이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 다양한 악성 및 비악성 질환 치료를 위한 유망한 면역 치료 접근법을 나타냅니다. CAR-T 세포는 세포 표면 표적을 인식하고 결합하여 표적 세포를 죽이는 키메라 단백질을 발현하는 유전자 변형 T 세포입니다. 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 오염 위험이 있을 수 있습니다. 자동화된 세포 프로세서인 CliniMACS Prodigy를 사용하면 폐쇄형 시스템에서 임상 규모로 세포 치료제를 제조할 수 있어 오염 위험을 최소화할 수 있습니다. 처리는 컴퓨터의 제어 하에 반자동으로 이루어지므로 프로세스에 대한 사람의 개입을 최소화하여 시간을 절약하고 변동성과 오류를 줄입니다.
이 원고와 비디오는 이 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하기 위한 T 세포 형질도입(TCT) 공정에 대해 설명합니다. TCT 과정에는 CD4+/CD8+ T 세포 농축, 활성화, 바이러스 벡터를 사용한 transduction, 확장 및 수확이 포함됩니다. 이러한 단계의 순서와 타이밍을 허용하는 기능인 활동 매트릭스를 사용하여 TCT 프로세스를 광범위하게 사용자 지정할 수 있습니다. 당사는 현행 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하는 CAR-T 세포 제조에 대한 실무를 제공하고 임상시험용 신약(IND) 신청을 지원하는 필수 방출 테스트 및 전임상 실험에 대해 논의합니다. 임상 CAR-T 세포 제조를 위한 반자동 공정 사용의 타당성을 입증하고 장단점에 대해 논의합니다. 마지막으로, 소아 B세포 악성종양[NCT05480449]을 표적으로 하는 연구자 주도 임상시험을 이 제조 공정이 임상 환경에서 어떻게 적용될 수 있는지에 대한 예시로 설명합니다.
서론
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 입양 이식은 난치성 B 세포 악성 종양 1,2,3,4,5 환자를 치료하는 데 놀라운 효능을 보여주었습니다. 그러나 CAR-T 세포의 전통적인 제조 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 고도로 전문화된 단계를 수행하기 위해 고도로 훈련된 기술자가 필요합니다. 예를 들어, 자가 CAR-T 세포 제품의 기존 제조 공정에는 밀도 구배 원심분리, T 세포를 농축하기 위한 용출 또는 자기 분리, 멸균 플라스크에서 바이러스 벡터를 사용한 활성화 및 형질도입, 수확 및 제형 전에 바이오리액터에서의 팽창이 포함됩니다. 최근 이 프로세스를 부분적으로 자동화하는 것을 목표로 하는 다양한 시스템이 등장했습니다. 예를 들어, Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하, "프로세서"라 칭함)는 자동화된 방식으로 이러한 단계들 중 많은 것을 수행할 수 있는 자동화된 세포 처리 장치이다(6,7,8,9). 전통적이고 자동화된 CAR-T 제조 방법에 대한 심층적인 논의는 최근 리뷰 기사10에 제시되어 있습니다.
이 프로세서는 조혈 전구 세포 처리를 위한 미국 식품의약국(FDA) 승인 의료 기기인 CliniMACS Plus의 기능을 기반으로 합니다. 이 프로세서에는 세포의 자동 세척, 분획 및 배양이 가능한 세포 배양 장치가 포함되어 있습니다(그림 1). T 세포 형질도입(TCT) 공정은 수동 CAR-T 세포 제조를 대부분 복제하는 프로세서 장치 내의 사전 설정 프로그램입니다. TCT를 사용하면 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 사용자 정의 가능한 셀 처리가 가능합니다("활동 매트릭스", 그림 2). 프로세서는 많은 단계를 자동화하고 여러 장치의 기능을 하나의 기계로 통합하기 때문에 기술자의 교육과 전문 문제 해결 기술이 덜 필요합니다. 모든 단계가 폐쇄된 일회용 튜빙 세트 내에서 수행되기 때문에 프로세서는 개방형 제조 공정에 허용되는 것으로 간주되는 것보다 덜 엄격한 공기 처리 인프라가 있는 시설에서 작동할 수 있습니다. 예를 들어, ISO 클래스 8(EU 등급 C에 필적) 인증을 받은 시설에서 프로세서를 작동하고 있습니다.
