본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.
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방법 논문
인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
망막병증은 전 세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 망막병증의 발병기전을 조사하는 것은 망막병증의 조기 진단과 적시 치료에 필수적입니다. 불행히도 윤리적 장벽은 인간으로부터 증거를 수집하는 것을 방해합니다. 최근 수많은 연구에서 인간 만능 줄기세포(PSC)가 다양한 유도 프로토콜을 사용하여 망막 오가노이드(RO)로 분화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 줄기 세포 기반 치료를 위한 망막병증에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이 연구는 소포 형성 및 융합 가능성을 크게 줄여 60일까지 생산 성공률을 높이는 신경 망막(NR)을 생성하기 위한 최적화된 유도 프로토콜을 설명합니다. 특정 보완 요인과 결합된 해리 후 PSC의 자체 재구성 능력을 기반으로 하는 이 새로운 방법은 NR 분화를 구체적으로 유도할 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 복잡하지 않고, 비용 효율적이며, 주목할 만한 반복성과 효율성을 보여주고, 망막 질환의 개인화된 모델에 대한 고무적인 전망을 제시하며, 세포 치료, 약물 스크리닝 및 유전자 치료 테스트와 같은 응용 분야를 위한 풍부한 세포 저장소를 제공합니다.
서론
눈은 인간의 감각 기관 중 주요 정보 공급원 역할을 하며, 망막은 포유류 눈의 주요 시각 감각 조직이다1. 망막병증은 전 세계적으로 안과 질환의 주요 원인 중 하나로, 실명을 유발한다2. 전 세계적으로 약 285만 명의 사람들이 망막병증으로 인한 다양한 정도의 시력 장애를 겪고 있습니다3. 따라서 발병 기전을 조사하는 것은 조기 진단과 시기 적절한 치료에 매우 중요합니다. 인간 망막증에 대한 대부분의 연구는 주로 동물 모델에 초점을 맞추고 있다 4,5,6. 그러나 인간의 망막은 다양한 세포 유형으로 구성된 복잡하고 다층 조직입니다. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 및 동물 모델 시스템은 일반적으로 인간 망막의 정상적인 시공간 발달 및 약물 대사를 충실하게 재현하지 못합니다 7,8.
최근에는 3D 배양 기술이 발전하여 만능 줄기 세포(PSC)에서 조....
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프로토콜
이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 중국 PLA 종합 병원의 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. WA09(H9) ESC 라인은 WiCell 연구소에서 입수했습니다.
1. 배양 배지 및 시약 준비
- 인간 ESC 배양 배지 및 통로 용액
- 유지 배지(MM): 500mL의 완전한 MM(기초 배지 + 5x 보충, 재료 표 참조)을 무균 상태로 준비합니다. 보충제 5배를 실온(RT)에서 또는 2-8°C에서 하룻밤 동안 해동합니다. RT로 예열하십시오. 보충제가 탁해지지 않을 때까지 사용 전에 잘 저어줍니다.
- 1% 세포외 기질(ECM): 사전 냉각된 피펫 팁과 멸균 튜브를 사용하여 튜브당 200μL의 ECM( 재료 표 참조)을 얼음에 분주합니다. 튜브를 -20°C 냉동고에 보관하십시오. ECM을 얼음 위에서 녹이고 1:100에서 사전 냉각된 DMEM/F12로 희석합니다.
- 0.5mM pH = 8.0 EDTA: 500mL의 0.5mM EDTA를 제조하려면 500μL의 0.5M EDTA와 0.9g의 NaCl을 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 500mL에 추가합니다....
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결과
수정된 프로토콜의 그래픽 개요는 그림 1에 나와 있습니다. H9-ESC는 세포가 70%-80%의 밀도로 성장했을 때 RO를 생성하는 데 사용되었습니다. 96개의 V-바닥 원뿔형 웰에서 H9-ESC의 단일 세포 현탁액은 1일차에 집계되고 6일째에 잘 둘러싸인 원형 EB를 형성했습니다. 배양 시간이 증가함에 따라 EB의 부피가 점차 증가했습니다. 30일째에, 신경상피와 같은 구조가 장기간의 NR 분화 동안 명확하게 형성되고 두꺼워졌습니다.
또한, 수정된 방법을 다른 두 가지 방법(Kuwahara et al.12 및 Döpper et al.27)과 비교하여 반복성 및 효율성을 평가했습니다(보충 그림 1). 이 연구는 또한 수정된 방법 후 1일차의 EB의 형태가 다른 두 방법보다 약간 더 나쁘다는 것을 관찰했습니다. 그.......
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토론
인간 RO는 태아 망막의 발달을 공간적, 시간적으로 재현할 수 있으며, 초기 RO는 동등한 발달 단계에서 태아 망막과 높은 수준의 유사성을 나타낸다15. 조직 형태 및 분자 발현 측면에서 인간 RO는 망막 조직의 실제 성장 상태를 밀접하게 반영하여 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의학 분야에서 전례 없는 엄청난 기회를 제공합니다. 현재, in vitro에서 인간 PSC로부터 RO를 생성하기 위한 여러 가지 방법이 확립되어 있으며, 효율성을 더욱 향상시키기 위해 지속적인 수정 및 최적화가 진행되고 있다9. 사사이 실험실은 인간 ESC11로부터 PSC 유래 RO의 생성을 처음으로 보고했다. 인간 ESC를 먼저 단일 세포 현탁액으로 준비한 다음 동일한 수의 세포를 96개의 V-바닥 원뿔형 웰에 파종하고 빠르게 응집하여 원형과 유사한 EB를 형성했습니다. 주요 세포 신호 전달 경로의 외부.......
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공개 사항
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | 세척 슬라이스 |
| 4% 파라포름알데히드 | Servicebio | G1101-500ML | 고정 망막 오가노이드 |
| 5 mL 파스퇴르 피펫 | NEST 생명공학 | 318516 피펫 망막 오가노이드 | |
| 96 V 바닥 원뿔형 웰 | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| 접착 현미경 슬라이드 | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| 무수 에탄올 | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | 1차 항체 |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | 1차 항체 |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | 1차 항체 |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | 1차 항체 |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | 1차 항체 |
| 세포 해리 용액(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | 세포 해리 |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β 억제제 |
| 콜레스테롤 지질 농축액 | Gibco | 12531018 | 250× |
| 구연산염 항원 회수 솔루션 | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL 기술 | 1001061 | 세포 동결 매체 |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 핵 카운터스테 |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 시그마 | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | 배지 |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| 당나귀 anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | 2차 항체 |
| 당나귀 anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | 2차 항체 |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | 코팅 플레이트 |
| F12-Glutamax | Gibco 31765035 | Medium | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | 스캔 절편 |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP 억제제 |
| 저접착 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| 저접착 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| 유지보수 배지(MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | 미디엄 |
| N2 보충제 | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | 차단 버퍼 |
| Paraplast | Leica | 39601006 | 조직 임베딩 |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R& D | 314-BP | 주요 단백질 인자 |
| 레티노산 | 시그마 | R2625 | 분말, 빛을 피하십시오 |
| SB431542 Selleckchem | S1067 | ALK5 억제제 | |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | 티로신 키나아제 |
| 억제제 Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| 타우린 | 시그마 | T0625-10G | |
| 티오글리세롤 | Sigma M1753 | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100 | 투과 |
| WA09 배아 줄기 세포주 | WiCell Research Institute | 세포주 | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | 탈왁싱 |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK 억제제 |
참고문헌
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al.
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재인쇄 및 허가
