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방법 논문

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

2.3K 조회수

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DOI:

10.3791/66780

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2024년 5월 10일

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1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

복강 내 약물 투여는 췌장 손상을 유발하기 위한 안전하고 효과적인 비침습적 접근법입니다. 이 연구는 다양한 정도의 췌장 손상을 유발하기 위해 마우스에 대한 5가지 고유한 복강 내 주사 프로토콜을 비교하고 중증 급성 췌장염(SAP)에 대한 병리학적 변화와 치료 전략을 조사하기 위해 중증 췌장 손상 모델을 설정했습니다.

초록

사망률이 높은 중증 급성 췌장염(SAP)의 치료는 임상적으로 중대한 과제입니다. 동물 모델을 사용하여 SAP와 관련된 병리학적 변화를 조사하면 잠재적인 치료 표적을 식별하고 새로운 치료 접근법을 탐색하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전 연구에서는 주로 소듐 타비아우로콜레이트의 역행성 담관 주입을 통해 췌장 손상을 유발했지만, 수술 손상이 동물 모델의 품질에 미치는 영향은 아직 불분명합니다. 이 연구에서는 C57BL/6J 마우스에서 췌장 손상을 유발하기 위해 다양한 빈도의 복강 내 Caerulein 주사와 다양한 용량의 LPS를 결합한 주사를 사용하고 5가지 복강 내 주사 프로토콜에 걸쳐 손상 정도를 비교했습니다. 마우스에서 급성 췌장염을 유발하는 것과 관련하여, 5일 이내에 80%의 높은 사망률을 초래하는 복강 내 주사 프로토콜이 제안됩니다. 구체적으로, 마우스는 Caerulein(50μg/kg)을 매일 10회 복강내 주사한 후, 마지막 Caerulein 투여 1시간 후에 LPS(15mg/kg)를 주사했습니다. 주사 약물의 빈도와 복용량을 조절함으로써 췌장 손상의 중증도를 효과적으로 조절할 수 있습니다. 이 모델은 제어성이 뛰어나고 복제 주기가 짧아 고가의 장비 없이도 한 명의 연구자가 완성할 수 있습니다. 인간 SAP에서 관찰된 주요 질병 특성을 편리하고 정확하게 시뮬레이션하는 동시에 높은 수준의 재현성을 입증합니다.

서론

중증 급성 췌장염은 소화기 계통 질환 영역 내에서 빠른 발병, 빠른 진행, 높은 사망률을 특징으로 한다1. 높은 치사율은 항상 임상 연구의 주요 초점이었습니다. 임상 조건의 예측할 수 없는 변화, 질병 증상의 이질성, 인간 표본의 제한된 가용성으로 인해 동물 모델을 확립하는 것이 질병 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다.

소듐 타우로콜레이트를 총담관에 역행성 주입하는 것은 일반적으로 SAP2의 랫트 모델을 만드는 데 사용됩니다. 이 모델링 기법은 췌장 담도 폐쇄를 시뮬레이션하고 담즙 및 췌장액의 역류를 유도함으로써 SAP 동물 모델 복제에서 높은 성공률을 보여줍니다. 그러나 침습적 수술은 동물 모델 자체에 영향을 미친다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 이 방법은 주로 실험 대상으로 사용되는 쥐 및 개와 같은 대형 동물에 국한됩니다. 십이지장 삽관(duodenal intubation)3, 직접 십이지장 천자(direct duodenal puncture)4 및 담관-췌관관(bile duct-pancreatic duct)5의 직접 천자를 포함한 대체 기법이 모델링 목적으로 자주 활용된다.

