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방법 논문

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

2.5K 조회수

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DOI:

10.3791/65771

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2023년 10월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 Xenopus laevis 올챙이의 망막 손상 또는 망막 변성을 유도하기 위한 몇 가지 프로토콜을 개발했습니다. 이 모델은 망막 재생 메커니즘을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다.

초록

망막 신경 퇴행성 질환은 실명의 주요 원인입니다. 연구되고 있는 수많은 치료 전략 중에서, 자가 회복을 자극하는 것이 최근 특히 매력적인 것으로 떠올랐다. 망막 복구를 위한 세포의 관심 원천은 뮐러 신경교세포(Müller glial cell)로, 줄기세포의 잠재력과 아남니오트의 놀라운 재생 능력을 가지고 있습니다. 그러나 이 잠재력은 포유류에서 매우 제한적입니다. 재생 능력이 있는 동물 모델에서 망막 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구하면 포유류 뮐러 세포의 망막 재생 잠재 능력을 잠금 해제하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이는 재생 의학의 치료 전략 개발을 위한 핵심 단계입니다. 이를 위해 우리는 Xenopus에서 기계적 망막 손상, 니트로환원효소 매개 광수용체 조건부 절제를 허용하는 형질전환 라인, CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃을 기반으로 하는 색소성 망막염 모델, 안구 내 CoCl2 주입에 의한 세포독성 모델 등 여러 망막 손상 패러다임을 개발했습니다. 장점과 단점을 강조하면서 다양한 퇴행성 조건을 생성하고 Xenopus의 망막 재생을 연구할 수 있는 이 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.

서론

전 세계 수백만 명의 사람들이 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성(AMD)과 같은 실명으로 이어지는 다양한 망막 퇴행성 질환으로 고통받고 있습니다. 현재까지 이러한 질환은 대부분 치료가 불가능한 상태로 남아 있습니다. 현재 평가 중인 치료 접근법에는 유전자 치료, 세포 또는 조직 이식, 신경 보호 치료, 광유전학 및 보철 장치가 포함됩니다. 또 다른 새로운 전략은 줄기 세포 잠재력을 가진 내인성 세포의 활성화를 통한 자가 재생을 기반으로 합니다. 망막의 주요 신경교세포(glial cell) 유형인 뮐러(Müller) 신경교세포(glial cell)는 이러한 맥락에서 관심의 세포 공급원 중 하나입니다. 손상을 입으면 분화, 증식 및 뉴런 1,2,3을 생성할 수 있습니다. 이 과정은 제브라피시나 제노푸스에서는 매우 효과적이지만 포유류에서는 대체로 비효율적입니다.

그럼에도 불구하고, 유사분열 단백질을 사용한 적절한 치료 또는 다양한 요인의 과발현이 포유류 뮐러 신경교세포 세포 주기 재진입을 유도할 수 있고, 어떤 경우에는 후속 신경 발생 헌신 1,2,3,4,5를 유발할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이것은 치료에 크게 불충분하다. 따라서 재생의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 지식을 늘리는 것은 Müller 줄기 유사 세포 특성을 새로운 세포 치료 전략으로 효율적으로 전환할 수 있는 분자를 식별하는 데 필요합니다.

이 목표를 가지고 우리는 Xenopus에서 망막 세포 퇴화를 유발하는 몇 가지 손상 패러다임을 개발했습니다. 여기서는 (1) 세포 유형에 특이적이지 않은 기계적 망막 손상, (2) 간상 세포를 표적으로 하는 NTR-MTZ 시스템을 이용한 조건부 및 가역적 세포 절제 모델, (3) 진행성 간상 세포 퇴화를 유발하는 색소성 망막염 모델인 CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃, (4) CoCl2를 제시합니다-용량에 따라 원추세포를 특이적으로 표적으로 삼거나 더 넓은 망막 세포 변성을 유발할 수 있는 유도 세포독성 모델. 각 패러다임의 특징, 장점 및 단점을 강조합니다.

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프로토콜

동물 관리 및 실험은 기관 면허 A91272108에 따라 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 기관 동물 관리 위원회 CEEA #59의 승인을 받았으며 참조 번호 APAFIS #32589-2021072719047904 v4 및 APAFIS #21474-2019071210549691 v2로 Direction Départementale de la Protection des Populations의 승인을 받았습니다. 이러한 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 기계적 망막 손상

참고: 여기에 설명된 부상 패러다임 프로토콜은 올챙이 45단계부터 기계적 망막 천자로 구성됩니다. 따라서 특정 망막 세포 유형을 표적으로 삼는 것이 아니라 천자 부위의 망막 전체 두께를 손상시킵니다.

