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방법 논문

Gynura bicolor DC의 화학 성분을 연구하기 위한 고분해능 탠덤 질량 분석법

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/66612

⸱

2024년 2월 2일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2General Surgery, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 고분해능 질량 분석 및 분자 도킹을 중국 전통 의학 연구에서 통합하는 일반 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

원하는 화학 성분의 분리 및 분석은 중국 전통 의학(TCM)의 기초 연구에서 중요한 주제입니다. 초고성능 액체 크로마토그래피 사중극자 비행 시간 탠덤 질량 분석법(UPLC-Q-TOF-MS/MS)은 점차 TCM 성분 식별을 위한 선도적인 기술이 되었습니다. Gynura 바이 컬러 DC. (BFH)는 중국에서 의약품 및 식품에 사용되는 다년생 줄기 없는 허브로 열을 맑게 하고 폐를 촉촉하게 하며 기침을 완화하고 정체를 분산시키며 붓기를 완화하는 등의 의약 효과가 있습니다. 폴리페놀과 플라보노이드에는 수많은 이성질체가 포함되어 있어 BFH의 복잡한 화합물을 식별하는 데 방해가 됩니다. 이 논문은 UPLC-Q-TOF-MS를 통한 용매 추출 및 통합 데이터를 기반으로 BFH의 화학 성분을 연구하기 위한 체계적인 프로토콜을 제시합니다.

여기에 설명된 분석법에는 시료 전처리, MS 보정, MS 수집, 데이터 처리 및 결과 분석을 위한 체계적인 프로토콜이 포함되어 있습니다. 시료 전처리에는 수집, 세척, 건조, 분쇄 및 추출이 포함됩니다. MS 교정은 다지점 및 단일 지점 보정으로 구성됩니다. 데이터 처리에는 데이터 가져오기, 분석법 설정, 분석 처리 및 결과 제시가 포함됩니다. Gynura bicolor DC. (BFH)에서 페놀산, 에스테르 및 배당체의 전형적인 단편화 패턴의 대표적인 결과가 이 논문에 제시되어 있습니다. 또한 유기 용매 선택, 추출, 데이터 통합, 충돌 에너지 선택 및 방법 개선에 대해 자세히 설명합니다. 이 범용 프로토콜은 TCM에서 복잡한 화합물을 식별하는 데 널리 사용될 수 있습니다.

서론

중국 전통 의학(TCM)은 수천 년 동안 중국에서 임상적으로 시행되어 왔으며 중국인의 건강을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. 한의학의 구성은 다양하고 복잡하며, 한의학은 화학적 조성에 초점을 맞춘 많은 질적 연구에서 널리 보고되고 있다2. 한의학에서 사용되는 화학성분은 크게 알칼로이드, 유기산, 페닐프로파노이드, 쿠마린, 리그난, 퀴논, 플라보노이드, 테르페노이드, 트리테르페노이드 사포닌, 스테로이드 사포닌, 심장배당체, 탄닌 등으로 나눌 수 있다3. TCM에는 알려지지 않은 성분이 많고 구별할 수 없는 이성질체가 많기 때문에 원하는 화학 성분의 분리 및 분석은 TCM4의 기초 연구에서 중요한 주제입니다.

초고성능 액체 크로마토그래피 사중극자 비행 시간 질량 분석법(UPLC-Q-TOF-MS)은 초고성능 액체 크로마토그래피 5,6으로 분리할 수 있는 중국 전통 의학(TCM)의 물질을 분석하는 데 적용되었습니다. MS의 고분해능은 광범위한 이온 정보를 제공할 수 있으며, 이는 오차가 5ppm 미만인데이터베이스 분석에 사용됩니다7. 충돌 에너지를 켠 후 2차 MS 모드는 2차 단편 이온을 얻을 수 있으며, 그 강도와 수는 에너지8의 크기에 의해 영향을 받습니다.

