수술 후 장폐색 쥐 모델

요약

우리는 장 조작을 통해 생성된 수술 후 장폐색의 쥐 모델을 설명합니다. 위장 통과 기능, 병리학적 변화 및 면역 세포 활성화는 수술 후 24시간 후에 평가되었습니다.

초록

대부분의 환자는 수술 후 장폐색(POI)을 경험하며, 이는 이환율, 사망률 및 입원 시간 증가와 관련이 있습니다. POI는 수술 중 기계적 손상으로 인해 위장관의 운동성이 중단된 결과입니다. POI의 메커니즘은 비정상적인 신경 세포 민감성, 상피 장벽 기능 손상 및 국소 염증 증가와 관련이 있습니다. 그러나 세부 사항은 여전히 수수께끼로 남아 있습니다. 따라서 실험용 쥐 모델은 POI 손상의 병태생리학 및 메커니즘을 밝히고 새로운 치료법을 개발하는 데 중요합니다.

여기에서는 임상 수술과 유사한 장 조작(IM)을 통해 생성된 POI의 쥐 모델을 소개합니다. 이것은 면봉으로 복부를 1-3회 마사지하여 소장을 기계적으로 손상시킴으로써 달성됩니다. IM은 FITC-dextran gavage 및 분절 소화관의 형광 검출로 평가한 바와 같이 수술 후 24시간 동안 위장 통과를 지연시켰습니다. 또한, 점막하의 조직 팽창 및 면역 세포 침투는 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 유세포 분석으로 조사되었습니다. IM의 적절한 압력과 장에 대한 충혈 효과는 시술에 매우 중요합니다. 이 POI의 쥐 모델은 복부 수술 후 장 손상 및 회복 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

수술 후 장폐색(POI)은 인체 건강 분야, 특히 복부 수술을 받는 환자의 관리에 중대한 도전을 제기하는 증후군입니다. 위장 운동성의 회복이 지연되는 것이 특징인 POI는 입원 기간을 연장하고 의료 비용을 증가시키는 원인이 되지만, 확립된 정의, 병인 또는 치료법은 존재하지 않는다¹. 최근 연구는 POI ^2,3,4의 진행에서 면역 세포의 중추적인 역할을 밝혀 주었지만, 관련된 기본 메커니즘을 밝히기 위해서는 추가 조사가 필요합니다.

이 프로토콜에서는 복강 내 수술에 의해 유도된 POI의 쥐 모델을 소개하며, 이는 복부 수술이 소화관에 미치는 영향을 밀접하게 모방합니다. 우리의 목표는 생쥐의 POI를 모델링하기 위한 표준화된 방법을 제공하여 연구자들이 병태생리학을 조사하고 새로운 치료 개입을 탐색할 수 있도록 하는 것이었습니다.

이 기술의 개발 및 활용의 근거는 POI를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 전임상 모델의 필요성에 있습니다. POI 연구에 대한 전통적인 접근 방식은 종종 번역 관련성이 부족하거나 상태에 기여하는 요인의 복잡한 상호 작용을 포착하지 못합니다. 임상 시나리오를 밀접하게 복제하는 쥐 모델을 도입함으로써 연구자들은 POI의 기저에 있는 메커니즘을 보다 정확하게 조사하고 통제된 실험 환경에서 잠재적인 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

대체 기술과 비교했을 때, 이 프로토콜에 제시된 POI의 쥐 모델은 몇 가지 이점을 제공합니다. 초기에 우리는 실험 동물에서 POI를 유도하기 위한 표준화되고 재현 가능한 프로토콜을 확립하기 위해 실험 결과를 최근의 발전 기술과 통합했습니다. 이 프로토콜은 위장 기능에 대한 일관된 평가를 용이하게 합니다. 둘째, 조직학적 염색 및 유세포 분석을 사용하여 조직 팽창, 면역 세포 증식 및 활성화를 평가할 수 있었고 POI⁵의 기저에 있는 염증 과정에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

