방법 논문

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구

DOI:

10.3791/65634

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2023년 6월 9일

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1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

이 논문에서

요약

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본 프로토콜은 MCF-7 세포 증식 및 이동을 억제하는 살리드로사이드의 약리학적 작용 및 기전을 평가하기 위한 포괄적인 전략을 설명합니다.

초록

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Salidroside (Sal)는 항 발암성, 항 저산소 및 항 염증 약리 활성을 포함합니다. 그러나, 그것의 근본적인 반대로 유방암 기계장치는 단지 불완전하게 해명되었다. 따라서 이 프로토콜은 인간 유방암 MCF-7 세포의 악성 증식에서 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 조절하는 Sal의 잠재력을 해독하기 위한 것입니다. 먼저, MCF-7에 대한 Sal의 약리활성을 CCK-8 및 세포 스크래치 분석으로 평가하였다. 또한, MCF-7 세포의 내성은 이동 및 Matrigel 침습 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 사멸 및 주기 분석을 위해 MCF-7 세포는 각각 유세포 분석을 위해 annexin V-FITC/PI 및 세포 주기 염색 검출 키트를 사용하여 단계적으로 처리되었습니다. 활성 산소종(ROS) 및 Ca2+의 수준은 DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 면역형광 염색으로 검사되었습니다. Na+-K+-ATPase 및 Ca2+-ATPase의 활성은 해당 상용 키트를 사용하여 측정하였다. 세포사멸 및 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 단백질 및 유전자 발현 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석을 사용하여 추가로 측정되었습니다. Sal 치료는 용량 의존적 효과로 MCF-7 세포의 증식, 이동 및 침입을 유의하게 제한한다는 것을 발견했습니다. 한편, Sal 투여는 MCF-7 세포가 세포사멸(apoptosis)과 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 겪도록 극적으로 강제했다. 면역형광 검사는 Sal이 MCF-7 세포에서 ROS 및 Ca2+ 생산을 관찰할 수 있게 자극하는 것으로 나타났습니다. 추가 데이터는 Sal이 pro-apoptotic 단백질, Bax, Bim, 절단된 caspase-9/7/3 및 해당 유전자의 발현 수준을 촉진한다는 것을 확인했습니다. 일관되게 Sal 중재는 Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α 및 FoxO1 단백질과 해당 유전자의 발현을 현저하게 감소시켰습니다. 결론적으로, Sal은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 억제하여 MCF-7 세포의 악성 증식, 이동 및 침입을 줄일 수 있기 때문에 유방암 치료를 위한 잠재적인 허브 유래 화합물로 사용할 수 있습니다.

서론

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가장 흔하게 진단되는 암 및 가장 흔한 악성 종양 중 하나인 유방암은 최신 통계에 따르면 2020년까지 전 세계적으로 230만 건의 유방암이 발생하여 전체암 사례의 11.7%를 차지합니다1. 유방암의 일반적인 증상으로는 유방 압통과 따끔거림, 유방 덩어리 및 통증, 유두 분비물, 미란 또는 함몰된 피부, 겨드랑이 림프절 비대증등이 있다 1,2. 더욱 우려스러운 것은 유방암의 신규 발병 건수와 전체 발병률이 매년 압도적인 비율로 계속 증가하여 암 관련 사망의 6.9%를 차지한다는 것입니다1. 현재 유방암 중재는 여전히 주로 화학 요법, 수술, 방사선 요법 및 포괄적 인 치료를 포함합니다. 치료는 환자의 재발률과 사망률을 효과적으로 낮출 수 있지만, 장기간의 치료는 종종 다제내성, 대면적 탈모, 메스꺼움 및 구토, 심각한 정신적, 심리적 부담을 유발한다 2,3. 특히, 유방암으로 인한 다발성 장기 전이의 잠재적 위험으로 인해 사람들은 약물 요법의 새로운 약초 공급원을 찾게 된다

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프로토콜

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본 연구에 사용된 MCF-7 세포는 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).

1. 세포 배양

  1. 10% FBS 및 1% 페니실린(10,000U/mL)/스트렙토마이신(10,000μg/mL)을 함유한 DMEM을 사용하여 37°C에서 가습된 5%CO2 분위기에서 MCF-7 세포를 배양합니다( 재료 표 참조).
    참고: 접시 바닥의 90%를 차지하는 세포를 실험에 사용하고 대조군, 독소루비신 염산염 그룹(DXR, 5μM) 및 Sal 그룹(20μM, 40μM 및 80μM) 또는 대조군, LY294002(10μM, PI3K 억제제) 그룹, Sal(80μM) 그룹 및 LY294002(10μM) + Sal(80μM) 그룹( 재료 표 참조).

