방법 논문

생쥐의 혈관벽 거주자 CD34+ 줄기 세포의 면역자기 분리

DOI:

10.3791/66193

⸱

2023년 12월 22일

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1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education and Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 혈관벽 상주 CD34+ 줄기세포(CD34+ VW-SC)의 분리, 배양 및 기능적 결정을 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립했습니다. 이 따르기 쉽고 시간 효율적인 분리 방법은 다른 연구자가 심혈관 질환과 관련된 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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상주 CD34+ 혈관벽 상주 줄기 세포(VW-SC)는 혈관 손상 및 복구를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 점점 더 인정받고 있습니다. 기능성 쥐 CD34+ VW-SC를 배양하기 위한 안정적이고 효율적인 방법을 확립하는 것은 다양한 생리학적 및 병리학적 조건에서 이러한 세포의 증식, 이동 및 분화와 관련된 메커니즘을 추가로 조사하는 데 필수적입니다. 설명된 방법은 마그네틱 비드 스크리닝과 유세포 분석을 결합하여 1차 배양 상주 CD34+ VW-SC를 정제합니다. 그런 다음 정제된 세포는 면역형광 염색 및 Ca2+ 이미징을 통해 기능적으로 식별됩니다. 간략하게, 쥐 대동맥 및 장간막 동맥의 외래에서 혈관 세포는 조직 블록 부착을 통해 얻은 다음 세포 수가 1 × 107 이상에 도달할 때까지 하위 배양이 이루어집니다. 그 후, CD34+ VW-SC는 마그네틱 비드 분류 및 유세포 분석을 사용하여 정제됩니다. CD34+ VW-SC의 식별에는 세포 면역형광 염색이 포함되며, 기능적 다능성은 지향적 분화를 위해 세포를 특정 배양 배지에 노출시켜 측정합니다. 또한, ATP, 카페인 또는 탑시가르진(TG)에 노출된 Fura-2/AM 부하 세포에서 상업적으로 이용 가능한 이미징 워크스테이션을 사용하여 기능적 내부 Ca2+ 방출 및 외부 Ca2+ 진입을 평가합니다. 이 방법은 혈관벽 상주 CD34+ 줄기 세포를 분리, 배양 및 식별하기 위한 안정적이고 효율적인 기술을 제공하여 VW-SC의 조절 메커니즘 및 표적 약물 스크리닝에 대한 시험관 내 연구를 위한 기회를 제공합니다.

서론

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혈관 벽은 혈관 발달, 항상성 조절 및 혈관 질환의 진행에 중추적인 역할을 합니다. 최근 몇 년 동안 수많은 연구에서 동맥에 다양한 줄기 세포 계통이 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 2004년 Qingbo Xu 교수 그룹은 성인 혈관 벽 주변에 혈관 줄기/전구 세포가 존재한다고 처음으로 보고했으며, CD34, Sca-1, c-kit 및 Flk-11을 발현했습니다. 이러한 혈관 줄기 세포는 다방향 분화 및 증식 잠재력을 나타냅니다. 정상적인 조건에서는 상대적으로 조용한 상태를 유지합니다. 그러나 특정 요인에 의해 활성화되면 평활근 세포, 내피 세포 및 섬유 아세포로 분화할 수 있습니다. 대안적으로, 그들은 파라크린 효과를 통해 혈관 주위 기질 및 미세혈관 형성을 조절하여 손상된 혈관의 수리 또는 개조를 촉진할 수 있습니다 2,3,4,5,6. 최근에는 대퇴동맥 가이드와이어 손상 후 혈관벽에 상주하는 CD34+ 줄기세포가 내피세포 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다2. 결과적으로, CD34+ VW-SC의 분리 및 정량화와 CD34+ 줄기 세포의 기본 생물학적 특성 검사는 CD34+ VW-SC의 조절과 관련된 신호 경로를 추가로 연구하는 데 중요합니다.