  1. 올챙이 마취제의 준비
    1. benzocaine의 10% 원액을 준비하십시오. 총 부피 10mL의 경우 벤조카인 1g, 디메틸설폭사이드(DMSO) 2mL, 프로필렌 글리콜 8mL를 추가합니다. 원액을 4°C에서 몇 달 동안 보존하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오.
    2. 올챙이 사육수(여과 및 탈염소 수돗물) 50mL에 10% 벤조카인 원액 25μL를 첨가하여 사용 시 0.005% 벤조카인 용액을 준비합니다. 잘 섞는다.
      참고: 올챙이가 성인에 비해 마취에 매우 민감하기 때문에 벤조카인의 농도가 특히 낮습니다.
  2. 핀 준비
    1. 0.2mm 직경의 멸균 핀을 멸균된 핀 홀더에 부착합니다(그림 1A).
  3. 올챙이 마취
    1. 담그기 그물을 사용하여 수조에서 올챙이를 잡습니다. 0.005% 벤조카인 용액을 포함하는 새 탱크로 옮깁니다. 올챙이가 자극에 반응하지 않을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오(탱크를 두드리거나 직접 접촉).
      알림: 여러 올챙이를 동시에 마취할 수 있지만 마취액에 소요되는 시간은 30분 미만이어야 합니다.
  4. 망막 천자
    1. 숟가락을 사용하여 올챙이 한 마리를 잡고 물티슈가 들어 있는 작은 페트리 접시(직경 55mm)에 조심스럽게 올려 놓습니다. 올챙이 등쪽을 페트리 접시 중앙에 위로 향하게 놓습니다.
    2. 실체현미경으로 핀이 망막을 통과할 때까지 눈의 등쪽에 핀을 부드럽게 삽입하여 망막에 구멍을 뚫습니다(그림 1A). 여러 번 찌르기가 필요한 경우 다른 위치에서 이 절차를 반복합니다. 오른쪽 눈을 찔린 후 페트리 접시를 180° 돌려 왼쪽 눈을 찔렀습니다.
    3. 병변이 있는 올챙이를 페트리 접시를 조심스럽게 담가 1L의 사육수가 들어 있는 큰 탱크로 옮깁니다. 올챙이가 완전히 깨어날 때까지 관찰하십시오.

2. NTR-MTZ 시스템을 이용한 조건부 간상세포 절제

이 프로토콜은 프랑스 Xenopus 리소스 센터를 호스팅하는 TEFOR Paris-Saclay의 zootechnics 서비스에서 사용할 수 있는 Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) 형질전환 라인6에서 특정 막대 세포 절제를 유도하는 것을 목표로 합니다. 이 화학유전학적 시스템은 NTR(nitroreductase) 효소의 용량을 사용하여 전구약물 메트로니다졸(MTZ)을 세포독성 DNA 가교제로 전환하여 NTR 발현 막대를 특이적으로 제거합니다(그림 1B). Tg(rho:GFP-NTR) 또는 Tg(rho:NTR) 형질전환 동물을 만들고 퇴행을 유도하는 두 가지 상세한 프로토콜이 이전에 발표되었습니다 7,8. 여기서는 망막 변성의 유도와 생체 내 변성 과정을 모니터링하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