Gynura 바이 컬러 DC. (BFH)는 의약품 및 식품에 널리 사용되는 다년생 줄기 없는 허브로(그림 1A) 중국 특유의 희귀하고 멸종 위기에 처한 식물이다9. BFH는 풍부한 안토시아닌, 폴리페놀, 플라보노이드 및 강력한 항산화 능력을 가지고 있습니다10. BFH는 열 제거, 혈액 냉각, 폐 보습, 기침 완화, 정체 분산, 부기 완화, 여름 더위 완화 및 열 제거 등의 의약 효과가 있습니다. BFH11의 화학적 조성에 초점을 맞춘 연구는 거의 없다. 폴리페놀과 플라보노이드에는 수많은 이성질체가 포함되어 있어 BFH의 복잡한 화합물을 식별하기 어렵게 만듭니다. 모든 종류의 TCM에 적용할 수 있는 화학 성분을 식별하기 위한 보편적인 방법을 개발해야 합니다. 이 연구는 UPLC-Q-TOF-MS를 통한 용매 추출 및 통합 데이터를 기반으로 BFH의 화학 성분을 연구하기 위한 체계적인 프로토콜을 보고하는 것을 목표로 했습니다.

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프로토콜

1. 시료 전처리

  1. 눈에 띄는 침전물과 불순물이 없을 때까지 BFH 허브 전체를 순수한 물로 씻으십시오. 깨끗한 BFH를 접시에 담은 다음 오븐에 넣습니다(그림 1B). 오븐을 50°C로 24시간 동안 설정합니다.
    참고: BFH의 전체 공장은 중국 쓰촨성에서 수집되었습니다.
  2. 고속 다기능 분쇄기에서 건조 BFH를 분쇄합니다. 굵은 분말을 50메쉬 체에 옮깁니다(그림 1C). 밀폐 된 봉투에 미세한 분말을 모아 건조탑에 보관하십시오.
  3. 각각 0.25g의 BFH 샘플 6개를 정확하게 칭량하고 6개의 원뿔형 플라스크에 넣습니다. 각 원뿔형 병에 30mL의 유기 용매(50% 에탄올-물, 70% 에탄올-물, 클로로포름, 석유 에테르, 에틸 아세테이트 및 n-부틸 알코올)를 추가합니다(그림 1D).
  4. 혼합물을 25 ° C에서 30 분 동안 추출하기 위해 초음파 수조 초음파 발생기로 옮깁니다. 샘플을 14,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 주입 주사기와 0.22μm 유기 미세 다공성 멤브레인 필터를 준비합니다. 모든 상층액을 2mL 샘플 병에 여과합니다.

2. MS 캘리브레이션

  1. 1,000 μL 범위의 피펫을 사용하여 500 μL의 0.1 M 수산화나트륨 용액을 100 mL 용량 플라스크에 옮긴 다음 450 μL의 탈이온수 또는 초순수를 100 mL 용량 플라스크에 옮깁니다(그림 2).
  2. 200 μL 범위의 피펫을 사용하여 100 mL 용량 플라스크에 50 μL의 포름산을 추가합니다. 90:10 2-프로판올:물로 총 100mL의 부피를 만들고 용액을 5분 동안 초음파 처리합니다. 플라스크를 90:10 2-프로판올:물에 0.5mM 포름산나트륨 용액으로 표시하고 냉장고에 보관합니다.
    알림: 포름산나트륨 용액은 실온에서 1주일 후에 만료됩니다.
  3. UPLC-Q-TOF-MS 제어 소프트웨어를 실행한 다음 MS tune 창을 엽니다. Sample Flow Control 패널의 Infusion Flow Rate 옵션에서 25 μL/min을 설정하고 Reservoir 옵션에서 C를 선택합니다. 자동 제거가 끝날 때까지 1분 정도 기다립니다.
  4. Flow 버튼을 클릭하여 포름산나트륨 용액 전달을 시작합니다. 양극 버튼을 클릭하여 양이온 모드로 전환하고 감도 버튼을 클릭하여 감도 모드로 전환합니다.
    참고: 포름산나트륨의 특성 피크가 실시간 스펙트럼 창에 나타날 때까지 다음 단계로 진행합니다.
  5. UPLC-Q-TOF-MS 제어 소프트웨어에서 MS 콘솔 창을 엽니다. 왼쪽 위치에서 SYNAPT XS 및 Intellistart 옵션을 순서대로 선택합니다.
  6. Create Calibration을 선택하고 Start 버튼을 클릭합니다. Next(다음) 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Calibration Profile(캘리브레이션 프로필)을 선택합니다. 다음 버튼을 클릭하고 Positive polarity에서 감도 모드를 선택합니다. Next(다음), Tune Page(조정 페이지), Next(다음) 및 Start(시작) 버튼을 차례로 클릭합니다.
  7. MS tune 창으로 전환하고 음극 버튼을 클릭하여 음이온 모드로 전환합니다. MS 콘솔 창으로 돌아갑니다.
  8. Create Calibration을 선택하고 Start 버튼을 클릭합니다. Next(다음) 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Calibration Profile(캘리브레이션 프로필)을 선택합니다. 다음 버튼을 클릭하고 음극성에서 감도 모드를 선택합니다. Next(다음), Tune Page(조정 페이지), Next(다음) 및 Start(시작) 버튼을 차례로 클릭합니다.
  9. LockSpray Flow Control 패널에서 50 μL/min 유속을 설정하고 Flow 버튼을 클릭하여 LE 용액이 질량 분석기에 들어가도록 합니다. MS 튠 창으로 전환하고 LockSpray 소스 설정을 선택한 다음 시작 버튼을 클릭하여 보정을 시작합니다.