복강 내 주사 및 식이 모델링 방법은 모든 크기의 동물에 적용할 수 있는 비침습적 이점을 제공합니다. 콜린 결핍 에티오닌(CDE)6을 공급하여 유도된 SAP의 마우스 모델은 조절이 잘 불가능한 고혈당증 및 저칼슘혈증과 같은 특정 합병증을 나타내므로 새로운 진단 및 치료 접근법을 평가하기에 적합하지 않습니다. 한편, L-아르기닌7과 결합된 Caerulein의 복강내 주사는 마우스에서 급성 췌장염을 유발하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법을 나타냅니다. 특히, 콜레시스토키닌 유사체인 Caerulein의 반복적인 복강 내 투여는 발병기전, 염증 및 재생 과정을 포함하여 이 파괴적인 질병과 관련된 다양한 측면을 조사하는 데 매우 적합한 접근 방식을 제공합니다. 콜레시스토키닌(cholecystokinin, CCK)과의 구조적 유사성으로 인해 카에룰레인은 담낭 수축과 췌장 효소 분비를 효과적으로 자극하여 효소 분비의 불균형을 초래하고 이후 자기 파괴를 일으킨다8. 유비쿼터스이며 병원체 관련 분자 패턴 분자로 광범위하게 연구된 LPS(Lipopolysaccharide)는 복강 내 주입을 통해 Caerulein과 결합하여 SAP의 효과적인 마우스 모델을 확립할 수 있습니다. 이 조합은 상당한 수의 염증성 사이토카인을 빠르게 유발하고 방출하여 과도한 국소 및 전신 염증을 유발합니다. 여러 연구에서 LPS와 결합된 Caerulein의 복강 내 주입을 통해 마우스에서 SAP 모델을 유도했다고 보고했습니다. 이는 Caerulein의 복강 내 주사가 마우스에서 췌장 부종과 출혈을 유발할 수 있는 반면, LPS를 추가하면 즉시 췌장 괴사를 유발하고 전신 염증 반응, 패혈증 및 심지어 장기 부전을 악화시킬 수 있다는 사실에 기인할 수 있습니다. 현재 복강내 Caerulein 주사의 용량과 빈도에 차이가 있을 뿐만 아니라 추가 LPS 용량에도 불일치가 있습니다. 마우스 SAP 모델에서 일관성을 달성하는 것은 도전적입니다 9,10,11,12; 따라서 이상적인 모델을 얻기 위해 표준화된 프로토콜을 수립할 필요가 있습니다. 이 기사에서는 마우스의 복강 내 주사를 위한 프로토콜을 설명하고 LPS의 최적 주입 빈도와 추가 투여량을 조사합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 Anhui University of Science and Technology(중국 화이난) 제1부속병원 윤리위원회에서 검토 및 승인했습니다(윤리 강령: 2023-KY-905-001). 이 연구는 모든 동물 절차에서 연구 설치류의 관리 및 사용에 대한 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침을 따랐습니다. 본 연구에는 20-30g 무게의 C57BL/6J 성체 마우스가 사용되었습니다. 마우스는 통제된 조건(약 21°C, 12시간 교대로 낮과 밤을 번갈아 가며 투여) 하에서 1주일 동안 동물 실험실에 수용되었습니다. 생쥐는 전체적으로 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 준비

  1. 84마리의 건강한 C57BL/6J 마우스를 대조군, 췌장 손상(PI) I, PI II, PI III, PI IV 및 PI V를 포함한 6개 그룹에 할당합니다.
  2. 모델링 절차를 시작하기 전에 각 마우스 그룹에 귀 노치를 표시하고 12시간 동안 금식하도록 합니다.

2. 유도 약물 희석제의 제조

  1. Caerulein(1mg)을 PBS 1mL에 녹이고 -20°C에서 냉장 보관합니다.
  2. 약물의 복강 내 주입 1시간 전에 실험용 마우스의 체중을 측정하고 기록합니다.
  3. 모든 마우스의 총 체중을 기준으로 50μg/kg의 비율로 필요한 Caerulein의 총 질량을 추출합니다.
  4. 얻어진 Caerulein 약물을 PBS로 다시 희석한다.
    참고: PBS 희석의 총 부피는 모든 마우스의 총 중량 값의 5배에 해당해야 합니다. LPS 희석액을 얻기 위해 동일한 희석 방법을 사용하였다.

3. 복강내 주사

주의: 복강내 주사는 모델을 유도하기 위해 보충 표 1 에 요약된 프로토콜에 따라 마우스의 각 그룹에 투여하였다. 추가로 10마리의 마우스를 그룹화하여 7일 생존율을 관찰하도록 처리했습니다.

  1. 주사기를 삽입할 때 장기가 손상되지 않도록 쥐의 배가 위를 향하고 머리가 꼬리보다 낮은 위치에 있도록 쥐를 잡고 잡습니다.
  2. 75% 알코올 면봉을 사용하여 쥐의 복부를 소독합니다.
  3. 주사기를 오른손에 잡고(≤0.5/≥0.3 크기의 바늘 사용) 복부 흰색 선의 왼쪽 피하 피부에 바늘을 삽입합니다.
    참고 : 다음 주입을 위해 오른쪽으로 변경하십시오.
  4. 바늘이 피하층에 도달하면 약 3-5mm 앞으로 이동시킨 다음 주사기 바늘을 복강에 45° 각도로 삽입합니다. 이 시점에서 약간의 저항을 느껴야 합니다.
  5. 바늘을 움직이지 않고 물질을 천천히 주입하십시오.
    참고: 단일 복강 내 주사의 부피와 같은 마우스 체중 값의 5배를 초과하지 마십시오.
  6. 주입 후 바늘을 빼내고 멸균 면봉으로 주사 부위를 부드럽게 마사지하고 눌러 약물이 마우스의 복강 내로 완전히 확산시킵니다.
  7. 새 주사기를 사용하여 다음 실험용 마우스로 반복합니다.