그림 1: T 세포 형질 도입 시스템을 사용한 CAR-T 세포 제조. 튜브 세트가 설치된 프로세서가 표시됩니다. 튜빙 세트를 사용하면 멸균 용접을 통해 처리 완충액, 배양 배지 및 렌티바이러스 벡터가 포함된 백과 같은 다른 구성 요소를 연결할 수 있습니다. 백혈구 채취 산물이 Application bag에 추가되면 T Cell Selection Beads로 라벨링하고 Separation column을 통과한 다음 Reapplication bag으로 옮길 수 있습니다. 그런 다음 선택된 세포는 배양용 기기의 배양 장치로 보내지고 활성화 시약으로 활성화됩니다(재료 표 참조). 최종 생성물은 Target cell bag에 수집됩니다. 공정 전반에 걸쳐 품질 관리를 위해 샘플을 무균으로 제거할 수 있습니다. 원 안의 회색 숫자는 튜빙 세트를 통해 액체 경로를 지시하는 프로세서의 번호가 매겨진 밸브를 나타냅니다. 11의 허가를 받아 복제했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 활동 매트릭스. T 세포 선택 및 활성화 후 CAR-T 세포 제조 공정의 나머지 부분은 완전히 맞춤화할 수 있습니다. 활동을 추가하거나 삭제할 수 있으며 적절한 날짜와 시간에 예약할 수 있으며 활동 이후의 문화권 볼륨(Volume)을 지정할 수 있습니다. 예를 들어, 형질도입 활성은 1일차 오전 10:00에 시작하도록 구성되었고, 활동 종료 시 배양 부피는 100mL로 설정되었습니다. 활동 매트릭스는 재배 기간 동안 편집할 수 있습니다. 프로세스 상태는 처리 장치의 통합 화면에서 모니터링할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 원고의 목적은 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 규제 기관이 임상시험용 신약(IND) 신청을 승인하는 데 필요할 수 있는 공정 중 및 제품 출시 테스트에 대한 지침을 추가로 제공하는 것입니다. 제시된 프로토콜은 공급업체가 권장하는 접근 방식에 가깝고 현재 단일 센터 연구자 주도 I/II 상 임상 시험에서 평가되고 있는 IND 28617의 기본 프로토콜입니다. 이 임상시험은 B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 또는 B 계통 림프구성 림프종(B-Lly) 환자를 위한 인간화 CD19 지향 자가 CAR-T 세포를 제조하기 위해 이 프로세서를 사용하는 것의 안전성과 효능을 결정하는 것을 목표로 합니다[NCT05480449]. 이 임상시험은 2022년 9월에 시작되었으며 B-ALL 또는 B-Lly에 0-29세 환자 최대 89명을 등록할 계획입니다. 우리는 원고에 시험의 일부 제조 결과를보고합니다.
원고는 따라야 할 단계가 포함된 프로토콜로 제시되었지만, 다른 사람들이 자신의 CAR-T 세포 제조 공정을 최적화하기 위한 출발점으로 간주되어야 한다는 점을 지적하고 싶습니다. 제시된 프로토콜에 대한 가능한 변이의 비포괄적 인 목록은 다음을 포함합니다 : 동결 보존 된 T 세포 대신 신선한 T 세포를 시작 물질로 사용; 다른 T 세포 농축 방법을 사용하거나 완전히 생략하는 단계; IL2 대신 IL7/IL15와 같은 다른 배지 및 사이토카인 칵테일을 사용합니다. 인간 AB 혈청의 농도를 변화시키거나 완전히 생략하는 것; 형질도입 시기; "multi-hit" transductions를 사용하여; 다양한 교반, 배양량 및 먹이 일정; 핵산 또는 비-렌티바이러스 벡터의 전기천공법을 포함하는 다양한 유전자 전달 방법을 사용하는 단계; 상이한 최종 제형 완충액 및/또는 동결 보호제를 사용하는 단계; 나중에 주입하기 위해 냉동 보관하는 대신 CAR-T 세포를 신선하게 주입합니다. 이러한 변화는 치료 제품의 세포 조성 및 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
| 전체 프로세스 단계 | 프로세스 데이 | 제품 상세 정보 | |||
| 세포 농축 | 0일차 | CD4+/CD8+ T 세포 선택 | |||
| 세포 활성화 | T 세포 배양 파종 및 활성화 | ||||
| 세포 형질도입(Cell Transduction) | 1일차 | 렌티바이러스 transduction(배양 용량 100mL) | |||
| 세포 확장(세포 제형 후) | 2일차 | -- | |||
| 3일차 | 배양 세척(1 사이클); 셰이커가 활성화되었습니다. 배양 부피가 200mL로 증가 | ||||
| 4일차 | -- | ||||
| 5일차 | 사료 (50 mL); 배양 용량이 최종 용량 250mL에 도달 | ||||
| 6일째 | 공정 중 샘플; 배지 교환(-125 mL / +125 mL) | ||||
| 7일째 | 배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확 | ||||
| 8일째 | 공정 중 샘플; 배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확 | ||||
| 9일째 | 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 10일째 | 공정 중 샘플; 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 11일째 | 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 12일째 | 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취 | ||||
| 13일째 | 수확 | ||||
표 1: 프로세스 타임라인 및 개요. 이 표는 현재 임상 시험에서 사용되는 TCT 프로세스 단계를 요약한 것입니다[NCT05480449]. 이 과정은 CD4+/CD8+ 선택에 의한 T 세포 농축, 배양 파종 및 0일차에 활성화로 시작되며, 1일차에 형질도입이 이어집니다. 세포를 48시간 동안 휴지시킨 후 배양 세척, 배양량을 200mL로 늘리고 진탕 메커니즘을 사용하여 교반합니다. 6일째에 첫 번째 공정 중 샘플을 채취합니다. 최소 3회 용량의 CAR-T 세포(환자가 <50kg인 경우 5 × 10 6 CAR-T 세포/kg, 그렇지 않으면 2.5 × 108 CAR-T 세포) 및 품질 관리 테스트(~2 × 106 CAR-T 세포)에 충분한 세포가 확보되면 세포를 채취합니다. 또는 배양이 총 4-5 x 109 세포에 도달하면. 약어: TCT = T 세포 형질도입; CAR-T = 키메라 항원 수용체 T 세포; MACS = 자기 활성화 세포 분류.
