이 프로토콜은 지속적인 비디오 뇌전도(EEG) 모니터링과 병행하여 수행된 간질 쥐의 반복적인 뇌척수액 및 혈액 수집을 보여줍니다. 이는 다양한 체액 분자의 변화와 발작 활동 사이의 가능한 연관성을 탐구하는 데 도움이 됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
체액의 조성은 많은 생리학적 및 병리학적 역학을 반영하기 때문에 생물학적 액체 샘플은 일반적으로 호르몬, 성장 인자, 단백질 또는 작은 비암호화 RNA와 같은 관심 분자를 측정하기 위해 많은 실험 맥락에서 얻어집니다. 구체적인 예는 간질에 대한 바이오마커 연구에서 생물학적 액체의 샘플링입니다. 이러한 연구에서는 뇌척수액(CSF)과 혈장 내 분자 수준을 비교하고, 뇌척수액과 혈장을 병렬로 채취하고, 발작 시 샘플링까지의 시간 거리를 고려하는 것이 바람직합니다. 뇌척수액과 혈장 샘플링을 결합한 이 연구는 뇌전증 동물의 비디오-EEG 모니터링과 결합되어 추정 진단 및 예후 바이오마커의 검증을 위한 유망한 접근법입니다. 여기에서, 지속적으로 비디오 EEG를 모니터링하는 간질 쥐의 수조 마그나에서 뇌척수액을 채취하고 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링하는 과정을 결합하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 일반적으로 사용되는 다른 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 통증이나 침습을 최소화하고 마취 시간을 단축하면서 신속한 샘플링이 가능합니다. 또한 테더 및 원격 측정 EEG 기록 쥐 모두에서 CSF 및 혈장 샘플을 얻는 데 사용할 수 있으며 여러 날의 실험에 걸쳐 반복적으로 사용할 수 있습니다. 이소플루란 마취를 단축하여 샘플링으로 인한 스트레스를 최소화함으로써 생체 유체에서 조사된 분자의 실제 수준을 보다 정확하게 반영할 수 있을 것으로 기대됩니다. 적절한 분석 분석의 가용성에 따라 이 기술은 EEG 기록을 동시에 수행하면서 여러 개의 다른 분자 수준을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
뇌척수액(CSF)과 혈액 채취는 전임상 및 임상 연구 모두에서 뇌전증의 바이오마커를 식별하고 검증하는 데 중요합니다 1,2. 오늘날 뇌전증의 진단과 뇌전증 바이오마커에 대한 대부분의 연구는 EEG 및 신경영상에 초점을 맞추고 있습니다 3,4,5. 그러나 이러한 접근 방식에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 일상적인 두피 측정 외에도 많은 경우 EEG는 깊이 전극6과 같은 침습적 기술을 필요로 한다. 뇌 영상 기법은 시간적, 공간적 해상도가 낮고 상대적으로 비용과 시간이 많이 든다 7,8. 이러한 이유로, 비침습적, 저비용, 생체유체 기반 바이오마커의 식별은 매우 매력적인 대안을 제공할 것입니다. 또한 이러한 생체 유체 바이오마커를 사용 가능한 진단 접근법과 결합하여 예측성을 높일 수 있습니다.
뇌전증 진단을 받은 환자는 일상적으....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 실험 절차는 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 1986년 11월 24일 유럽 공동체 위원회 지침(86/609/EEC)에 설명된 지침에 따라 페라라 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 이탈리아 보건부(승인: DM 603/2022-PR)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 쥐 CSF의 작은 비코딩 리보핵산(sncRNA) 및 간질 동물의 EEG 제어 하에 얻은 혈장의 추가 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 분석을 위해 특별히 조정됩니다. 선택에 따라 수술에 대한 더 나은 이해와 개선을 위해 관련 JoVE 비디오를 참조하십시오 19,20,21.
1. 전극 또는 텔레미터의 외과적 이식을 위한 동물의 준비
참고: 입체 수술 기법은 사용되는 EEG 시스템에 따라 다릅니다. 다음 방법 섹션에서는 두 가지 유형의 수술에 공통적으로 적용되는 단계에 대해 설명합니다.