4. 오픈 필드 행동 능력 테스트

참고: 마지막 복강 내 주사 후 12시간 후, 마우스의 총 활동 거리와 부동성 시간을 평가하기 위해 개방 필드 행동 능력 테스트를 수행했습니다.

  1. 카메라 바로 아래에 4개의 동일한 흰색 상자를 놓습니다.
  2. 비디오 케이블을 사용하여 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
  3. 실험을 시작하기 전에 실험 상자가 깨끗하고 냄새가 없는지 확인하십시오.
  4. 동물을 실험자로부터 반대쪽을 향하게 하여 그리드 중앙에 놓고 10분 동안 환경에 적응하도록 합니다.
  5. 비디오 추적 소프트웨어를 시작하고 파일 메뉴를 클릭하여 새 실험을 만듭니다.
  6. 4개의 동시 시야에 대한 모니터링을 설정합니다.
  7. 상자 내에서 움직일 수 있는 실험체의 길이와 너비를 실시간 모니터링 화면(30cm × 30cm)에 표시합니다.
  8. 설정이 완료되면 비디오 감시 및 녹화를 시작합니다.
  9. 15분 동안 쥐의 활동을 기록합니다.
  10. 실험이 끝나면 동물을 그리드에서 제거하고 케이지로 되돌려 보냅니다. 이산화염소가 함유된 살균제를 사용하여 그리드를 철저히 청소하십시오.

5. 생쥐의 말초 혈액 채취 및 검사

  1. 쥐를 안락사시킨다(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름).
    1. 복강내 주사 후 36시간 후에 실험용 마우스에 대해 안락사를 수행합니다. 안락사 전에 쥐의 체중을 측정하고 기록합니다.
      참고: 10% 클로랄 하이드레이트 0.18mL를 복강 내로 투여하여 발가락이나 꼬리의 자극에 반응하지 않도록 합니다.
    2. 왼손으로 마우스를 고정하고 오른손으로 가위를 잡고 마우스의 한쪽 수염을 자릅니다.
    3. 눈 주위의 피부를 부드럽게 눌러 안구의 울혈과 돌출을 유도합니다.
    4. 구부러진 집게를 사용하여 안구를 잡고 빠르게 제거하여 미세 원심분리기 튜브에 말초 혈액을 수집합니다.
      참고: 두 가지 다른 유형의 미세 원심분리기 튜브가 사용되었는데, 하나는 항응고제를 포함하고 다른 하나는 포함하지 않았습니다.
    5. 동시에 왼손 중지로 쥐의 심장 부위를 가볍게 눌러 심장의 펌핑 속도를 높입니다.
  2. 항응고제 없이 말초 혈액을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
  3. 효소 속도 방법 및 효소 순환 방법을 통해 자동 생화학 분석기를 사용하여 혈청 아밀라아제(Amy) 및 리파아제(Lip)의 농도를 측정합니다(제조업체의 지침에 따름).
  4. 상용 화학발광 이미저를 사용하는 화학발광 방법을 사용하여 혈장 내 Pro Calcitonin(PCT)과 같은 염증 지표 수준을 결정합니다(제조업체의 지침에 따름).
  5. ELISA 키트를 사용하여 마우스 혈청의 HMGB-1, IL-6 및 TNF-α 수치를 측정합니다(제조업체의 지침에 따름).
  6. 항응고제로 처리된 말초 혈액을 완전 자동 혈액 세포 분석기를 사용하여 분석하여 관련 매개변수를 평가합니다.

6. 췌장 조직을 채취하고 파라핀 절개 준비

  1. 마우스를 누운 자세로 놓고 폼 플레이트에 고정합니다.
  2. 해당 부위를 면도하고 소독한 다음 복부 중앙을 절개하고 소장관을 오른쪽으로 뒤집어 췌장을 완전히 노출시킵니다.
  3. 십이지장과 유문을 분리하고 췌장 아래의 소장을 찾습니다. 장관을 따라 췌장 조직을 완전히 풀어줍니다.
  4. 이빨이 없는 집게를 사용하여 비장을 조이고 부드럽게 위로 당깁니다.
    알림: 췌장 조직을 직접 만지지 말고 전체 해리 과정에서 과도한 힘을 사용하지 마십시오.
  5. 췌장 머리까지 췌장 후방 인대 조직을 날카롭게 절제하고 담관과 혈관을 분리합니다.
  6. 췌장 조직을 제거하고 흡수성 종이로 표면 수분을 두드려 말리고 무게를 측정하고 기록합니다.
  7. 췌장 조직의 절반을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 나머지 절반은 -80°C의 냉장고에 보관합니다.
  8. 아래 단계에 따라 췌장 파라핀 절개를 준비합니다.
    1. 75% 알코올로 고정된 췌장 조직을 청소하고 약 0.5cm × 0.5cm 크기로 자릅니다.
    2. 조직을 70% 에탄올에 20분, 80% 에탄올에 20분, 90% 에탄올에 15분 동안 담그십시오.
    3. 매번 15분 동안 95% 에탄올로 조직을 두 번 처리한 다음 매번 5분 동안 100% 에탄올로 두 번 처리합니다.
    4. 투명도를 위해 크실렌 용액으로 12분 및 5분씩 두 차례에 걸쳐 조직을 처리합니다.
    5. 투명한 조직을 65°C의 왁스 탱크에 1시간 동안 담그십시오.
    6. 녹인 파라핀에 조직을 넣고 식힌다. 슬라이서(두께: 5μm)로 췌장 파라핀 절편을 얻습니다.
    7. 얻어진 파라핀 조각을 45°C의 물에 평평하게 하고 장착하고 건조시킵니다(베이킹 조건: 40-14시간 동안 16°C).