  1. 메트로니다졸 용액의 제조
    1. 사용 시 10mM MTZ 용액을 0.1% DMSO가 함유된 올챙이 사육수 1L에 어두운 병에 녹여 10mM MTZ 용액을 준비합니다.
      알림: MTZ는 빛에 민감합니다. 완전히 용해되는 데 최대 10분이 소요될 수 있습니다.
  2. Tg(rho:GFP-NTR) 계통에서 자연 교배에 의한 형질전환 올챙이 생성
    참고: 형질전환 수컷은 귀중한 혈통이기 때문에 수컷을 희생하지 않고 반복적으로 사용하기 위해 자연 교배를 통해 배아를 생성하는 것을 선호합니다.
    1. 호르몬 투여
      1. 600 IU의 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (hCG)을 25G 바늘로 Xenopus laevis 야생형 암컷의 등쪽 림프낭에 주입합니다. hCG가 100-200 I.U.인 형질전환 수컷을 등쪽 림프낭에 주입합니다. 간상 변성의 실시간 모니터링(2.4단계)을 위해 색소 대신 알비노 제노푸스를 사용하여 생성된 형질전환 올챙이의 눈 전체의 형광 변화를 더 잘 시각화합니다.
        참고: Xenopus 암컷은 계획된 배란 1-7일 전에 50IU의 hCG를 준비할 수 있지만 이는 선택 사항입니다.
    2. 짝짓기 및 알 수집
      1. hCG 주입 직후, 다음 날까지 20°C에서 Tg(rho:GFP-NTR) 형질전환 남성 1명과 hCG 주입 여성 1마리를 탱크에 넣는다. 큰 부피(최소 10L)를 사용하고 알이 붙을 작은 물체를 추가하여 어른의 움직임에 의해 알이 손상되지 않도록 합니다. 다음 날, 개구리가 더 이상 암플렉서스에 있지 않으면 수조에서 성체를 꺼내 배아를 채취합니다.
    3. 배아와 올챙이 키우기
      1. 제노푸스 발달의 정상 표에 따라 배아와 올챙이병기 9.
      2. 올챙이를 기르는 물로 가득 찬 수조에서 배아를 키운다. 스테이지 45부터는 올챙이에게 튀김 가루 먹이를 먹이고 버블러로 물에 산소를 공급한다. 증발을 보상하기 위해 필요한 경우 매일 물을 추가하고 매주 전체 탱크 물을 교체하십시오.
        알림: 또는 일주일에 두 번 볼륨의 50%를 교환할 수도 있습니다. 자세한 프로토콜은10에서 찾을 수 있습니다.
    4. 형질전환 배아 분류
      1. 37/38 단계부터 GFP를 직접 시각화하여 형광 실체현미경으로 형질전환 배아를 분류하고 선택합니다(그림 1C).
  3. 올챙이 MTZ 치료
    1. 형질전환 올챙이를 10mM MTZ 용액이 들어 있는 탱크에 Tg(rho:GFP-NTR) 로 옮기고 20°C의 어둠 속에서 1주일 동안 사육합니다. 0.1% DMSO를 함유한 올챙이 사육수에서 자란 형질전환 형제를 대조군으로 사용하십시오.
    2. 치료 기간 동안 MTZ와 대조 용액을 이틀에 한 번씩 교체하십시오. MTZ 치료 중에 평소와 같이 올챙이에게 먹이를 줍니다.
    3. 개별 형광 모니터링(2.4단계)의 경우 2.3.1단계부터 30mL의 MTZ 또는 대조 용액이 담긴 작은 용기에 각 올챙이를 넣습니다.
      알림: MTZ 치료는 45단계부터 언제든지 수행할 수 있습니다.
  4. 로드 변성의 실시간 모니터링
    알림: 막대의 점진적인 변성을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 따라서 2.4.1단계를 수행합니다. 을 2.4.4로 변경합니다. MTZ 치료 전과 치료 후 정기적으로.
    1. 마취제와 올챙이 마취를 준비하기 위해 각각 1.1단계와 1.3단계를 따릅니다.
    2. 숟가락을 사용하여 올챙이 한 마리를 잡고 작은 페트리 접시(직경 55mm)의 젖은 티슈에 조심스럽게 올려 놓습니다. 형광 실체현미경(여기 파장 = 488nm, 방출 파장 = 509nm)으로 GFP 형광을 관찰하고 눈 사진을 촬영합니다. 감소된 형광 강도는 간상체의 열화를 반영합니다.
      참고: 정량적 비교를 하려면 모든 올챙이를 이미징할 때 동일한 설정을 유지해야 합니다.
    3. 페트리 접시를 조심스럽게 담가 1L의 사육수가 들어 있는 큰 탱크로 이미지 올챙이를 옮깁니다. 올챙이가 완전히 깨어날 때까지 관찰하십시오.
    4. MTZ 처리된 올챙이 눈과 대조군 올챙이 눈 사이의 형광 강도를 비교하여 퇴행 과정의 효능을 모니터링하고 평가합니다.

3. CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃에 의한 간상세포 변성

참고: 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃을 사용하여 특정 막대 세포 변성을 유도하여 Xenopus laevis의 색소성 망막염 모델을 생성하기 위해 설정되었습니다. F0의 삽입-삭제(indels) %는11에서 제공되며 ~75%입니다. 이러한 CRISPR/Cas9 매개 로돕신 녹아웃은 Xenopus tropicalis 올챙이 11에서도 수행될 수 있습니다.