- Sprague-Dawley(SD) 쥐(수컷, 생후 7-8주, 체중 250-290g)를 실험실 동물의....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
9명의 대조군과 18마리의 만성 간질 쥐에서 수행된 다양한 CSF 및 혈액 인출 절차의 결과는 모두 SE 후 1개월에 전극을 이식한 것으로 성공률 측면에서 보고됩니다. 이식 후, 모든 쥐는 1개월 동안 비디오 EEG를 모니터링했으며, 그 동안 실험의 마지막 2주 동안(즉, SE 후 52, 55, 58, 61 및 64일, dpSE) 3일마다 CSF와 혈액을 5회 인출했습니다. 서로 다른 동물에서 여러 번 인출한 데이터를 사용하여 쌍두종 임플란트 부여 쥐(뇌척수액 인출을 위해 캐뉼레이션)의 뇌척수액 채취 성공률과 테더 또는 원격 측정 전극을 이식한 동물에서만 뇌척수액 채취 성공률(수조 마그나 천자에 의해 수행)을 비교했습니다(표 1). 다른 동물에서 진공 채혈 또는 꼬리 착유가 혈장 샘플의 품질에 미치는 영향을 평가했습니다(표 2). 이를 위해 유리 헤모글로빈의 검출을 위해 414nm의 UV 분광 광도법 분석이 사용되었습니다. 통계 분석에는 상용 소프트웨어가 사용되었으며,.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본 연구는 쥐의 뇌척수액 및 채혈 기술을 쉽게 습득할 수 있는 방법을 보여주며, 이는 간질 모델뿐만 아니라 알츠하이머, 파킨슨 또는 다발성 경화증과 같은 다른 신경학적 상태 또는 질병의 연구에도 유용할 수 있습니다. 간질 연구에서 비디오 EEG와 결합된 샘플링 절차는 서로 다른 용해성 분자의 수준과 발작 활동 사이의 상관 관계를 추구할 때 이상적입니다. 이러한 특별한 이유로, i) 간질을 정확하게 진단하기 위해, ii) 질병 진행의 여러 단계를 모니터링하기 위해, 및/또는 iii) 샘플링과 자연 발작의 발생을 연관시키기 위해 연속적인 비디오 EEG 기록이 사용되었습니다. 이러한 샘플링 기술은 마취된 쥐에서 수행될 수 있으며, 따라서 최소한의 스트레스를 유발합니다.
중요한 단계, 문제 해결, 방법 제한 사항
프로토콜에는 몇 가지 중요한 기술 단계가 있습니다. 첫째, 첫 번째 시도에서 CSF 채취를 위한 올바른 장소를 찾기가 어려울 수 있습니다. .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 보조금 계약 964712(PRIME, M. Simonato)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Work Programme(H2020-FETOPEN-2018-2020)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 혈액 채취 세트 BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | 재료 |
| 원심분리기 냉장 ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, 버킹엄셔, 영국 | 112000033 | 재료 |
| 면 봉합사 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, | Italy 105183014 (AIC) | 솔루션 |
| 원격 측정 EEG의 디지털 비디오 8채널 미디어 레코더 시스템 설정 | Data Sciences International(DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | 장비 |
| 테더 EEG 설정 | 의 디지털 비디오 감시 시스템EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | 안정화 |
| 과산화물 및 4차 암모늄 활성을 기반으로 하는 장비 소독제 | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| 더미 가이드 캐뉼라 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, 스웨덴 | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL | Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μ Cuvette G1.0 | Eppendorf AG, 함부르크, 독일 | 6138 | |
| 장비 쥐용 수유 바늘 유연한 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | 장비 (AS40 증폭기, 헤드 박스, 상호 연결 케이블, 텔레팩터 모델 RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 ( AIC) | 솔루션 |
| 염화 리튬 | Sigma-Aldrich, 밀라노, 이탈리아 | L9650 | 재료 |
| 미세 사출 캐뉼러 31G 9mm | Agn Tho's, Lindigö 스웨덴 | CXMI-9 | 재질 |
| MP150 모듈식 데이터 수집 및 분석 시스템 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | 장비 |
| 안과 수의사 연고, Hylo night | Ursapharm, 밀라노, 이탈리아 | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH 7.0 | 용액 | |
| 스코폴라민 하이드로브로미드 삼수화물 | 시그마-알드리치, 밀라노, 이탈리아 | S2250 | 재질 |
| 스코폴라민 메틸 니트레이트 | 시그마-알드리치, 밀라노, 이탈리아 | S1876 | 재질 |
| 은 설파디아진 1% 크림 | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental 메타크릴 시멘트 | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | 재료 |
| 스테레오택시 장치 | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | 모델 963 | 장비 |
| 설탕 용액 | 10% 증류수 중 자당 | 만든 | 용액 |
| 주사기 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, 미국 | CTA-F40 | 재료 |
| 텔레메트리 EEG 트레이스 분석기 | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | 하드웨어 플러스 소프트웨어 Ponemah 코어 6.51 | 장비 |
| 자일라진 염산염 | 시그마-알드리치, 밀라노, 이탈리아 | X1251 | 재질 |
참고문헌
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dl....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