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프로토콜
모든 연구는 병원의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 기관 지침에 따라 수행되었으며, 모든 피험자는 임상시험의 맥락에서 수집된 데이터의 출판에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.
참고: 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 CAR-T 제조 공정에 대한 높은 수준의 개요를 제공합니다. 나머지 섹션에서는 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 TCT 소프트웨어 버전 1.4를 사용하는 워크플로를 설명하며, 이는 이 문서 작성 시점의 현재 버전입니다. 다른 버전의 TCT 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 다를 수 있습니다.
1. 프로세스 타임라인 및 개요(표 1)
- 월요일(-1일차)에 비행 전 점검으로 절차를 준비합니다. 프로세서 및 기타 장비가 예상대로 작동하고 모든 시약 및 소모품을 전체 제조 실행에 사용할 수 있고 최신 상태인지 확인합니다.
- 0일째에 기계에 튜빙 세트를 설치합니다. 이전에 냉동 보존된 T 세포를 건식 수조에서 해동하고 멸균 용접을 통해 기기에 설치된 튜브 세트에 연결합니다.
참고: 이 프로토콜은 자가 T 세포가 성분채집술을 통해 수집되고, 동결 보존되고, 제조 시작까지 보관되었다고 가정합니다. 갓 채취한 T 세포를 사용할 수 있지만, 이는 성분채집술 수집과 CAR-T 세포 제조를 조율해야 하기 때문에 물류 부담을 증가시킵니다. 박테리아 오염의 위험을 최소화하기 위해 수조 대신 건식 해동 공정을 사용하는 것이 좋습니다. - CD4 및 CD8 시약으로 T 세포를 라벨링하고( 재료 표 참조) 자기 선택으로 농축합니다.
참고: T 세포 농축을 생략하거나 프로세서에 세포를 로드하기 전에 수행할 수 있습니다. 의정서의 섹션 5를 참조하십시오. - CD4+/CD8+ 세포를 농축한 후 세포 수를 위해 샘플을 채취합니다. 5% 인간 AB 혈청 및 재조합 인간 IL2(25ng/mL)가 보충된 배지 70mL(재료 표 참조)의 초기 부피에 1-2 × 108개의 세포로 배양물을 파종합니다.
- 활성화 시약 바이알(항-CD3 및 항-CD28 항체에 접합된 콜로이드 고분자 나노매트릭스, 재료 표 참조)을 추가하여 T 세포를 활성화하고 5%CO2 분위기에서 37ºC에서 24시간 동안 교반 없이 배양물을 배양합니다. 원하는 경우 남은 CD4+/CD8+ 세포를 백업으로 냉동 보존합니다.
알림: 제조 실패의 경우 남은 CD4+/CD8+ 선택된 셀을 출발 물질로 사용할 수 있습니다. 고장이 오염 또는 작업자 오류와 같은 순전히 기술적인 것이고 충분한 셀이 남아 있는 경우 남은 셀을 사용하여 추가 제조 실행을 수행하는 것을 고려할 수 있습니다. 출발 물질의 품질이 우려되는 경우 새로운 성분채집 절차가 보장될 수 있습니다. 그러나 이것은 궁극적으로 임상적 결정입니다. 두 경우 모두 제조 실패는 조사해야 하는 중요한 사건이며 의뢰자와 규제 기관에 알려야 합니다. - 활성화 24시간 후, 적절한 감염 다중성(MOI)에서 렌티바이러스 벡터로 T 세포를 transduction합니다.
참고: 임상 제품 제조를 시작하기 전에 렌티바이러스 벡터 역가를 측정하고 적절한 MOI를 설정하는 것이 중요합니다. 벡터 역가는 인간 일차 T 세포가 벡터의 다양한 농도에서 형질도입되는 소규모 실험을 수행하여 결정해야 합니다. 적절한 MOI에 대한 고려 사항에는 벡터의 비용, 원하는 transduction 효율 및 허용 가능한 벡터 복제 수가 포함됩니다. 이 프로토콜은 30-50%의 MOI를 사용하여 벡터 비용을 최소화하고 평균 벡터 복제 수를 transduction cell당 8 copy 미만으로 유지합니다. - 3일차에 Culture Wash 활동을 트리거하고 낮은 수준의 교반을 시작합니다. 배양량을 200mL로 늘립니다.
- 5일차에 배양액 50mL를 배양액에 추가하여 배양량을 250mL로 늘립니다.
- 배양 6일차에 배양물에서 검체를 채취하여 유세포 분석으로 CAR-T 세포를 계수합니다. 이 측정값을 사용하여 배양액이 성장하는 속도를 추정하고 최적의 수확 시기를 식별할 수 있습니다.