  1. 용액 및 시약의 준비
    1. crRNA 및 tracrRNA 순서 지정
      1. 로돕신(rho) 유전자를 표적으로 하는 합성 CRISPR RNA(crRNA)와 표준 trans-activating crRNA(tracrRNA)를 구입하십시오. crRNA는 rho 표적 특이적 영역(GCUCUGCUAAGUAAUACUGA)과 tracrRNA에 하이브리드화되는 또 다른 영역(GUUUUAGAGCUAUGCU)으로 구성됩니다.
    2. crRNA:tracrRNA 듀플렉스 (rho gRNA duplex)
      1. crRNA 및 tracrRNA를 뉴클레아제가 없는 이중 완충액에서 100μM로 재현탁시킵니다.
      2. 3μL의 100μM rho crRNA, 3μL의 100μM tracrRNA 및 94μL의 이중 완충액을 혼합하여 gRNA 듀플렉스를 준비합니다. 최종 농도는 36ng/μL rho crRNA 및 67ng/μL tracrRNA입니다.
      3. 올리고를 95°C에서 5분 동안 가열하여 어닐링하고 천천히 실온으로 식힙니다. 부분 표본을 만들어 -20 °C에서 보관하십시오.
    3. CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체(즉, gRNA 듀플렉스/Cas9 단백질)
      1. 사용시 rho gRNA 듀플렉스와 Cas9 단백질의 혼합물을 준비합니다. 20μL의 경우 rho gRNA 듀플렉스 용액 10μL, Cas9 단백질 2μL(스톡 5mg/mL), 플루오레세인 라이신 덱스트란 2μL(스톡 10mg/mL) 및 RNase가 없는 물 6μL를 추가합니다.
      2. 리보핵단백질 복합체를 형성하려면 37°C에서 10분 동안 배양하고 용액을 실온으로 식힙니다.
      3. 대조군 용액 20μL의 경우 Cas9 단백질 2μL, 플루오레세인 라이신 덱스트란 2μL, RNase가 없는 물 16μL를 혼합합니다.
    4. 10x, 1x 및 0.1x MBS 솔루션 준비
      1. 유형 II 물 800mL에 HEPES 11.92g, 염화나트륨(NaCl) 51.43g, 염화칼륨(KCl) 0.75g, 중탄산나트륨(NaHCO3) 2.1g, 황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4, 7H2O) 2.46g을 첨가하여 변성 바르트 식염수 원액(10x MBS)을 제조합니다. 7.8% 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 30으로 조정합니다. 부피가 1L가 될 때까지 유형 II 물을 추가하고 고압멸균으로 멸균합니다. 실온에서 보관하십시오.
      2. 유형 II 물에 100mL의 10x MBS 염 용액과 7mL의 0.1M 염화칼슘 이수화물(CaCl2, 2H2O)을 희석하여 1x MBS 용액 1L를 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
      3. 유형 II 물에 0.1x MBS 용액 1을 희석하여 1x MBS 용액을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
    5. 성인을 위한 Benzocaine 해결책
      1. 올챙이 사육수 1L에 10% 벤조카인 원액 5mL(1.1.1단계 참조)를 첨가하여 0.05% 벤조카인 용액을 준비합니다. 잘 섞는다.
        알림: 이 용액을 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하여 4°C에서 몇 달 동안 보존하십시오. 동물에게 사용하기 전에 용액을 실온에 두십시오.
    6. L-시스테인 용액
      1. 0.1x MBS 용액 100mL에 L-시스테인 염산 일수화물 2g을 첨가하여 사용 시 제일리 제거 용액을 준비합니다. 7.8% NaOH로 pH를 30으로 조정합니다.
    7. 폴리자당 용액
      1. 0.1x MBS 용액 100mL에 폴리수크로스 3g을 첨가하여 고밀도 폴리수크로스 용액을 준비합니다. 이 용액을 4°C에서 몇 주 동안 보관하십시오.
  2. 체외 수정 및 탈제화