문헌의 더 넓은 맥락에서, POI의 쥐 모델을 확립하는 것은 이 상태의 병태 생리학을 이해하는 것을 목표로 하는 연구의 확장에 기여합니다. 기초 과학과 임상 실습 간의 격차를 해소함으로써 전임상 모델은 POI⁶에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 중추적인 역할을 합니다. 또한 표준화된 동물 모델의 가용성은 여러 실험실에서 연구 결과의 재현성과 비교 가능성을 향상시킵니다. 그러나 이 POI 모델은 수술 절차 중 기계적 자극에 의존합니다. 다른 형태의 자극 유도 장폐색은 이 모델에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 연구자들은 이 모델을 사용하여 실험을 계획할 때 동물 복지 규정, 윤리적 고려 사항 및 자원 가용성과 같은 요소를 고려해야 합니다.

요약하면, POI의 쥐 모델의 도입은 이 쇠약해지는 상태에 대한 전임상 연구에서 주목할 만한 진전을 의미합니다. 또한 H&E 염색 및 유세포 분석을 사용하여 조직 부종과 면역 세포 증식 및 활성화를 평가했습니다. 쥐 POI 모델의 확립은 POI 메커니즘의 발견을 촉진하고 POI에 대한 새로운 치료법의 개발을 촉진할 것입니다.

프로토콜

동물 관리 및 실험 절차는 Guiding Principles in the Care and Use of Animals(중국)에 따라 수행되었으며 베이징 친선 병원 윤리 검토 위원회(NO. 20-2056)의 승인을 받았습니다. C57BL/6 마우스(8-12주령)를 사용하여 연구를 진행했습니다.

1. 수술 준비

1. 실험 조건의 표준화를 충족하기 위해 계획된 모델링 전 12시간 동안 모든 마우스를 빠르게 처리합니다(그림 1A).
2. 수술 기구를 준비하고 소독합니다.
3. 마취제 트리브로모에탄올과 발열 패드를 준비합니다. 과열을 방지하기 위해 가열 패드를 모니터링하고 일정한 온도(37.5°C)를 유지하십시오.

2. 마취

1. 각 마우스를 트리브로모에탄올로 마취합니다.
   1. 트리브로모에탄올을 희석하여 생리식염수에 20mg/mL 용액을 준비합니다. 복강내 주사를 통해 체중 10g당 0.2mL의 트리브로모에탄올 작업 용액을 투여합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 안과 연고를 사용하십시오.
   2. 마우스가 5분 이내에 완전히 마취되고 20분 동안 마취 상태를 유지하도록 합니다.
2. 마우스가 똑바로 서 있을 수 없는 상태를 관찰하고 근육 이완을 확인하여 마취 깊이를 평가합니다. 자발적 움직임의 상실, 눈 깜빡임 반사 및 반사 자극에 대한 반응(강한 압력으로 발가락 또는 꼬리를 꼬집음)을 관찰합니다.
3. 흉벽과 복부의 움직임을 모니터링하여 마우스의 호흡수와 패턴을 평가합니다. 최적의 마취 상태에서 호흡 속도가 ~ 55-65 호흡/분인지 확인하십시오.
4. 마취된 마우스를 보드에 놓고 테이프로 고정합니다.
5. 쥐를 완전히 마취한 후 전기 면도기를 사용하여 복부의 털을 제거합니다. 면도 후에는 식염수에 적신 면봉으로 복부의 느슨한 털을 모두 닦아냅니다.
   알림: 노출 위험을 최소화하기 위해 트리브로모에탄올을 취급할 때 적절한 환기와 흄 후드 또는 생물 안전 캐비닛의 사용을 확인하십시오. 시술 중에는 장갑과 실험복을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하여 화학 물질 및 생물학적 물질과의 우발적인 접촉을 방지하십시오.