3. MS 취득

  1. 기본 인터페이스로 전환하고 Inlet File 열을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 액체 크로마토그래피 분석법을 엽니다.
  2. Inlet 버튼을 클릭한 다음 Run time 및 Gradient를 포함한 매개변수를 설정합니다. Autosampler 버튼을 클릭한 다음 Run time, Column 및 Sample을 포함한 매개변수를 설정합니다. 저장 버튼을 클릭합니다.
  3. MS Method 열을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 질량 분석 방법을 엽니다.
  4. 정보 버튼을 클릭한 다음 종료 시간, 극성, 분석기 모드, 낮은 질량, 높은 질량 및 램프 전달 충돌 에너지를 포함한 매개변수를 설정합니다. 확인 버튼을 클릭한 다음 저장 버튼을 클릭합니다.
  5. 파일 이름, vial 및 vol을 포함한 시퀀스 테이블을 채웁니다. 저장 버튼을 클릭합니다.
  6. 시퀀스 테이블에서 실행하려는 샘플에 대한 행을 선택합니다. 실행 버튼을 클릭하고 팝업 창에서 확인 버튼을 클릭합니다.

4. 데이터 처리

  1. 데이터 분석 소프트웨어를 실행합니다. My Work(내 작업 ) 열에서 Import MassLynx Data(MassLynx 데이터 가져오기 ) 버튼을 클릭하여 새 창을 엽니다.
  2. 더하기 기호 버튼을 클릭하고 포지티브 모드에서 5개의 원시 파일을 모두 확인합니다. 그룹 이름을 입력하고 Create UNIFI Sample Set(UNIFI 샘플 세트 생성) 버튼을 클릭하여 데이터 가져오기를 시작합니다(그림 3A).
  3. 포지티브 모드에서 Analysis Method 파일을 두 번 클릭합니다. Processing 라벨을 클릭하고 Target by Mass 버튼을 클릭합니다. Target match tolerance(대상 일치 허용 오차) 및 Fragment match tolerance(조각 일치 허용 오차) 뒤의 입력 상자에 5ppm의 숫자를 입력합니다.
  4. Home(홈) 버튼을 클릭하고 Adducts(애드덕트) 버튼을 클릭합니다. +H 및 +Na 행을 선택하고 오른쪽 화살표 모양의 버튼을 클릭합니다. 저장 버튼을 클릭합니다(그림 3B).
  5. 네거티브 모드에서 Analysis Method 파일을 두 번 클릭합니다. Processing 라벨을 클릭하고 Target by Mass 버튼을 클릭합니다. Target match tolerance(대상 일치 허용 오차) 및 Fragment match tolerance(조각 일치 허용 오차) 뒤의 입력 상자에 5ppm의 수를 입력합니다.
  6. Home(홈) 버튼을 클릭한 다음 Adducts(애드덕트) 버튼을 클릭합니다. -H 및 +HCOO 행을 선택하고 오른쪽 화살표 모양의 버튼을 클릭합니다. 저장 버튼을 클릭합니다.
  7. My Work(내 작업) 열에서 Analysis(분석) 버튼을 클릭하여 새 창을 엽니다. 방금 가져온 데이터와 방금 만든 방법을 선택하고 다음 버튼을 클릭합니다. 파일 이름을 입력합니다. 분석 데이터가 저장된 폴더를 선택한 다음 마침 버튼을 클릭합니다.
  8. 프로세스 버튼을 클릭하고 결과가 나타날 때까지 몇 분 동안 기다립니다(그림 3C).
  9. 결과 테이블을 빈 양식에 복사합니다(그림 3D).