    참고: Xenopus 체외 수정에 대한 자세한 내용은12의 자세한 전용 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.
    1. 배란을 유도하기 위해 Xenopus laevis 암컷에 호르몬 투여
      1. 난모세포 채취 약 15시간 전에 hCG 600IU를 암컷의 등쪽 림프낭에 주입하고 18°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
    2. 고환 박리
      1. Xenopus 남성을 10-15 분 동안 0.05 % benzocaine 용액의 치사량으로 안락사시킵니다. 보완적인 안락사 방법으로, 날카롭고 튼튼한 가위로 두개골 바로 뒤의 척추를 절단합니다. 해부 가위로 복강을 열고 고환을 잘라내고 붙어있는 지방과 모세 혈관을 잘라냅니다. 각 고환을 1x MBS 1mL의 얼음 위에 즉시 놓습니다.
    3. 정자 준비
      1. 미세 원심분리 튜브용 유봉을 사용하여 하나의 고환을 분쇄하고 9mL의 1x MBS가 들어 있는 15mL 튜브에 현탁액을 희석합니다. 두 번째 고환관에 10μg/mL의 겐타마이신을 추가하고 추가 수정 실험을 위해 며칠 동안 4°C에서 유지합니다.
    4. 체외 수정
      1. 호르몬을 주입한 여성의 등을 부드럽게 마사지하고 페트리 접시(직경 100mm)에 난모세포를 모은다. 정자 용액을 난모세포에 몇 방울 떨어뜨립니다. 5분 정도 기다렸다가 0.1x MBS로 덮습니다. 제젤리 제거를 진행하기 전에 10분 정도 기다리십시오.
    5. 수정란 제젤리 제거
      1. 0.1x MBS 용액을 제질 제거 용액으로 교체하여 수정란에서 젤리 코트를 제거합니다(~5분). 배아를 0.1x MBS로 5-6회 철저히 헹구고 0.1x MBS로 채워진 새로운 100mm 페트리 접시에 옮깁니다.
  3. 미세 주입 시스템의 준비
    1. 마이크로피펫 풀러로 유리 모세관 연마13.
    2. 마이크로로더 팁을 사용하여 날카롭게 된 모세관에 2-10μL의 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체 또는 대조 용액을 채우고 모세관을 마이크로인젝터 핸들러에 넣습니다.
    3. 실체현미경의 최고 배율에서 미세한 집게로 모세관 팁을 떼어내고 주입 시간(~400ms)을 조정하여 펄스당 10nL의 배출량을 얻습니다. 배출 압력을 약 40PSI로 설정합니다.
  4. CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체를 사용한 단세포 단계 배아 미세주입
    1. 3% 폴리자당 용액으로 채워진 100mm 페트리 접시에 접착된 격자(1mm 나일론 조직)에 단세포 단계 배아를 놓습니다(그림 1D).
    2. 미세인젝터를 사용하여 실체현미경으로 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체 10nL(배아당 gRNA 듀플렉스 500pg + Cas9 단백질 5ng에 해당) 또는 대조 용액을 세포질막 바로 아래 피질 영역의 동물 극 수준에서 주입합니다.
      참고: 용액에 포함된 플루오레세인 라이신 덱스트란은 주입된 배아의 후속 분류를 허용합니다.
    3. 주입된 배아를 깨끗한 폴리자당 용액이 들어 있는 새로운 100mm 페트리 접시에 옮기고 21°C에 둡니다.
    4. 첫날에는 잘 발달된 배아를 정기적으로 분류하고 미세주입 후 약 5시간 후에 폴리자당 용액을 0.1x MBS로 교체합니다.
    5. 주입 후 24시간 동안 기다렸다가 형광 실체현미경으로 형광 실체현미경으로 잘 주입된 rho crispant 배아를 분류하고 선택합니다(그림 1E).
      알림: 수정 후 미세 주입이 빠를수록 녹아웃이 더 효과적입니다.
  5. 배아와 올챙이 키우기
    1. 페트리 접시에서 0.1x MBS로 rho crispant 배아를 37/38단계까지 키웁니다. 죽은 배아를 매일 제거하고 0.1x MBS 용액을 교체합니다. 37/38단계부터는 올챙이 사육수가 채워진 수조에서 배아를 키우고, 45단계부터는 2.2.3단계와 같이 진행한다.