참고: 각 공정 중 샘플링은 테스트를 위해 3mL를 수득하고 총 7mL의 배양 부피를 제거합니다. - 7일차부터 13일차까지 배양액이 종료되지 않은 경우 격일로 최대 2개의 추가 공정 중 샘플을 채취하고 매일 배지 교환을 수행하여 성장하는 배양액을 공급합니다. 총 유핵 세포(TNC) 수가 5 × 109 에 도달하거나 필요한 투여 횟수 및 방출 검사에 충분한 세포를 사용할 수 있을 때 제품을 수확합니다.
- 수확 당일에는 활발하게 자라는 배양액에서 공정 중 샘플을 채취합니다. 이 샘플은 마이코플라스마, 내독소, 복제 가능 렌티바이러스(RCL) 검사, 벡터 복제 수(VCN) 검사, 세포 수, 세포 크기 분석, 유세포 분석 및 그람 염색에 사용할 수 있습니다.
- 배양 배지의 제거와 최종 제형 완충액(4% 인간 혈청 알부민이 보충된 멸균 등장성 결정질 용액, 재료 표 참조)으로 세포 세척을 트리거하는 최종 수확 프로그램을 시작합니다. 수확이 완료된 후 표적 세포 백은 최종 제형 완충액에 100mL의 세포 생성물을 보관합니다. 디메틸설폭사이드(DMSO)를 10%(v/v) 농도로 첨가하고, 생성물을 개별 용량으로 분주하고, 속도 조절 냉동고를 사용하여 냉동 보존합니다.
2. 1일차: 준비 및 비행 전 점검
- CO2 가스 수준과 압축 공기가 각 라인에서 최소 20psi의 입구 압력을 생성하기에 충분한지 확인합니다.
- 프로세서를 켜고 시작 시 오류가 없는지 확인합니다. 필요한 경우 시계를 정확한 시간으로 설정하십시오. 프로세서를 종료합니다.
- T 세포 출발 물질의 세포 수, 부피 및 총 CD4+ 및 총 CD8+ 수를 알고 있는지 확인하십시오.
- 전체 제조 실행에 충분한 양의 바이러스 벡터, 시약 및 소모품이 있는지 확인합니다.
- 인간 AB 세럼 한 병을 냉장고에 넣어 밤새 해동합니다.
3. 0일차: 튜빙 세트 설치
- 3L의 처리 완충액(인산염 완충 식염수/에틸렌디아민테트라아세트산(PBS/EDTA) 완충액에 인간 혈청 알부민(HSA) 0.5%(w/v))를 준비합니다.
- 배양 배지 2L(최종 농도가 5%인 인간 AB 혈청 100mL가 보충된 배지 2L와 25μg/바이알에서 재조합 인간 IL2 바이알 2개, 이 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조)를 준비합니다. 10mL 배양 배지를 20mL 시약 백에 옮기고 4ºC에서 밤새 보관합니다.
- 기기를 켜고 터치 스크린 인터페이스에서 T 세포 형질 도입 과정 (TCT)을 선택합니다. Run(실행 )을 클릭하여 TCT 프로세스를 시작합니다. 기기가 화면의 지시와 프롬프트를 사용하여 절차를 통해 사용자를 안내하도록 합니다.
- 매개변수 입력 화면에서 작업자의 이니셜, 튜빙 세트 로트 번호 및 프롬프트가 표시되면 만료 날짜를 입력합니다.
- 프로세스 설정 화면에는 네 가지 프로세스가 표시됩니다. 전체 프로세스(1)를 선택합니다.
참고: 사용 가능한 다른 프로세스에는 CD4+/CD8+ 선택된 T 세포(아래 섹션 5 참조)에서 시작하고 이전에 중단된 제조 실행을 다시 시작하는 것이 포함됩니다. - 메시지가 표시되면 CD4+/CD8+ 선택 방법을 반영하기 위해 선택 시약의 두 바이알 을 선택합니다.
- 화면의 지시에 따라 튜빙 세트를 설치하십시오. 모든 루어 연결이 단단히 조여져 있고 튜빙 세트에 결함이 없는지 확인하십시오.
- 화면의 지시에 따라 자동화된 상위 및 하위 무결성 테스트를 시작합니다.
알림: 결함 있는 튜빙 세트, 잘못 설치된 튜빙 세트 또는 기계 연동 펌프의 결함으로 인해 무결성 테스트가 실패할 수 있습니다. 생산 실행을 위해 최소 하나의 추가 튜빙 세트를 보유하는 것이 좋습니다. 또한 두 번째 기술자가 튜빙 세트가 올바르게 설치되었는지 확인하는 것이 좋습니다. - 배지를 부착하고 버퍼 백을 처리하기 위해 화면의 지시를 따릅니다.
- 튜빙 세트의 자동 프라이밍을 시작합니다.
알림: TCT 공정은 프라이밍 후 3시간 이내에 계속되어야 합니다. T 세포 출발 물질이 준비되었는지 확인하십시오.
4. T 세포 농축
- Transfer cell product 화면이 나타나면 동결 보존된 T 세포 산물을 해동하기 시작합니다.