3. 수술

1. 팔다리를 완전히 펴서 복부를 드러냅니다. 마우스의 머리가 깨끗한 기도를 유지할 수 있는 위치에 있는지 확인합니다(그림 1B).
2. 75% 알코올을 적신 면봉을 사용하여 수술 부위의 피부를 두 번 소독합니다. 소독 후에는 건조하고 멸균된 의료용 거즈를 사용하여 복부의 과도한 알코올을 제거합니다. 절개 전에 리도카인(10mg/kg, 피하)을 의도한 부위에 투여합니다.
3. 멸균 메스를 사용하여 피부를 절개하고 핀셋을 사용하여 복부 중앙의 복직근을 들어 올립니다.
   1. 복직근의 정중선을 따라 작게 절개하되 복부의 다양한 장기가 손상되지 않도록 주의합니다.
   2. 절개 부위의 대략적인 범위는 다음과 같습니다. 절개 부위의 위쪽 가장자리는 흉골의 xiphoid process에서 6-8mm, 아래쪽 가장자리는 외부 생식기에서 6-8mm, 절개 부위의 길이는 ~1cm인지 확인합니다.
4. 복부 절개 부위의 양쪽에 멸균 수술용 드레이프 또는 멸균 거즈 조각을 놓습니다. 지혈 겸자를 사용하여 절개 부위의 위쪽과 아래쪽 가장자리에 멸균 거즈를 고정하여 절개 부위를 노출시킵니다(그림 1C).
   참고: 가짜 그룹에서는 절개 부위를 외과적 수술 없이 5분 동안 젖은 거즈로 덮었습니다.
5. 멸균 드레이프 또는 거즈를 적절하게 고정한 다음 식염수를 미리 적신 두 개의 면봉을 사용하여 절개 부위에 인접한 복벽 양쪽을 부드럽게 누릅니다. 절개 부위를 통해 소량의 장 튜브를 짜내고 멸균 드레이프 또는 거즈에 올려 노출시킵니다(그림 1D).
6. 두 개의 멸균 면봉에 생리식염수를 완전히 적십니다. 적신 면봉으로 장 조직을 부드럽게 잡고 소장을 조심스럽게 제거합니다.
   1. caecum을 찾은 다음 췌장을 만지지 않도록 위 2cm 전까지 멸균 면봉으로 장을 꺼냅니다. 췌장-십이지장 인대의 근위부 끝에서 회장 영역의 원위 끝까지 장을 확장합니다.
7. 근위부에서 원위부까지 소장 전체를 따라 일정한 압력을 가합니다. 장 표면에 작은 출혈 반점이 나타날 때까지 5분 동안 균일한 힘 적용을 확인합니다(그림 1E).
8. 5분 후, 미리 적신 멸균 면봉을 사용하여 소장의 정상적인 생리학적 해부학적 위치에 따라 모든 소장을 조심스럽게 복강에 다시 넣습니다.
9. 멸균된 거즈와 복벽을 가로질러 복부를 3-5초 동안 부드럽게 마사지하여 장이 자연스러운 해부학적 위치로 회복되도록 하고 수술 후 인공 기계적 장 폐색이나 장간막 염전을 방지합니다.
10. 100μL의 식염수를 복강에 주입하여 수술 중 손실된 체액을 보충하고 복부 조직을 윤활합니다.
11. 6-0 외과적 봉합사를 사용하여 복부를 봉합하고 복부 절개 부위를 2겹으로 봉합합니다. 복부 장기가 손상되지 않도록 주의하면서 지속적인 봉합사로 근육층을 닫는 것으로 시작한다. 봉합하는 동안 복직근을 들어 올립니다(그림 1F).
12. 복직근을 완전히 봉합한 후 6-0 수술 봉합사를 사용하여 간단한 간헐적 봉합사로 완전히 봉합합니다. ~0.5mm의 스티치 길이와 ~2mm의 바늘 간격을 유지하십시오.
13. 복부 절개 부위를 봉합한 후 절개 부위를 마른 멸균 의료용 거즈로 부드럽게 닦아 혈액, 조직액 또는 생리식염수로부터 건조하고 깨끗하게 유지합니다.
14. 수술 후 갈라지지 않도록 절개 부위와 절개 부위 주변에 소량의 의료용 절개 접착제를 바르십시오.
15. 의료용 절개 접착제가 완전히 건조된 후 마우스를 종이 타월로 옮기고 마우스가 완전히 회복될 때까지 37.5°C의 일정한 온도로 유지되는 가열된 담요 위에 케이지 종이 타월을 놓습니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
16. 깨어 있는 쥐를 동물 먹이 장벽 환경으로 옮기고 감지 시간까지 자유롭게 마실 수 있도록 합니다.