4. 세포독성 안구내 CoCl 2 주사에 의한 망막 세포 변성

참고: 이 프로토콜은 Xenopus laevis 올챙이에서 염화코발트(CoCl2)의 안구 내 주사로 망막 세포 퇴화를 유도하기 위해 확립되었습니다. 투여량에 따라, 원뿔 특이적 변성 또는 더 넓은 변성을 유발할 수 있다14. 우리는 48단계부터 나이가 든 Xenopus laevis 올챙이에서 이 프로토콜을 사용합니다. Xenopus tropicalis 올챙이에도 사용할 수 있습니다.

  1. 완충액 및 시약의 준비
    1. 0.005 % 벤조카인 용액을 1.1 단계와 같이 사용시 준비합니다.
    2. 0.1x MBS의 5mL에 118.5mg을 첨가하여 100mMCoCl2 원액을 준비합니다(0.1x MBS를 제조하려면 3.1.4단계 참조). 이 원액을 4°C에서 몇 달 동안 보존하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오.
      주의 : CoCl2 는 인간과 동물의 독성 화합물로 분류됩니다. 안전보건자료의 취급, 보관 및 폐기물 처리 지침을 주의 깊게 따르십시오.
    3. 원뿔 특이적 변성의 경우, 0.1x MBS로 희석된 100mM 원액으로부터 사용 시 10mM CoCl2 용액을 준비합니다. 더 광범위한 망막 세포 변성을 위해 25mM CoCl2 용액을 준비합니다.
  2. 주입 시스템의 준비
    1. 마이크로피펫 풀러로 유리 모세관 연마 13.
    2. 마이크로로더 팁을 사용하여 2-10μL의 10 또는 25mM CoCl2 용액 또는 대조 용액(0.1x MBS)으로 날카롭게 된 모세관을 채우고 모세관을 마이크로인젝터 핸들러에 넣습니다.
    3. 실체현미경의 최고 배율에서 미세한 집게로 모세관 팁을 떼어내고 주입 시간(약 100ms)을 조정하여 펄스당 15-40nL의 배출량을 얻습니다. 배출 압력을 ~40PSI로 설정합니다.
      알림: 방울의 크기는 올챙이의 단계와 눈의 크기에 맞게 조정해야 합니다. 예를 들어, 48-49단계에서 입자 크기는 ~15-20nL인 반면, 52-56단계에서는 30-40nL입니다. 시각적으로 물방울의 크기는 렌즈 크기보다 약간 큽니다.
  3. CoCl2 안내 주사
    1. 담그기 그물을 사용하여 수조에서 올챙이를 잡습니다. 50mL의 0.005% 벤조카인 용액으로 옮깁니다. 올챙이가 자극에 반응하지 않을 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.
      알림: 여러 올챙이를 동시에 마취할 수 있지만 마취에 소요되는 시간은 30분 미만이어야 합니다.
    2. 숟가락을 사용하여 올챙이 한 마리를 잡고 물티슈가 들어 있는 작은 페트리 접시(직경 55mm)에 조심스럽게 넣습니다. 올챙이 등쪽을 페트리 접시 중앙에 위로 향하게 놓습니다(그림 1F,G).
    3. 실체현미경 아래의 미세인젝터를 사용하여 CoCl2 용액을 안구 내 주사합니다. 모세혈관을 수정체 위의 눈에 부드럽게 삽입합니다. 모세혈관 끝이 눈 안에 있을 때 눈당 두 방울을 배출합니다. 오른쪽 눈을 주입한 후 페트리 접시를 수동으로 180° 돌려 왼쪽 눈을 주입합니다.
      알림: 주사가 눈 안에서 이루어졌는지 확인하십시오., 따라서 용액을 배출할 때마다 눈이 약간 붓는 것이 보여야 합니다. 올챙이는 가능한 한 물 밖에 머물러야 합니다. 양쪽 눈의 주사는 1분 미만이 소요됩니다.
    4. 주입된 올챙이를 페트리 접시에 조심스럽게 담가 1L의 사육수가 들어 있는 큰 탱크로 옮깁니다(그림 1H). 올챙이가 완전히 깨어날 때까지 관찰하십시오.