현재 세포 배양 특성 또는 밀도 구배 원심분리와 같은 세포의 물리적 특성에 기반한 기술을 포함하여 세포 분리를 위한 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 이로 인해 많은 비표적 세포를 포함하는 정렬된 세포와 상대적으로 낮은 순도 7,8,9,10,11,12를 얻을 수 있습니다 . 일반적으로 사용되는 또 다른 기술은 형광/자기 보조 세포 분류입니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 높은 기술적 요구 사항을 가진 복잡한 시스템이며, 상대적으로 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 잠재적으로 분류된 세포의 활성에 영향을 미칩니다13,14. 그러나 MACS(magnetic-activated cell sorting)는 회수율과 세포 활성이 높고 다운스트림 응용 분야에 미치는 영향이 적어 더 효율적이고 편리합니다8. 따라서 이 프로토콜에서는 MACS를 적용하여 CD34+ VW-SC를 정제하고 유세포 분석을 통해 세포를 추가로 식별했습니다. 혈관벽 줄기 세포를 연구하기 위한 MACS 기반 분리 방법의 확립은 매우 중요할 것입니다. 첫째, 실험적 유전자 및 세포 생물학 연구를 허용합니다. 둘째, 혈관벽 상주 줄기세포의 효율적인 분리 및 배양은 줄기세포 기능을 조절하는 신호인자에 대한 체계적인 평가와 스크리닝을 가능하게 합니다. 셋째, 줄기세포에서 중요한 표현형을 식별하는 것은 세포 상태를 평가하는 데 중요한 '품질 관리'를 제공합니다. 따라서, 정제 방법을 식별하는 것은 혈관에서 유래한 유사한 줄기 세포에 대한 유사한 응용 분야에 유용할 수 있습니다.

이 보고서는 유세포 분석, 면역형광 염색 및 Ca2+ 신호 측정에 의해 수행되는 세포 식별 및 기능 평가를 포함하여 CD34+ VW-SC의 배양을 위한 안정적이고 신뢰할 수 있는 방법에 대한 자세한 시연을 제공합니다. 이 연구는 CD34+ VW-SC의 기능과 생리학적 및 병리학적 조건에서 조절 메커니즘에 대한 심층적인 연구를 위한 기초를 제공합니다.

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프로토콜

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이 연구는 승인되었으며, 동물은 중국의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 처리되었습니다. 이 연구는 동물윤리위원회(승인번호: SWMU2020664)의 승인을 받아 동물실험의 윤리적 요건을 철저히 준수하였습니다. 본 연구에는 18-20g 무게의 남녀 8주 된 건강한 C57BL/6 마우스가 활용되었습니다. 동물들은 사우스웨스트 의과대학(SWMU)의 실험동물센터에 수용되었다.

