Plan Apo HR 50X/0.75	O3 예상 비용: ~$6,800
OPM 왜곡 보정 소프트웨어	오픈 소스		이미지 처리용. 에서 다운로드 https://github.com/QI2lab/OPM 예상 비용: 무료
포토다이오드 파워 센서	Thorlabs	S121C	레이저 강도 측정용 예상 비용: $379.68
포지티브 그리드 왜곡 타겟	Thorlabs	R1L3S3P	Brightfield 정렬 예상 비용: $267.87
파워 미터 디지털 콘솔	Thorlabs	PM100D	레이저 강도 측정용 예상 비용: $1245.48
Rhodamine 6G	Thermo Scientific	J62315.14	형광 코팅 슬라이드 샘플 예상 비용: $27.7
용 직각 클램프		RA90	M3 지원 및 플립 다운 미러 예상 비용: $32.46
RMS 스레드 케이지 플레이트(x2)	쏘랩스	CP42	정렬 레이저 예상 비용: $70.56
전단 플레이트 2.5-5.0 mm	Thorlabs	SI050P	예상 비용: $182.85
전단 플레이트 5.0-10.0 mm	Thorlabs	SI100P	예상 비용 : $ 201.47
전단 플레이트 10.0-25.4 mm	Thorlabs	SI254P	예상 비용 : $ 236.42
전단 플레이트 보기 화면	Thorlabs	SIVS	예상 비용 : $ 337.74
1-3 mm 플레이트	Thorlabs	SI035	시준 확인 예상 비용 : $ 465.85
슬립온 포스트 칼라 (x35)	Thorlabs	R2	포스트 높이를 유지하기 위해 예상 비용: $208.25
Slit	Thorlabs	VA100	예상 비용: $294.64
슬롯 렌즈 튜브, 3"	Thorlabs	SM1L30C	정렬 레이저의 경우 예상 비용: $77.45
정사각형 거울, 1 x 1"			https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 예상 비용: $14.76
스택형 렌즈 튜브 1/2"(x3)	Thorlabs	SM1L05	CL1-3 장착 예상 비용: $40.86
스택형 렌즈 튜브 1"	Thorlabs	SM1L10	O3 장착 예상 비용: $15.41
스택형 렌즈 튜브 2"(x2)	Thorlabs	SM1L20	카메라 경로 예상 비용: $35.7
스터드 페디스탈 베이스 어댑터 (x37)	Thorlabs	BE1	포스트 마운트를 테이블에 부착하려면 예상 비용: $400.71
렌즈 마운트(x3)	Thorlabs	LM1XY	핀홀, O2 및 O3 를 미세 번역하려면 예상 비용:
표준 마이크로미터(x2)를 사용한 번역 스테이지	Thorlabs	PT1/M	TS1-2 예상 비용: $647.54
여행 매뉴얼 번역 스테이지	Thorlabs	CT1A	O3 케이지 번역 마운트 예상 비용: $497.3
튜브 렌즈	니콘	MXA20696	TL3 예상 비용: $359
흰색 장착 LED	Thorlabs	MNWHL4	명시야 광원 예상 비용: $171.28
			총 예상 비용: $84,858.98
			저자는 많은 부품이 중고로 구입되었다고 지적합니다. 여기에서는 모든 품목의 소매 가격을 반영하려고 시도했으므로 중고 품목, 특히 더 비싼 품목을 구입하여 총 비용을 크게 줄일 수 있습니다.
선택적 구성 요소
: Grasshopper3 USB3	FLIR	GS3-U3-23S6C-C	정렬 중 진단 검사용. Acquisiton 카메라를 대신 사용할 수 있지만 나중에 재정렬해야 합니다. 예상 비용: $1089