4. 위장 통과 분석

1. 수술 22.5시간 후 공복 마우스를 통해 공복 마우스에 200μL의 FITC-덱스트란 용액(PBS의 경우 5mg/mL)을 투여합니다(그림 1A).
2. IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 방법(예: CO₂ 흡입 후 자궁경부 탈구)을 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
   1. 소화관을 분리하려면 횡격막에서 골반까지 정중선을 절개하여 주변의 결합 조직과 기관을 조심스럽게 제거합니다.
   2. 소화관을 주변 조직 및 장기와 분리하여 위에서 항문까지 전체 관이 포함되도록 합니다.
3. 소화관을 생리학적 위치(순서: St -S1:S10-Ce-L1:L3)에 따라 1에서 15까지 순차적으로 번호가 매겨진 15개의 동일한 세그먼트(위에서 결장까지)로 나눕니다(그림 2A).
4. 내용물이 있는 장 조직의 각 부분을 1-4mm 크기의 조각으로 자르고 1mL의 DPBS가 들어 있는 별도의 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
5. 원심분리기 튜브를 10초 동안 소용돌이치며 샘플을 균질화합니다.
6. 튜브를 500 × g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 멀티모드 마이크로플레이트 리더를 사용하여 FITC 형광 정량화를 위한 상층액을 수집합니다.
7. FITC-덱스트란의 기하학적 중심(GC)을 계산하여 위장 이동을 설명하고 (Σ[% FITC per segment x segment number])/100 공식을 사용하여 계산합니다.

5. 파라핀 끼워넣고는 및 hematoxylin와 eosin (HE) 염색

1. CO₂ 흡입 후 24시간 후 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 동일한 동물에 대해 파라핀 포매 및 위장 분석을 수행합니다.
2. 복강을 열고 추가 분석을 위해 소장 조직을 수집합니다.
3. Carnoy의 고정제(60% 메탄올 + 10% 아세트산 + 30% 클로로포름)에 장 내용물이 함유된 장 전체를 4°C에서 2시간 동안 고정합니다.
4. 매번 30분 동안 메탄올로 두 번 헹구어 조직을 산성화합니다.
5. 메탄올을 에탄올로 매번 30분 동안 두 번 교체하십시오.
6. 매번 30분 동안 메탄올로 두 번 헹구어 조직을 산성화합니다. 자일렌으로 조직을 투명하게 하려면 조직을 자일렌에 담그고 1시간 동안 배양합니다.
7. 파라핀 임베딩 기계를 사용하여 파라핀 왁스에 조직을 삽입합니다. 마이크로톰을 사용하여 내장된 조직을 4μm 두께의 조각으로 자릅니다.
   알림: 성능 향상을 위해 소장을 다른 왁스로 나눕니다. 세그먼트에 적절하게 레이블을 지정하여 위치를 식별합니다.
8. HE 염색 키트를 사용하여 HE 염색을 수행합니다. 슬라이드를 밀봉하고 분석을 위해 현미경으로 검사합니다.