2. 세포 생존율 분석

참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서27을 참조하십시오.

  1. 96웰 플레이트에 8 x 104 세포/웰 ....

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결과

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MCF-7 세포의 과잉 증식 억제 및 상처 치유 지연에 대한 Sal의 효과
유방암에 대한 Sal의 잠재력을 조사하기 위해 먼저 인간 유방암 MCF-7 세포주의 세포 증식 독성 및 스크래치 분석을 사용하여 항암 특성을 테스트했습니다. 이들 세포를 24시간 동안 일련의 Sal(5-320μM) 농도와 함께 공동 배양하고, CCK-8 분석을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 세포 증식에 대한 Sal의 용량 의존적 억제 효과가 관찰되었으며, 40μM에서 세포 활력이 50% 감소했습니다(그림 2A). 그런 다음 20μM, 40μM 및 80μM의 Sal 농도를 후속 시점 및 상처 치유 평가를 위해 선택했습니다. 그림 2B의 결과는 Sal이 시간이 지남에 따라 MCF-7 세포의 활력을 억제할 수 있음을 보여주며, 24시간의 공동 배양 후 MCF-7 세포 활력이 50% 감소합니다.

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토론

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유방암은 모든 연령대의 개인에게 영향을 미치며 헤아릴 수 없는 신체적, 정신적 부담과 큰 경제적 압박을 유발합니다1. 매년 이환율과 사망률이 증가하는 유방암은 기존 치료법을 넘어 효과적인 한방 기반 복합 요법을 찾는 측면에서 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다 4,5. 유망하게도, Sal24,25,38의 항암 효과가 밝혀진 많은 증거가 있습니다. 불행히도, 유방암에서 Sal의 역할과 근본적인 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려져 있지 않습니다. 이 연구는 인간 유방암 MCF-7 세포주의 증식, 이동 및 침입에 대한 Sal의 상당한 억제 효과를 강조합니다. 그 후, 우리는 MCF-7 세포의 자극적인 세포사멸 및 주기 정지.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 쓰촨성 건강위원회(120025)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1% 페니실린/스트렙토마이신HyCloneSV30010
AKT 항체ImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI 키트MultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
자동 마이크로플레이트 리더분자 장치SpectraMax iD5
Bax 항체세포 신호 기술, Inc.#5023
BCA 키트Biosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 항체세포 신호 기술, Inc.#15071
Bim 항체세포 신호 기술, Inc.#2933
Ca2+– ATPase 분석 키트Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
세포 계수 키트-8Biosharp Life SciencesBS350B
세포 주기 염색 키트MultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
절단 카스파제-3세포 신호 기술, Inc.#9661
절단된 카스파제-7세포 신호 기술, Inc.#8438
절단된 카스파제-9세포 신호 기술, Inc.#20750
크리스탈바이올렛 용액Beyotime BiotechnologyC0121
DMEM 고포도당 배양액Servicebio Technology Co., Ltd.G4510
독소루비신 염산염MedChemExpressHY-15142
ECL 화학발광 용액Biosharp 생명 과학BL520B
소 태아 혈청프로셀 생명 과학 및 공급자:Technology Co., Ltd.164210
유세포 분석기BDFACSCanto figure-materials-1
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 항체ImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
염소 항토끼 IgG 2차 항체MultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad 프리즘 소프트웨어La Jolla버전 6.0
HIF-1α 항체Affinity BiosciencesBF8002
인간 유방암 세포주 MCF-7Procell Life Science & 공급자:Technology Co., Ltd.CL-0149
로딩 버퍼Biosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 
mTOR 항체Servicebio Technology Co., Ltd.
Na+– K+– ATPase 분석 키트Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
광학 현미경OlympusIX71PH
p-AKT 항체ImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K 항체Servicebio Technology Co., Ltd.
p-PI3K 항체Affinity BiosciencesAF3241
정량적 웨스턴 블롯 이미징 시스템Touch Image ProeBlot
역전사 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트Servicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS 분석 키트Beyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA 형광 프로브가 여기에 포함되어 있습니다
.H-040
SDS-PAGE kit서비스바이오 테크놀러지 주식회사G2003-50T
총 RNA 분리 키트ForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018
356234GB11405GB11525

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al.

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재인쇄 및 허가

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태그

MCF 7PI3K AKTqRT PCR

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