1. 대동맥 및 장간막 동맥에서 외래의 조직 블록 배양

  1. 상주 CD34+ VW-SC 절연
    1. 3% 이소플루란 흡입으로 두 마리의 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 발가락 꼬집으로 적절한 마취를 확인합니다. 의료용 테이프로 쥐를 누운 위치에 놓고 70% 에탄올 소독제를 뿌려 쥐의 털을 소독합니다. 멸균 안과 가위와 집게를 사용하여 흉강과 복강을 열어 심장과 장을 노출시킵니다. 분리된 대동맥과 장간막 동맥을 절개한 후 대동맥과 장간막 침대를 실리콘 엘라스토머가 들어 있는 페트리 접시에 고정하고 생리학적 염 용액으로 채웁니다. 다른 멸균 된 가위와 겸자 세트를 사용하여 대동맥과 장간막 동맥 주변의 지방을 빠르게 절개하십시오.
    2. 절개된 조직을 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액이 포함된 6cm 페트리 접시에 옮깁니다( 재료 표 참조). 두 번 헹군 후 동맥을 실체 현미경으로 조직 배양 후드로 옮깁니다.
    3. 동맥을 세로로 자르고 가는 집게를 사용하여 대동맥의 바깥층과 장간막 동맥의 첫 번째 가지를 벗겨냅니다. 0.1-0.2mL의 배양 배지가 들어 있는 3.5cm 페트리 접시에 외부 층을 옮깁니다( 재료 표 참조). 바깥 층을 작은 조각으로 자릅니다 (약 1mm3).
    4. 티슈 조각을 젤라틴 코팅된 T25 플라스크에 옮겨 플라스크 바닥에 고르게 분포되도록 합니다. 세포 크롤링과 성장을 촉진하기 위해 조직 조각 사이에 적당한 거리를 유지하십시오. 플라스크를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 수직으로 3시간 동안 놓아 조직 블록이 플라스크 바닥에 부착되도록 합니다.
    5. 3시간 후 5mL의 DMEM 고포도당 성장 배지를 추가하여 조직 블록을 침지시킵니다. T25 플라스크를 수평으로 향하게 합니다. 3일 간격으로 현미경을 통해 조직 블록 주변의 세포 이동을 모니터링합니다.
      참고: 배지에는 소 태아 혈청 20%, 백혈병 억제 인자(LIF) 0.2%, β-메르캅토에탄올 0.2mM 및 페니실린/스트렙토마이신 1%가 포함되어야 합니다(재료 표 참조). 소 태아 혈청은 세포 증식을 지원하는 반면, LIF와 β-메르캅토에탄올은 세포 분화를 방해합니다 7,8.
    6. T25 플라스크의 세포가 약 80% 합류에 도달하면 하나 또는 두 개의 T75 플라스크로 통과시켜 배양합니다. 적절한 성장과 건강을 보장하기 위해 5개의 통로에 걸쳐 세포를 하위 배양합니다.
  2. 상주 CD34+ 줄기 세포의 자기 분리
    1. 하나 또는 두 개의 T75 플라스크에 있는 세포가 80% 합류도에 도달하면 세포를 트립신으로 해리하고 1mL의 선별 완충액(2mM EDTA 및 0.5% FBS)에 재현탁시킵니다. 셀 번호(107/T75 플라스크)를 측정하고 셀 현탁액을 300 x g 에서 5분(실온에서) 동안 원심분리합니다.
    2. 상층액을 완전히 버리고 총 10,7개의 세포당 98μL의 선별 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 2 μL CD34 항체를 추가합니다(재료 표 참조). 잘 섞고 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 가끔 흔들어 배양합니다.
    3. 2mL의 선별 완충액과 300 x g 의 원심분리기를 추가하여 실온에서 10분 동안 세포를 세척합니다.
    4. 상층액을 신중하고 완전하게 제거하고 80μL의 선별 버퍼에 세포를 재현탁시킵니다.
    5. 20 μL Anti-FITC MicroBeads(총 107 개 세포당, 재료 표 참조)를 완충액에 추가합니다. 반복적인 피펫팅으로 잘 혼합하고 어두운 곳에서 간헐적으로 흔들면서 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
    6. 2mL의 완충액과 300 x g 의 원심분리기를 5분 동안 추가하여 세포를 펠릿으로 2회 세척합니다. 상층액을 완전히 버리고 세포를 1mL의 완충액에 재현탁시킵니다.
    7. 적절한 분리기의 자기장 내에 하나의 MS 컬럼을 배치하여 수집 튜브(예: 15mL 원심분리기 튜브)가 MS 컬럼 아래에 배치되어 분리된 성분을 수집하도록 합니다. ( 재료 표 참조). 500μL 버퍼로 컬럼을 헹구고 완전히 통과될 때까지 기다립니다.
    8. 세포 현탁액을 컬럼에 로드하고 라벨링되지 않은 세포가 포함된 플로우스루를 15mL 튜브에 수집합니다.
    9. 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 15mL 원심분리기 튜브에 놓습니다. 500μL의 완충액을 컬럼에 주입한 다음 플런저를 컬럼에 밀어 넣어 자기 라벨이 부착된 세포를 즉시 씻어냅니다.
    10. CD34+ 세포의 순도를 향상시키기 위해 용리된 분획은 두 번째 MS 컬럼을 사용하여 농축할 수 있습니다. 위에서 언급한 대로 분리 과정을 반복합니다. 유세포 분석을 통해 분류된 세포의 순도를 평가합니다.
      참고: 일반적으로 10%-20%의 CD34+ 세포가 얻어지며 약 70%-80%의 음성 세포와 염색 및 원심분리 절차로 인해 약 10%의 손실이 발생합니다.
    11. 혈관벽 CD34+ 줄기 세포의 순도를 추가로 확인하려면 유세포 분석으로 분류된 세포를 식별합니다. 본 연구는 90% 이상의 순도를 보여주었습니다.