6. 면역 세포 분리 및 유세포 분석

1. 다음 해결 방법을 준비합니다.
   1. 사전 소화 용액: 1mM 디티오트레이톨(DTT) 및 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 Hank의 균형 잡힌 염 용액을 준비합니다.
   2. 분해 용액: RPMI 1640에 200μg/mL DNAase I, 500μg/mL 콜라겐분해효소 IV, 4% FBS 및 100μM HEPES 완충액을 함유한 용액을 준비합니다.
   3. MACS(Magnetic-activated cell sorting works) 완충액: Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 없이 PBS에서 5g/L BSA 및 2mM EDTA가 포함된 완충액을 준비합니다.
2. 배설물은 생리식염수로 장을 씻어 제거합니다. Peyer의 패치와 소장의 결합 조직을 제거합니다. 소장을 세로로 자른 다음 얼음처럼 차가운 PBS에서 1cm 조각으로 자릅니다.
3. 소화 전 용액으로 37°C에서 20분 동안 오비탈 셰이커에서 장 분절을 세척합니다. 전소화 용액을 수집하고 70μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 상피내 림프구(IEL)를 얻습니다.
4. 30분 동안 분해 용액의 세그먼트를 분해한 다음 70μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하여 lamina propria lymphocytes(LPL)를 얻습니다.
5. LPL 세포를 500 × g 에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 버립니다.
6. DPBS(아지드화나트륨, 트리스 및 무단백질)로 1 x 10⁶ cells/100 μL의 농도로 세포를 세척하고 현탁시킵니다.
7. 형광 생존도 염료(1:500)로 어두운 곳에서 실온(RT)에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
8. MACS 버퍼로 셀을 현탁시키고 500 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
9. 혈구계(hemocymeter) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 염색된 세포를 계수합니다. 1 x 10⁶ cells/100 μL의 MACS 완충액 농도로 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액에 적절한 양의 항체를 첨가하고 4°C에서 15분 동안 배양하여 항체 염색(1:200-1:400)을 수행합니다.
10. 6.8단계에 설명된 대로 셀을 세척합니다.
11. 유세포 분석을 사용하여 샘플을 검출하고 관련 유세포 분석 소프트웨어 ^7,8로 데이터를 분석합니다.

결과

이 프로토콜에서 POI는 임상 수술의 효과와 유사한 장 조작(IM)에 의해 외과적으로 유도되었습니다. 가짜 그룹에서는 IM 없이 절개가 이루어졌습니다. POI 마우스는 POI 수술 후 24시간 동안 가짜 대조군 마우스와 함께 희생되었습니다. 소화관의 중요한 기능인 내용물 전달 기능은 FITC-덱스트란의 위장에 의해 감지되었습니다. POI 모델은 소장의 근위부에서 FITC 강도가 증가했기 때문에 성공적인 것으로 간주되었습니다(그림 2B). 평균 GC는 IM의 통과 기능 장애를 정량화하고 작동의 일관성을 나타내기 위해 계산되었습니다(그림 2C).

HE 염색은 소화관의 여러 세그먼트의 형태를 나타냅니다(그림 3). 십이지장과 회장의 점막하층과 평활근층은 POI 유도 후 24시간 후에 부풀어 올랐습니다(그림 3A, B). 가짜 마우스와 비교했을 때, 십이지장을 염색한 결과 POI 마우스에서 면역 세포 침투가 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3A).

다색 유세포 분석은 면역 세포의 비율, 상태 및 기능을 분석하기 위한 핵심 방법입니다. 장 조직을 콜라겐 분해 효소와 데옥시리보뉴클레아제로 소화하고 유세포 분석을 위해 단세포 현탁액으로 분리했습니다. 게이팅 전략은 LPL 중 CD3 T 세포 및 관련 하위 집단의 비율을 결정하는 데 사용되었습니다(그림 4A). POI 마우스에서는 활성화 및 부착 마커 CD69와 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 gd T 세포의 발현이 상향 조절됩니다(그림 4B)⁷. 마찬가지로, CD44+ PD-1+(활성화, 말단 분화 및 소진 마커) 하위 모집단의 비율은 증가하는 경향을 보였습니다(그림 4C)⁷. 림프구 외에도 IM 수술 후 골수성 세포 부분집합(호중구, 수지상 세포 및 대식세포)의 비율도 증가합니다(그림 4D)⁸.