참고: 튜빙 세트에 추가할 수 있는 T 세포의 허용 가능한 부피는 50 - 280mL입니다. 표적 세포의 최대 개수(CD4+와 CD8+의 합)는 3 × 109개이고, 최대 TNC 개수는 2 × 1010개입니다. - 해동된 세포를 150mL 전사 백에 옮깁니다. 이송 백을 튜빙 세트의 적용 백에 멸균 용접합니다.
- QC 파우치를 사용하여 Application bag에서 샘플을 꺼내고 세포 계수를 수행합니다.
- CD4 및 CD8 시약 바이알을 연결합니다.
- 선택(T 세포 농축) 과정을 시작합니다.
- 농축 후 세포 수, 유세포 분석 및 세포 크기 분석을 위해 재도포 백의 QC 파우치에서 CD4+/CD8+ 선택된 세포의 샘플을 제거합니다.
참고: 다음 단계로 진행하려면 셀 수 결과가 필요합니다.
5. 대안: CD4+/CD8+ 선택된 세포로 시작
- 3.2단계에 설명된 대로 배지를 준비합니다. 처리 버퍼가 필요하지 않습니다.
- 프로세서를 켜고 공정 설정 화면에서 TS 설치로 T 세포 배양(3)을 선택합니다. 화면의 지시와 지시를 따릅니다.
- 화면의 지시에 따라 처리 버퍼 대신 매체로 튜빙 세트를 프라이밍합니다.
- "배양-연결 세포 산물 준비" 화면이 나타나면 CD4+/CD8+ 선택한 T 세포를 해동하기 시작합니다.
참고: 이 공정의 최소 T 세포 수(CD4+ 및 CD8+ T 세포의 합)는 1.0 × 108입니다. - 세포를 150mL 전사 백으로 옮기고 배지로 희석하여 최종 부피 50mL로 합니다.
- 셀 현탁액을 기기의 재도포 백에 멸균 용접합니다.
- 세포 수 및 세포 크기 분석을 위해 재도포 백의 QC 파우치에서 CD4+/CD8+ 선택된 세포의 샘플을 꺼냅니다.
6. 활동 매트릭스의 문화 설정 및 프로그래밍
- 세포 농도와 원하는 시작 번호(1-2 × 108 T 세포)를 입력합니다.
참고: 기기는 재도포 백에서 배양 챔버로 적절한 용량을 자동으로 펌핑하고 최종 용량을 70mL로 조정합니다. - 화면의 지시에 따라 활성화 시약의 바이알을 부착합니다.
- CO2 농도의 경우 5%를 입력하고 배양 챔버 온도의 경우 39°C를 입력합니다.
알림: 제조업체는 39°C 또는 기기에 대해 특별히 보정된 값을 입력할 것을 권장합니다. - 활동 매트릭스를 설정합니다. 향상된 급지 프로토콜을 시작점으로 사용하고 프로토콜 내의 개별 단계를 사용자 정의 사양으로 수정합니다(그림 2).
- Transduction 활동 시간이 시드 후 24시간(1일차)인지 확인합니다.
- Culture Wash 활동 시간은 Transduction 48시간(3일차) 후인지 확인합니다.
- Activate Shaker( Shaker type 2)의 시간을 Culture Wash 시작 후 30분으로 설정합니다.
- 중형 봉투 교환 및 폐기물 봉투 교환 활동을 삭제합니다.
- 화면에서 확인을 터치하여 재배를 시작합니다.
- 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 남은 CD4+/CD8+ 선택 세포를 Application bag에 냉동 보존합니다.
7. 1일차: T 세포 형질 도입
- 원하는 MOI를 기반으로 사용할 렌티바이러스 벡터의 부피를 계산합니다.
- 4ºC에서 밤새 보관한 10mL 배양 배지가 들어 있는 20mL 시약 백을 회수합니다(단계 3.2). 벡터 바이알을 해동하고 7.1에서 계산된 부피를 20mL 시약 백에 옮깁니다.
참고: 보존 또는 연구 개발을 위해 남은 벡터를 고정하는 것이 좋습니다. - 활동 매트릭스를 수정하여 변환 시간을 2분 후로 설정합니다. 메시지가 표시되면 확인을 터치하여 Transduction 활동을 시작합니다.
- 화면의 지시에 따라 벡터 백을 튜브 세트에 멸균 용접합니다.
- 변환 활동이 시작된 실제 시간을 기준으로 활동 매트릭스를 수정합니다.
참고: 파종 후 20-24시간 이내에 형질도입을 시작하여 정상 근무 시간 동안 실습 활동이 수행되도록 하는 것이 좋습니다.- 배양 세척 시간은 형질도입 후 48시간(3일차)인지 확인합니다.
- 셰이커 활성화(셰이커 유형 2)의 시간을 배양 세척(3일차) 후 30분으로 설정합니다.
- 미디어 교환 시간이 6일차 오후(오후 1시)인지 확인합니다.
8. 6일차: 첫 번째 공정 중 샘플
- Sample 버튼을 터치하고 화면의 지시에 따라 활성 배양물에서 QC 샘플을 얻습니다.