2. 면역형광에 의한 세포 동정

  1. 0.04% 젤라틴으로 사전 코팅된 커버슬립(직경 8mm)의 종자 세포.
  2. 세포가 약 60%-70% 합류점에 도달하면 PBS로 두 번 헹구고 4% 파라포름알데히드로 세포를 10분 동안 고정합니다.
  3. PBS로 세포를 3분(3회) 세척하고 실온에서 5분 동안 0.2% Triton X-100(PBS에서)으로 세포를 투과시킵니다.
  4. PBS로 세포를 3분(3회) 세척하고 5% 당나귀 혈청(PBS에서)으로 항체의 비특이적 결합을 1시간 동안 차단합니다.
  5. 집게로 각 커버슬립의 가장자리를 잡고 보푸라기가 없는 물티슈 시트에 물기를 빼내어 차단 완충액을 제거합니다.
  6. 4°C에서 하룻밤 동안 1% BSA(PBS)에 100배 희석된 1차 항체(CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, 재료 표 참조)에 세포를 배양합니다.
  7. 용액을 디캔팅하고 PBS로 세포를 3분(3회) 세척합니다. Alexa Fluor 488 라벨이 부착된 2차 항체(1% BSA에서 1:200)( 재료 표 참조)로 어두운 어두운 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
  8. PBS에서 DAPI 원액을 0.5μg/mL로 희석하고 5분 동안 세포를 배양하여 DAPI 대조염색을 수행합니다.
  9. PBS로 헹구고 페이드 방지 시약으로 커버슬립을 밀봉합니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

3. CD34+ VW-SC의 유도 분화 및 특성화

  1. CD34+ 줄기 세포를 커버슬립과 6-웰 플레이트에 각각 적절한 밀도(40%-50% 합류)로 파종합니다.
  2. 내피 세포 배양 배지 EBM-2(재료 표 참조)에서 1주일 동안 세포를 배양하여 CD34+ 세포에서 내피 세포 지향 분화를 유도합니다.
  3. 섬유아세포 배양 배지 FM-2(재료 표 참조)에서 3일 동안 세포를 배양하여 CD34+ 세포에서 섬유아세포 지향 분화를 유도합니다.
  4. 미분화 세포와 분화된 세포를 488nm의 레이저 여기와 40x 대물렌즈에서 면역형광 염색(2단계에서 언급)을 실시합니다. 내피 세포 마커(CD31, VWF) 및 섬유아세포 마커(PDGFRα, Vimentin)의 발현을 검출합니다( 재료 표 참조).
  5. 세포를 트립신으로 해리시키고 원심분리(300 x g, 5분, 실온)를 통해 세포 펠릿을 얻습니다. 100 μL의 선별 버퍼로 셀을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 정제된 항마우스 CD16/CD32 mAb(1 μg)( 재료 표 참조)로 4°C에서 5분 동안 사전 배양합니다.
  6. 2 μL의 PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody APC (2 μL, 1:50) 및 CD140a (PDGFRa) Monoclonal Antibody FITC (2 μL, 1:50)를 Mouse Fc Block이 있는 사전 배양 세포에 직접 첨가하고 4°C에서 15분 동안 추가로 배양합니다.
  7. 2mL의 완충액을 추가하고 300 x g 에서 5분(실온) 동안 원심분리기를 추가하여 세포를 펠렛화하여 세포를 2회 세척합니다. 상층액을 완전히 버리고 300μL의 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 염색된 세포가 있는 플로우 튜브를 유세포 분석을 위해 준비된 아이스박스에 넣습니다.

4. 혈관 CD34+ 줄기세포에서 세포내 Ca2+ 신호전달 검출

  1. 최대 70% 밀도에서 실험하기 10시간 전에 커버슬립의 종자 세포.
  2. 커버슬립을 꺼내 바셀린과 함께 맞춤형 챔버 바닥에 부착합니다.
  3. PBS로 커버슬립을 한 번 세척하고 Tyrode 용액(NaCl 137mM, KCl 5.4mM, MgCl2 1.2mM, 포도당 10mM, HEPES 10mM, CaCl2 2.4mM)( 재료 표 참조)에서 Fura-2/AM(5μM)으로 교체하고 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
  4. 푸라-2/AM 탈에스테르화를 위해 티로드의 용액으로 10분 동안 처리하여 염료를 제거합니다.
  5. 모노크로메이터와 CCD 카메라가 포함된 광시야 이미징 시스템이 장착된 도립 형광 현미경의 스테이지에 챔버를 장착합니다( 재료 표 참조).
  6. 메인 창을 열고 Grab Settings 대화 상자와 카메라 페이지로 이동한 다음 라이브 이미지 표시를 위해 라이브 버튼을 누릅니다.
  7. 형광 이미지 유형을 선택하고 340nm/380nm 루프 반복 시간, 이미지 크기 및 카메라 노출 시간을 380nm 및 340nm로 설정하여 최적의 이미지 밝기를 얻을 수 있습니다.
  8. 단일 스냅샷을 찍고 여러 개의 자유형 선을 그려 다양한 색상으로 셀에 원을 그리며 배경을 ROI 0으로 나타내는 ROI(Region of Interest)를 미리 정의합니다.
  9. 작업 영역 보기에서 이미 포함된 프로토콜을 다시 편집하고 새 작업 영역을 만듭니다.
  10. 프로토콜을 실행하면 "Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)"에 온라인 kinetic graph가 표시됩니다.
  11. 숫자 보기에서는 스프레드시트가 표시되어 회색조 값 열과 해당 시간 정보를 표시합니다. 클립보드를 사용하여 스프레드시트 데이터를 내보냅니다.
  12. 배경 형광(ROI 0)을 뺀 후 세포 내 Ca2+ 변화를 나타내는 F340 nm/F380 nm를 계산합니다.