5. 결과 분석

  1. 결과 테이블에서 화합물을 선택합니다. 해당 2차 질량 스펙트럼이 오른쪽 하단에 표시됩니다(그림 4A).
  2. 테이블 모양의 버튼을 클릭하고 High Energy Fragments 옵션을 선택하여 2차 단편 이온 테이블을 표시합니다(그림 4B).
  3. 표에서 2차 단편 이온을 선택합니다. 2차 질량 스펙트럼에 해당하는 이온 피크 위로 마우스를 이동하면 해당 구조적 파괴가 화면에 표시됩니다(그림 4C).
    참고: 소프트웨어에서 제공하는 균열의 합리성을 수동으로 평가하고 2차 단편 이온을 기준으로 이성질체를 구별합니다.
  4. 드로잉 소프트웨어에서 단편화 패턴을 수동으로 그립니다.
    참고: 단편화 패턴의 예는 대표 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.

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결과

BFH의 화학적 조성 식별을 대표 결과를 표시하기 위한 모델로 사용하였다. 용매 추출된 Gynura bicolor DC의 기본 피크 크로마토그램. 는 보충 파일 1-보충 그림 S1-S6에 나타내며, 관찰된 머무름 시간(RT), 성분명, 공식, 질량 대 전하 비율(m/z) 및 질량 오차는 표 S1-S6에 나열되어 있습니다. ZBTK에서는 UPLC-TOF-MS의 분리된 피크에서 35가지 종류의 화합물을 모두 식별했습니다. 보충 파일 1-보충 표 S1에 나타난 바와 같이, 주요 화학물질은 산(퀴닉산, DL-말산, 시트르산, o-쿠마르산, 및 3-O-트랜스-쿠마로일퀸산), 배당체(겐티오피크린, 피크로시드 II, 서프루티코시드 J, 코폴린, 및 보르네올-2-O-β-D-아피오푸라노실-(1→6)-β-D-글루코시드) 및 에스테르(빌로발라이드, 트리메틸시트레이트, 및 트랜스-O-글루코실-메틸-트랜스-신나메이트)를 함유하였다. ZBTK-CT에서는 25종의 추가 화합물이 ...

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토론

물 달인12 외에도, 유기 용매 추출은 TCM 전처리13의 또 다른 일반적인 방법이다. 유사 상 용해의 원리에 따라, 다양한 유기 용매(14)의 조합에 의해 수많은 성분이 추출되었다. 초음파 보조 추출은 TCM15에서 구성 요소를 얻는 데 사용되는 주요 방법 중 하나입니다. 초임계 이산화탄소 추출은 리그난16과 같은 특정 종류의 물질을 추출하는 데 좋습니다. 또한, 이온 액체(IL)에서 마이크로파 보조 추출은 기존의 유기 용매 추출에 대한 대안으로 조사되었습니다17. 그러나 마이크로파 에너지의 정밀한 제어는 달성하기 어렵기 때문에 에테르화 탈수 및 에스테르화 탈수와 같은 2차 반응을 유발할 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82104881), 한의학 면역질환 치료 유전 및 혁신팀, 충칭 의학 과학 연구 프로젝트(충칭 보건 위원회와 과학기술국 공동 프로젝트)(2022DBXM007), 충칭 과학 연구소 성과 인센티브 및 지도를 위한 특별 프로젝트(cstc2022jxjl120005), 충칭 박사후 과학 재단 특별 프로젝트(2022CQBSHTB3035)의 지원을 받았습니다. 용족과 중년을 위한 충칭 고위 의료 인재 프로그램, 충칭 과학 기관 프로그램(독립 연구 프로젝트 No.2022GDRC015).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
클로로포름Sinopharm 화학 시약Co., LtdCAS 67-66-3
에탄올ChuandongChemicalCAS 64-17-5
에틸 아세테이트 Chuandong화학CAS 141-78-6
액체 크로마토 그래프WatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWaters V4.2MS 제어 소프트웨어
n-부틸 알코올ChuandongChemicalCAS 71-36-3
석유 에테르ChuandongChemicalCAS 8032-32-4
사중극자 비행 시간 질량 분석기WatersSYNAPT XS
UNIFIWaters데이터 분석 소프트웨어

참고문헌

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  20. Sawada, Y., et al. Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants. Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).
  21. Zhang, X. M., et al. Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification. Food Chem. 364, 130450(2021).
  22. Downard, K. M. Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the "intensity-fading" approach. Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).

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