- 세포 수, 유세포 분석 및 세포 크기 분석을 수행합니다. 그램 염색을 위해 샘플 1mL를 보냅니다.
참고: 배양 성장을 모니터링하기 위해 세포 수를 거의 이틀에 한 번씩 반복해야 합니다. - 배양액 2L를 더 준비합니다(3.2단계 참조).
- 활동 매트릭스에 2분 후에 시작하도록 지정된 중형 가방 교환 활동을 추가합니다. 20분 후에 시작하도록 Media Exchange 활동을 조정합니다. 화면의 지시를 따릅니다.
참고: 배지 교환은 배양실에서 배양 배지 를 대체하는 것입니다. 미디엄 백 교환 은 악기에 매달린 배양 배지 백을 대체하는 것입니다.
9. 수확일(7일에서 13일까지): 수확 및 냉동 보존
- Sample 버튼을 터치하고 화면의 지시에 따라 활성 배양물에서 QC 샘플을 얻습니다.
- QC 샘플을 각각 1mL씩 3개의 부분 표본으로 분리합니다. 유세포 분석, 세포 수 및 세포 크기 분석에 1mL를 사용합니다. 마이코플라스마, 벡터 복제 수, 복제 가능 렌티바이러스 및 내독소 검사에 1mL를 사용합니다. 그램 염색을 위해 마지막 1mL를 보냅니다.
- 최종 제형 완충액을 준비합니다(2L 백에 4% HSA가 보충된 멸균 등장성 결정질 용액, 재료 표 참조). 이 완충액 100mL를 저장하여 이후 단계에서 동결 보호제 용액을 준비합니다.
- 작업 매트릭스를 수정하여 문화권 종료 시간을 2분 후로 설정하고 나머지 다른 모든 활동을 삭제합니다. 화면의 지시에 따라 최종 배합 완충액을 튜빙 세트에 부착하고 수확을 시작합니다.
알림: 프로세서는 자동으로 셀을 대상 셀 백으로 전송합니다. 부피는 100mL입니다. - Target cell bag QC 파우치에서 0.5mL 샘플을 채취하여 세포 계수를 수행합니다.
- 대상 셀 백을 밀봉하고 튜빙 세트에서 제거합니다. CAR-T 제품을 적절한 용량으로 나누어 제어된 냉동고에서 냉동 보존합니다. -150ºC에서 액체 질소 저장 탱크의 증기 상태에 셀을 ≤ 보관하십시오.
참고: 용량의 최종 제형 및 분취는 프로토콜에 따라 다릅니다. 여기서는 CAR-T 세포와 QC 바이알을 3회 동일한 용량으로 동결 보존하는 예를 제공합니다. 자세한 내용은 섹션 10을 참조하십시오. - 기기에서 프로세스 데이터를 다운로드하고, 튜빙 세트를 제거 및 폐기하고, 셧다운을 수행합니다.
10. CAR-T 세포의 동결 보존
참고: 이 프로토콜은 CAR-T 세포가 제조 후 냉동 보존되어 환자가 주입할 준비가 될 때까지 보관한다고 가정합니다. 갓 제조된 CAR-T 세포를 주입하는 것은 가능하지만, CAR-T 세포 제조와 CAR-T 세포 주입을 조율해야 하기 때문에 물류 부담이 가중됩니다. 이는 제조 실패의 경우 문제가 될 수 있습니다. 특히 임상 프로토콜에 따라 CAR-T 주입 전에 림프절 고갈 화학요법이 필요한 경우, 제조 실패로 인해 환자가 불필요한 화학요법의 위험에 노출될 수 있으므로 냉동 보존을 강력히 권장합니다. 규제 기관은 조사관에게 주입 전에 제품이 모든 방출 테스트를 통과했음을 입증하도록 요구할 수 있으며, 이는 냉동 보존 없이는 달성하기 어려울 수 있습니다.
- 수확된 제품의 최종 100mL에서 추가 방출 테스트(예: 생존율), 머무름 및 멸균 샘플을 수행하기 위해 원하는 CAR-T 용량 및 품질 관리(QC) 바이알을 충족하는 데 필요한 부피를 결정하고 제거합니다.
참고: 최종 제품을 분취하기 위해 완전히 정의된 전략을 개발하는 것이 중요합니다. 충분한 재료를 사용할 수 있는 경우 재주입을 허용하기 위해 여러 용량의 제품을 제조하는 것이 좋습니다. 백에 담긴 제품 용량이 10-20mL이므로 주사기 푸시를 통해 빠르게 해동하고 쉽게 주입할 수 있습니다. 각 제품을 원하는 CAR-T 세포 용량(예: kg당 5 × 106 CAR-T 세포 또는 2.5 ×10 8 CAR-T 세포)으로 채우는 것이 좋으며, 이렇게 하면 주입 당일에 용량을 계산할 필요가 없습니다. 또한 최소 4개의 QC 바이알을 냉동 보존하고 남은 물질이 있을 수 있는 가능성을 고려하는 것이 좋습니다. 이 자료는 연구 및 개발 목적으로 유용할 수 있으므로 저장하는 것이 좋습니다. - 세포를 원심분리하여 부피를 줄입니다.