그림 1: 수술 후 장폐색의 쥐 모델. (A) 수술 후 장폐색의 쥐 모델의 개략도. (B) 마취 및 면도 후 마우스 고정. (C) 절개 부위를 노출시키고 의료용 멸균 거즈로 덮었습니다. (D) 복부 절개를 통해 장관을 복강 밖으로 짜내어 멸균 거즈에 올려 노출시켰다. (E) 소장 전체를 축축한 멸균 면봉에 노출시켰다. (F) 근육층은 외과적 봉합사로 봉합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 소화관 기능 평가를 위한 위장관 통과 분석법. 수술 후 22.5시간에 가짜 또는 POI 마우스에 FITC-덱스트란 용액을 주입하고 90분 후에 희생했습니다. (A) 소화관은 15개의 부분으로 나뉘고 생리학적 위치에 따라 번호가 매겨졌습니다. (B) 가짜 마우스와 POI 마우스의 소화관에서 나온 모든 분절의 FITC 강도. (C) 투여된 FITC-덱스트란의 기하학적 중심을 계산하여 바이올린 플롯으로 표시했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: POI 마우스의 소장의 대표적인 HE 염색. 가짜 마우스와 POI 마우스의 (A) 십이지장과 (B) 회장의 단면을 염색하는 HE. 스케일 바: 100 μm 또는 25 μm(삽입 이미지 확대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: POI 마우스의 소장 면역 세포에 대한 대표적인 유세포 분석. (A) 수술 24시간 후 POI 마우스의 소장 조직에서 T 세포 집단에 대한 유세포 분석 게이팅 전략. (B) 가짜 마우스와 POI 마우스의 소장에서 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 gd T 세포에서 T 세포 활성 마커 CD69⁺의 비율. (C) 가짜 마우스와 POI 마우스의 소장에서 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 gd T 세포 중 CD44⁺ PD-1⁺ 활성 마커의 비율. (D) 가짜 마우스와 POI 마우스의 소장에서 CD45^{+ 아쿠아 살아}있는 면역 세포 중 호중구(Ly6G^+, CD11b+), 수지상 세포(CD11c⁺, MHC-II⁺) 및 대식세포(CD11b⁺, F4/80⁺)의 비율. 각 패널의 숫자는 각 셀 유형의 백분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

수술의 성공은 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 장 벽내 수술(IM) 중 일관성을 유지하는 것은 소장에 대한 광범위한 손상을 유도하는 데 필수적입니다. IM 시술 중 가해지는 적절한 압력과 그에 따른 장에 대한 충혈 효과는 수술 성공에 매우 중요합니다. 면봉으로 문지른 후 소화관 전체가 분홍색으로 변하고 붉은 출혈 반점이 나타나는 것을 관찰한 것은 성공적인 수술의 지표가 되었습니다. 또한 수술 후 평균 GC 값이 약 5로 유지되는 것은 모델이 가짜 수술 마우스와 비교하여 성공적이었음을 나타냅니다. HE 염색에서 입증된 바와 같이 점막하 조직 부종과 면역 세포 침투에 대한 현미경 검사도 POI의 중증도를 검증하는 데 중요한 단계로 작용합니다.

결과를 최적화하거나 발생한 문제를 해결하기 위해 프로토콜 수정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 장 상피의 형태학적 변화를 정확하게 나타내기 위해서는 Carnoy의 고정제를 사용하여 장 조직과 그 내용물을 삽입하는 것이 좋습니다⁹. 이 고유한 포매팅 프로토콜은 조직 형태를 보존하는 데 필수적인 빠른 고정을 보장합니다. 그러나 연구자의 목표가 상피 또는 얇은 판 propria에 초점을 맞추는 경우 장 조직 제제의 왁스 포매를 위해 개선된 스위스 압연 기술을 사용하는 것이 좋습니다¹⁰. 이 기술은 장 조직의 사이공간을 압축하고 융모의 일관된 방향을 보장하여 하나의 왁스 포매 샘플에 전체 소장을 쉽게 포매할 수 있도록 합니다.