5. 망막 손상 또는 망막 변성을 평가하기 위한 염색

  1. 올챙이 고정과 탈수
    1. 4% PFA 용액 100mL를 32mL의 1x PBS에 희석하여 1% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비합니다. NaOH로 pH를 7.4로 조정합니다. 이 원액을 분취하여 -20 °C에서 몇 달 동안 보존하십시오.
    2. 올챙이를 0.01% 벤조카인으로 안락사시키고 4% PFA가 함유된 바이알에 넣어 실온에서 교반하면서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 옮깁니다. 1x PBS에서 3 x 5 분 동안 헹굽니다.
    3. 올챙이를 70% 및 95% 에탄올(유형 II 물에 희석)에서 30분 동안 연속적으로 배양한 다음 100% 에탄올에서 1시간 배양을 3회 더 진행하여 점진적으로 탈수합니다. 올챙이 머리를 -20 °C에서 보관하거나 추가 단계를 위해 밤새 100% 부탄올로 직접 옮깁니다.
  2. 파라핀 절편
    1. 100% 부탄올을 녹인 파라핀으로 62°C에서 2시간 동안 교체합니다. 62 °C에서 2 x 2 시간의 추가 배양을 위해 파라핀을 교체합니다.
    2. 올챙이 머리를 일회용 파라핀 내장 몰드에 옮기고 눈이 잘 정렬되도록 방향을 지정한 다음 파라핀이 굳도록 합니다. 블록을 실온에 보관하십시오.
    3. 여분의 파라핀을 다듬고 마이크로톰 지지대에 올챙이가 내장된 블록을 장착합니다.
    4. 적절한 두께(10-12μm)의 마이크로톰으로 블록을 절단합니다. 이전에 3% 글리세린 알부민(물에 희석)으로 덮인 슬라이드에 섹션이 있는 리본을 옮깁니다.
    5. 슬라이드를 42°C의 슬라이드 워머에 몇 분 동안 놓고 과도한 글리세린 알부민을 제거합니다. 슬라이드를 37°C의 오븐에서 밤새 건조시킵니다.
    6. 2% 크실렌으로 채워진 코플린 병에 슬라이드를 15 x 100분 동안 담가 왁스를 제거합니다. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈로 섹션을 재수화하십시오 : 100 % 두 번, 70 %, 50 % (유형 II 물에 희석), 각각 ~ 5 분, 물에서 2 x 5 분.
  3. 면역형광 라벨링
    1. 29.4g의 구연산나트륨 삼나트륨염 이수화물(C6H5Na3O7, 2H2O) 1L를 Type II 물 1L에 첨가하여 100mM 구연산나트륨(CiNa) 원액을 제조합니다. 염산(HCl)으로 pH를 6으로 조정합니다. 고압 멸균으로 멸균하고 실온에서 몇 달 동안 보관하십시오. 225mL의 Type II 물에 100mM CiNa 원액 25mL를 첨가하여 사용 시 마스킹 해제 용액을 준비합니다. 125μL의 Tween-20을 넣고 잘 혼합합니다(최종 농도는 10mM CiNa, 0.05% Tween-20).
    2. 유형 I 물 10mL에 bisBenzimide H 33258 100mg을 첨가하여 Hoechst 원액을 10mg/mL로 준비합니다. 이 원액을 4°C에서 몇 달 동안 보존하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하십시오. 300mL의 Hoechst 원액을 1x PBS 400mL에 추가하여 7.5μg/mL의 Hoechst 용액을 준비합니다.
      알림: 이 용액은 최대 10회까지 사용할 수 있으며 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호하여 4°C에서 약 6개월 동안 보존할 수 있습니다.
    3. 섹션을 탈왁스한 후 마스킹 해제 용액에서 섹션을 9분 동안 끓여 항원 회수를 수행합니다. 용액을 20분 동안 식히십시오.
    4. 유형 II 물에 한 번, 1x PBS에 한 번 헹굽니다. 슬라이드를 습한 챔버에 평평하게 놓고 슬라이드당 400-600μL의 차단 용액(항체 희석제 + 0.2% Triton X100)을 30분 동안 추가합니다.
    5. 차단 용액을 차단 용액에 희석된 1차 항체의 슬라이드당 200μL로 교체합니다. 커버슬립을 사용하여 용액을 섹션에 펴 바르고 기포가 형성되지 않도록 합니다. 습한 챔버에서 4 °C에서 밤새 배양합니다.
    6. 슬라이드를 코플린 병에 옮기고 0.1% Triton X100이 보충된 1x PBS에서 3 x 10분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 평평하게 놓고 차단 용액에 희석한 2차 항체의 슬라이드당 400μL를 추가하고 습한 챔버에서 실온에서 2시간 동안 그대로 둡니다.
    7. 슬라이드를 코플린 병에 옮기고 0.1% Triton X100이 보충된 1x PBS로 3 x 5분 동안 헹굽니다.
    8. Hoechst 용액으로 10분 동안 세포 핵을 대조염색하고 1x PBS로 3 x 5분 동안 헹굽니다.
    9. 형광을 보존하도록 특별히 설계된 수성 장착 매체의 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 건조시키고 4°C에서 보관합니다.
    10. 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다.
  4. 망막 손상을 평가하기 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
    참고: 면역염색으로 특정 세포 유형을 표지하는 대신 H&E 착색으로 일반 망막 조직학을 평가할 수 있습니다.
    1. 섹션을 탈왁스 한 후 슬라이드를 헤마톡실린 용액에 2 분 동안 담가 핵산 라벨링을 수행합니다. 수돗물로 잘 헹굽니다.
    2. 슬라이드를 1% 에오신 용액에 1분 동안 담가 세포질 라벨링을 수행합니다. 물로 빠르게 헹굽니다.
      참고: 에오신은 매우 용해됩니다. 슬라이드를 물에 너무 오래 두면 모든 염료가 사라집니다.
    3. 2 x 5 분 동안 100 % 에탄올로, 2 x 5 분 동안 자일렌으로 헹굽니다.
    4. 후드 아래에서 장착 매체를 4-5방울 떨어뜨려 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 후드 아래에서 말리고 다음 날 현미경으로 이미지를 촬영합니다.
  5. 자가사멸 세포 검출
    1. 섹션을 탈랍한 후(섹션 5.2.6 참조) 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 자가사멸 DNA 단편화를 검출합니다.
    2. 슬라이드를 Hoechst 용액에 담가 핵 염색을 수행하고(섹션 5.3.8 참조) 형광을 보존하도록 특별히 설계된 수성 장착 매체를 사용하여 장착합니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 건조시키고 4°C에서 보관합니다.
    3. 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다.

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결과

기계적 망막 손상
프로토콜 섹션 1에 설명된 기계적 손상을 입은 올챙이의 망막 절편은 망막 병변이 천자 부위에 국한된 상태로 유지되는 동안 조직의 모든 층을 포함한다는 것을 보여줍니다(그림 2A, B).

NTR-MTZ 시스템을 이용한 조건부 간상세포 절제
프로토콜 섹션 2에 설명된 대로 MTZ 처리로 처리된 마취된 Tg(rho:GFP-NTR) 형질전환 올챙이의 눈을 실체현미경으로 분석했습니다(그림 3A,B). GFP 형광의 감소는 프로토콜 섹션 5(그림 3C)에 설명된 대로 GFP 면역염색에 의해 망막 절편에서 확인된 대조군(그림 3B