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결과

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CD34+ VW-SC의 분리 및 정제
CD34+ VW-SC의 고순도는 조직 부착 및 자기 마이크로비드 분류를 통해 마우스 대동맥 및 장간막 동맥의 외래에서 얻어집니다. 혈관 벽에서 CD34+ 세포의 비율은 일반적으로 10%-30%입니다. 유세포 분석은 자기 비드 분류로 얻은 CD34+ 세포의 순도가 90% 이상임을 확인합니다(그림 1A). 세포 면역형광 염색은 CD34+ VW-SC가 주로 CD34, c-kit, Flk-1 및 Ki-67을 발현하며 Sca-1의 발현은 상대적으로 낮다는 것을 보여줍니다(그림 1B).

CD34+ VW-SC의 차별화
CD34+ VW-SC는 <...

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토론

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이 연구는 마우스의 대동맥 및 장간막 동맥에서 기능적 CD34+ VW-SC를 얻는 빠르고 편리한 방법을 제공합니다. 이 방법으로 얻어진 CD34+ VW-SC는 증식 활성과 다방향 분화 특성을 갖는다. 트리포스페이트 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체(IP3Rs), 리아노딘 수용체(RyRs) 및 매장 작동 칼슘 채널은 CD34+ VW-SC에서 Ca2+ 방출 및 진입을 매개합니다. 이 기술의 확립은 심혈관 질환에서 구조적 및 기능적 리모델링에 참여하는 CD34+ VW-SC와 관련된 메커니즘에 대한 추가 연구를 위한 토대를 마련할 것입니다.

일차 세포 분리를 위한 가장 일반적인 방법에는 조직 블록 부착 및 효소 해리가 포함됩니다15,16. 본 보고서에서는 조...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(No. 82070502, 31972909, 32171099), 쓰촨성 쓰촨성 과학기술프로그램(23NSFSC0576, 2022YFS0607)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자들은 세포 배양에 도움을 준 Zhejiang University의 Qingbo Xu에게 감사의 뜻을 전하며, Southwest Medical University의 유세포 분석 플랫폼의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2% 젤라틴 용액SigmaG1393
Anti-CD31 항체R& DAF3628
Anti-CD34 항체Abcamab81289
Anti-c-kit 항체CST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 항체Abcamab24313
Anti-Ki67 항체CST34330
Anti-PDGFRα 항체Abcamab131591
Anti-Sca- 1 항체Invitrogen710952
CD140a (PDGFRA) 단클론 항체(APA5), FITCeBioscience   Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) 단클론 항체 (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 항체, 안티-마우스, FITC, REAfinity 클론 REA383Miltenyi Biotec130-117-775
세포 배양 후드JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD SW-CJ-2FD
원심분리기  센스   L530
CO2  인큐베이터                       Thermofisher Scientific4111
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 자이스 자이스 980   
DMEM 고포도당 매체ATCC30-2002
EBM-2 배양 매체LonzaCC-3162
FACSMelody   BD Biosciences
FACS멜로디&트레이드; 시스템 
태아 소 혈청MilliporeES-009-C
FM-2 배양 매체ScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
염소 항-토끼 IgG (H+L) 고-교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor Plus 488  써모피셔 사이언티픽     A32731
백혈병 억제 인자MilliporeLIF2010
현미경 올림푸IX71
미니맥스    시작 키트Miltenyi Biotec130-090-312
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 솔루션BeyotimeC0224
정제된 쥐 안티-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록)BD Pharmingen553141
스테레오 현미경 올림푸스SZX10 
TILLvisION 4.0 프로그램   T.I.L.L.Photonics GmbH폴리크롬 V 
VWF 단클론 항체 (F8/86)Thermofisher Scientific  MA5-14029
β-메르캅토에탄올써모피셔 사이언티픽21985023
BD스

참고문헌

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  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
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  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
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  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125(2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
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