유용성에도 불구하고 프로토콜에는 한계가 있습니다. 한 가지 한계는 동물 모델에 의존한다는 것인데, 이는 인간 병태생리학의 복잡성을 완전히 복제하지 못할 수 있습니다. 또한 수술 기법과 개별 마우스 반응의 차이로 인해 결과에 변동성이 발생할 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 일관된 연산자를 사용하는 것은 연산자 의존적 변동성을 줄이는 데 중요한 원칙입니다. 더욱이, Van 등은 장에 특정 무게를 가할 수 있는 자체 제작 장치를 도입하여 서로 다른 마우스¹¹에 걸쳐 IM에 대한 일관된 압력을 보장합니다. 이 접근 방식은 실제로 모델의 일관성을 유지하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다.

이 프로토콜은 마우스에서 IM 수술을 통해 POI를 유도하기 위한 표준화된 방법을 제공함으로써 이 분야에 대한 귀중한 기여를 나타냅니다. 이 프로토콜은 중요한 단계를 설명하고 조직 포매 및 면역 세포 분리에 대한 수정 사항을 제공함으로써 POI 모델링의 재현성과 신뢰성을 향상시킵니다. 면역 세포 분석을 위해 유세포 분석 ^7,8을 활용하면 POI 발병의 기저에 있는 면역 반응을 포괄적으로 조사할 수 있으며, 기존 기술을 보완하고 이 복잡한 증후군에 대한 이해를 확장할 수 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 POI를 이해하고 치료하는 데 초점을 맞춘 향후 전임상 연구에 대한 약속을 제시합니다. 수술 기법을 개선하고 조직 처리 방법을 최적화함으로써 연구자들은 POI 발달의 기저에 있는 메커니즘을 추가로 탐색하고 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 또한 프로토콜과 유세포 분석의 호환성은 심층적인 면역 프로파일링을 가능하게 하여 POI 증상 완화를 목표로 하는 면역 조절 중재를 조사할 수 있는 길을 열어줍니다. 전반적으로 이 프로토콜은 POI에 대한 지식을 발전시키고 환자 결과를 개선하기 위한 표적 치료 전략을 개발하기 위한 토대를 마련합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC 안티 마우스 I-A/I-E (MHC-II)	바이오레전	드 107614
APC 안티 마우스 TCRb	바이오레전	드 109212
APC/Cy7 안티 마우스 CD4	바이오레전	드 100414
APC/Cy7 안티 마우스 Ly6G	바이오레전	드 127624
브릴리언트 바이올렛 421 안티 마우스 CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 안티 마우스 F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 안티 마우스/인간 CD44	Biolegend	103041
BUV395 안티 마우스 CD8a	BD	563786
BUV737 안티 마우스 CD3e	BD	612771
콜라겐 분해 효소 IV	시그마-알드리치	C5138
추출한 배양 현미경	CKX53	Olympus
Deoxyribonuclease I(DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Dithiothreitol 용액	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC 안티 마우스 CD45	Biolegend
FITC-덱스트란(70kWM)	시그마-알드리치	FD70-100MG	위장 통과 분석
HE 염색 키트	solarbio	G1120
PE 안티 마우스 CD11b	Biolegend	101208
PE 안티 마우스 PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 안티 마우스 CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 유세포 분석기	BD-		면역 세포 검출 및 분류
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402	마취
Varioskan LUX	Thermo	N16699	다중 모드 마이크로플레이트 리더
Zombie Aqua Fixable Viability kit	Biolegend	423102	Fluorescent 생존 염료