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토론

Xenopus 올챙이의 다양한 망막 손상 패러다임의 장점과 단점

기계적 망막 손상
신경 망막의 다양한 외과적 손상은 Xenopus 올챙이에서 발생했습니다. 신경 망막은 완전히 제거되거나 15,16 부분적으로만 절제될 수 있다16,17. 여기에 제시된 기계적 손상은 망막 절제술이 아니라 이전에 Xenopus 올챙이6에서 개발한 간단한 눈 천자를 포함합니다. 이러한 기계적 망막 손상 모델의 수동 절차를 감안할 때, 표현형은 올챙이마다 크게 다를 수 있습니다. 또한 복제 가능성과 손상 정도는 실험을 수행하는 사람에 따라 달...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé)과 협력하여 Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) 및 UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels)의 M.P. 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,2-프로판디올(프로필&에그레이브; ne 글리콜)시그마 알드리치398039
절대 에탄올 ≥ 99.8%VWR chemicals20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 항체 (토끼)세포 신호9661S희석 1/300
Anti-GFP 항체 (닭)AveslabsGFP-1020희석 1/500
Anti-M-Opsin 항체 (토끼)Sigma-AldrichAB5405희석 1/500
Anti-mouse 2차 항체, Alexa Fluor 594 (염소)Invitrogen Thermo ScientificA11005Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 항체(토끼)AbcamAb183951Dilution 1/100
Anti-rabbit 2차 항체, Alexa Fluor 488(염소)Invitrogen Thermo ScientificA11008Dilution 1/1,000
Anti-rabbit 2차 항체, Alexa Fluor 594(염소)Invitrogen Thermo ScientificA11012Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin 항체 (토끼)Sigma-AldrichAB5585Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin 항체 (마우스)Sigma-AldrichMABN15Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin 항체 (토끼)Sigma-AldrichAB5407Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)PromegaG3250
벤조카인 Sigma-AldrichE1501원액 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883원액 10 mg/mL
Butanol-1 ≥ 99.5%VWR 화학 물질20810.298
염화칼슘 이수화물(CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich(Supelco)1.023820.1m
Cas9에서 사용 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Capillary Glass 모델 GC100TF-10Warner Instruments(Harvard Apparatus)30-0038
코발트(II) 염화물 육수화물 (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661재고 용액 100 mM
Coverslip 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab 희석제 AgilentS202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
전자 회전 마이크로톰Thermo ScientificMicrom HM 340E 
Eosin 1% 수성RAL 진단312740
플루오레세인 라이신 덱스트란   Invitrogen Thermo ScientificD1822
형광 실체 현미경OlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
글리세린 알부민 acc. MalloryDiapathE0012물에서 3 % 사용
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)RAL Diagnostics320550
HEPES 칼륨 염Sigma-AldrichH0527
인간 융모성 성선 자극 호르몬호르몬 MSD Animal HealthChorulon 1500
염산 발연, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
L-시스테인 염산염 일수화물Sigma-AldrichC78800.1x MBS(pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H에서 2%로 사용< sub>2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazole Sigma-Aldrich (Supelco)M376110 mM
마이크로로더 팁Eppendorf5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.모델 P-97프로그램 : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
형광 보존을 위한 장착 매체, FluorSave 시약Millipore345789
장착 매체, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 초소형 블레이드Epredia3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
니켈 도금 핀 홀더파인 사이언스 도구26016-12
나일론 여과 티슈 (체질 직물) NITEX, 메시 개구부 1,000 &마이크로; mSefar06-1000/44
DMSO 없이 파라핀 히스토왁스Histolab00403
파라포름알데히드 용액(32%)전자 현미경 과학EM-15714-S1x PBS에서 4%에서 사용 pH 7.4
Peel-A-Way 일회용 임베딩 몰드Epredia2219
유봉VWR431-0094
페트리 접시 100mmCorning GosselinSB93-101
페트리 디쉬 55 mmCorning GosselinBP53-06
인산염 버퍼 식염수 용액 (PBS) 10xEuromedexET330-A
PicoSpritzer Microinjection systemParker Instrumentation ProductsPicoSpritzer III
Pins Fine Science Tools26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400Sigma-AldrichF43750.1x MBS
염화칼륨 (KCl)Sigma-AldrichP3911
분말 튀김 식품 : sera Micron Naturesera45475 (00720)
가위 해부Fine Science Tools14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL 유리VS11171076FKA 
슬라이드 워머Kunz 기기HP-3
염화나트륨 (NaCl)Sigma-AldrichS7653
구연산나트륨 트리소듐 염 이수화물 (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR 화학물질27833.294
탄산수소나트륨 (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
수산화나트륨 30% 수용액(NaOH)VWR 화학 물질28217-292
실체현미경ZeissStemi 2000
주사기 Omnifix-F Solo 일회용 주사기 1 mLB-BRAUN9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)통합 DNA 기술
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC 형광 조명기X-Cite 200DC
크실렌 ≥ 98.5% VWR 화학 물질28975-325
에서 사용 ) 에서 3% 사용1072533

참고문헌

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  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
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  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
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  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
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Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성
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