- 단계 9.3에서 따로 보관된 최종 제형 완충액의 부분을 사용하여 원하는 최종 부피의 절반으로 생성물(들)을 올립니다.
- 최종 제형 완충액에서 20% DMSO 용액을 생성하여 2x 동결 보호제를 준비합니다.
참고: 동결 보호제 제형 및 DMSO 농도를 수정할 수 있습니다. - 최종 DMSO 농도 10%를 위해 동일한 부피의 세포에 2x 동결 보호제를 추가합니다.
알림: 동결 보호제에 대한 제품의 노출 기간을 최소화해야 합니다. - 투여 백과 QC 바이알을 채웁니다. 멸균을 위해 1mL를 보냅니다.
참고: 규제 기관은 일반적으로 최종 제품에 대해 14일 무균 분석을 수행할 것을 요구합니다. 그러나 신속한 멸균 분석이 등장하고 있습니다. 이때 compendial 14 일 방법이 가장 일반적입니다. - 속도 조절 냉동고를 사용하여 제품을 냉동 보존합니다.
알림: 제어 속도 냉동고 프로그램은 공융점에 대한 보상과 함께 ~ -1ºC/min에서 ~ -45ºC의 냉각 속도를 생성하도록 검증되어야 합니다. - ≤ -150°C의 액체 질소 초저온 냉동고의 증기상 보관.
11. 시술 수행 심사
참고: TCT 공정 전반에 걸쳐 활성 배양물에서 여러 QC 샘플을 채취합니다. 표 2 는 독자가 참조를 위해 결과를 구성하고 프로시저 성능 메트릭을 계산하는 데 도움이 되는 그리드를 제공합니다. 문자와 숫자로 구성된 아래 용어(예: "B4")는 이 표의 그리드에 있는 셀을 나타냅니다. 다음 값이 성능 계산에 사용됩니다: B3 = 총 유핵 세포(TNC) 사전 농축; B4 = TNC 농축 후; E2 = CD4+ 및 CD8+ T 세포의 합(초기 성분채집술 산물의 총 세포에 대한 백분율); E4 = 농축 후 전체 세포의 백분율로 나타낸 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 합; G2 = CD19+ 세포(초기 생성물의 총 세포에 대한 백분율); G4 = CD4+/CD8+ 농축 후 전체 세포의 백분율로 나타낸 CD19+ 세포; B10 = 수확 당일 활성 배양액의 TNC.
표 2: 프로시저 성능 그리드. 절차 성능 통계를 계산하는 데 필요한 공정 내 테스트 조건을 구성하는 데 도움이 되도록 이 그리드를 제공합니다. 행은 절차 중 다양한 시점에서 분석된 샘플을 나타내며 숫자 1-11로 레이블이 지정됩니다. 6-9행은 재배 6일 이후부터 수확일 이전에 채취한 샘플의 결과를 캡처하는 데 사용할 수 있습니다. 열은 측정된 매개변수를 나타내며 문자 AH로 레이블이 지정됩니다. 회색으로 음영 처리된 필드는 적용되지 않습니다. 일부 추가 필드는 CD4+/CD8+ 농축이 절차의 일부로 수행되는지 여부와 재배 기간에 따라 적용되지 않을 수 있습니다. 해당 필드에 "N/A"를 쓰는 것이 좋습니다. 약어: TNC = 총 유핵 세포 수; QC = 품질 관리. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
- 방정식 (1)을 사용하여 농축 후 CD4+와 CD8+ T 세포의 총 수를 농축 전 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 총 수로 나누어 선택 후 CD4+/CD8+ 세포의 회수율을 계산합니다.
CD4+/CD8+ T 세포 회수 =
(1) - CD4+/CD8+ 농축 후 CD19+ 세포의 총 수를 농축 전 CD19+ 세포의 총 수로 나누어 농축 후 CD19+ 세포의 고갈을 계산합니다. 이 숫자는 매우 작을 것으로 예상되므로 방정식 (2)와 같이 이 분수의 로그를 보고합니다.
기록 CD19 세포 고갈 = 기록10
(2) - 수확 시 활성 배양에 있는 총 세포 수를 방정식 (3)을 사용하여 파종된 세포 수로 나누어 총 배 성장을 계산합니다.
총 폴드 증가 =
(3) - 방정식 (4)를 사용하여 수확일에 대한 총 배 성장의 근을 취하여 평균 일일 성장을 계산합니다.
평균 일일 증가율 = 수확일 √(총 배수 증가율) (4)
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결과
NCT05480449 임상시험의 초기 3회 CAR-T 제조 실행 결과는 아래 표 3에 나와 있습니다. 출발 물질, 벡터, 배양 사이토카인 및 AB 혈청 농도는 각 실행에 대해 일관되게 유지되었습니다. 제품은 7일 또는 8일에 수확되었습니다. 하루 평균 세포 성장율은 46%(총 세포 수 증가)였으며, 이는 TCT 과정이 세포 증식을 촉진하는 데 효과적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 프로세서가 일관되고 재현 가능한 CAR-T 세포 산물을 생산할 수 있음을 시사합니다.
표 4에 요약된 최종 제품 테스트 결과는 CAR-T 세포가 품질 관리 표준을 통과했음을 보여줍니다. 세포 생존율은 88%에서 94% 사이였고 CD3 T 세포 순도는 89-93%였습니다. 중요한 것은 내독소, 마이코플라스마, 불임, 복제 가능한 렌티바이러스 및 잔류 백혈병 세포가 검출되지 않았다는 것입니다. 이러한 결과는 TCT 공정이 임상 사용을 위한 규제 기...
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토론
CAR-T 세포 치료제는 B세포 및 기타 악성 종양에 대한 유망한 치료법으로 부상했습니다. 그러나 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 높은 비용, 노동 집약적인 생산, 오염 위험을 증가시키는 개방형 단계 등 몇 가지 한계가 있습니다. 최근에는 이러한 한계를 해결하기 위해 Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하 "프로세서")를 비롯한 여러 반자동 플랫폼이 등장했습니다. 이 원고에 설명된 프로세서에 통합된 T 세포 형질도입(TCT) 공정은 폐쇄형 시스템에서의 T 세포 농축, 활성화, 바이러스 형질도입, 배양 확장 및 수확을 포함합니다. 경쟁사의 자동 세포 처리기 플랫폼은 현재 널리 사용되지 않지만 배양 파라미터에 대한 공정 중 모니터링이 더 우수하거나, 유리한 장비 또는 재료 비용이 들거나, 설치 공간이 더 작아 전용 클린룸 공간 대신 생물 안전 작업대에서 사용할 수 있습니다. 주어진 응용 프로그램 및 환경에 가장 적합한 플랫폼을 선택하는 것이 중요합니다.
CAR-T ...
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공개 사항
S.K., S.G. 및 Y.W.는 Miltenyi Biotec으로부터 연구 지원을 받았습니다.
감사의 글
저자들은 이 작업에 대한 여러 개인과 조직의 기여에 감사를 표하고자 합니다. 세포 및 유전자 치료 실험실(Cell and Gene Therapy Laboratory)과 펜실베이니아 중개 및 상관 연구 실험실(Penn Translational and Correlative Studies Laboratory)은 공정 개발 및 IND 제출 준비에 귀중한 지원을 제공했습니다. 멜리사 바르게세(Melissa Varghese)와 아만다 디노피아(Amanda DiNofia)는 이 원고의 기초가 되는 IND 제출을 위한 프로세스 개발 및 준비에 기여했습니다. 이 연구는 필라델피아 아동 병원의 세포 및 유전자 치료 협력 단체의 가속 보조금의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 기술 및 연구 지원에 대해 Miltenyi Biotec에 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1 은 copyright © 2023 Miltenyi Biotec BV & Co. KG의 적용을 받습니다. 판권 소유.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12 x 75 붕규산 튜브 | Charles River | TL1000 | |
| 20mL 시약 백 | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50mL 원추형 튜브 | Fisher | 05-539-10 | |
| 150mL 전사 세트 | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000mL 전사 세트 | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | ||
| 알코올 준비 | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR 감지 시약 비오틴 | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| 셀로미터 참조 비드 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| 셀로미터 참조 비드 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| 셀로미터 참조 비드 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| 셀로미터 슬라이드 | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | CD4 시약 |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | CD8 시약 |
| CliniMACS PBS/EDTA 완충액 | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | 완충액 |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| 냉동 백 50mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| 냉동 바이알, 1.8mL | Nunc | 12565171N | |
| 냉동 바이알, 4.5mL | Nunc | 12565161N | |
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| 인간 혈청 알부민 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| 인간 혈청 알부민 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP 재조합 인간 IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | 사이토카인 |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | 활성화 시약 |
| MycoSeq Mycoplasma 감지 키트 | Life Technologies | 4460623 | |
| 바늘, 하이포더믹 14G | Medline | SWD200573 | |
| 바늘, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| 피펫 팁, 2-200 μ L, 개별 포장 | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet 팁, 50-1000 μ L, 개별 포장 | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | 전해질 솔루션 |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | 튜빙 세트 |
| 멸균 필드 | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| 주사기 1 mL | BD | 309628 | |
| 주사기 10 mL | BD | 302995 | |
| 주사기 3 mL | BD | 309657 | |
| 주사기 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP 매체 | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | 매체 |
| 삼중 샘플링 어댑터 | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| 바이러스 벡터 | CHOP 임상 벡터 코어 | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety 캐비닛 | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | 프로세서 |
| 제어 속도 냉동고 | 대패 / Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler 밸런스 | 메틀러 | ||
| 냉장 원심분리기 | Thermo Fisher | ||
| 냉장 원심분리기 | Fisher Sci | ||
| SCD 멸균 튜빙 용접기 | Terumo | ||
| Sebra 튜브 실러 | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | 건식 해동 장치 | |
| XN-330 혈액학 분석기 | Sysmex |
참고문헌
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
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- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).
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