7. Hematoxylin 및 Eosin (H &E) 염색

  1. 췌장 파라핀 절편을 크실렌 I과 II에 30분 동안 넣은 다음 무수 95%, 85% 및 75% 알코올에 각각 5분 동안 넣고 초순수를 5분 동안 넣습니다.
  2. 헤마톡실린으로 세포핵을 160초 동안 염색한 다음 흐르는 물로 천천히 헹굽니다.
  3. 염산 알코올 분화 용액을 5-10초 동안 도포한 다음 흐르는 물로 빠르게 헹굽니다.
  4. 섹션을 무수 알코올로 5분 동안 처리합니다.
  5. 세포질을 에오신으로 30초 동안 배양한 다음 흐르는 물로 헹굽니다.
  6. 섹션을 75, 85%, 95% 및 100% 에탄올에 각각 10초 동안 담근 다음 크실렌으로 5분 동안 처리하여 탈수합니다.
  7. 마지막으로 중성 수지로 섹션을 밀봉하고 현미경으로 관찰합니다.
  8. 병리학적 채점 및 기준 수행13.
    참고: 췌장염의 중증도는 부종, 선상괴사, 출혈, 출혈 및 지방 괴사, 염증성 및 혈관 주위 염증과 같은 지표를 기반으로 결정합니다. 점수13을 위해 이전에 게시된 구현 지침을 사용합니다.

8. 면역조직화학적 염색

  1. 췌장 조직의 파라핀이 포함된 부분을 크실렌에서 왁스를 제거한 후 에탄올 용액의 그래디언트에 다시 수화합니다.
  2. 30분 막 파열 후 20분 동안 3%H2O2를 사용하여 내인성 효소 차단을 수행합니다.
  3. 실온에서 5% 소 혈청으로 항체를 30분 동안 차단한 다음 토끼 항-HMGB1을 1:1500으로 희석하여 4°C에서 밤새 배양합니다.
  4. 절편을 PBS로 헹구고 37°C에서 30분 동안 해당 2차 항체에 배양합니다. 그 후, DAB 색상 개발, 헤마톡실린 대조염색을 수행하고 중성 검으로 밀봉합니다.

9. 췌장 절편에서 세포사멸을 감지하기 위한 TUNEL 방법

  1. 췌장 파라핀 절편을 크실렌에 5분 동안 왁스를 제거하고 두 번 반복한 다음 그라디언트 에탄올(100% 5분, 90% 2분, 70% 2분, 증류수 2분)로 세척합니다.
  2. PBS를 사용하여 파라핀 섹션을 둘러싼 과도한 액체를 씻어냅니다. 각 검체를 100μL의 Proteinase K로 처리하여 조직을 완전히 덮을 수 있습니다. 37°C에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 샘플을 PBS에 3 번 담그고 매번 5 분 동안 담그십시오.
    참고: Proteinase K 용액은 원래 Proteinase K(200μg/mL) 용액을 PBS로 1:9(부피)의 비율로 희석하여 제조되었으며, 그 결과 DNase를 제외한 최종 농도는 20μg/mL가 되었습니다. Proteinase K의 철저한 세척은 후속 라벨링 반응과의 간섭을 피하는 데 필수적입니다.
  3. 적당량의 3%H2O2(PBS로 희석)를 조직에 첨가하여 완전히 침투시키고 20분 동안 배양합니다. PBS로 티슈를 3분 동안 5회 헹굽니다.
    알림: 파라핀 부분은 촉촉한 상태를 유지해야 합니다. 조직에서 내인성 과산화효소를 비활성화하기 위해, 배양 시간은 3%H2O2에 의한 DNA 파손으로 인한 위양성을 방지하기 위해 너무 길지 않아야 합니다.
  4. 테스트할 샘플의 전체 영역을 50μL의 Equilibration buffer로 덮고 10분 동안 배양합니다.
  5. 가능한 한 많은 평형 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 각 조직 샘플에 56μL의 TdT 배양 완충액을 추가하고 1시간(실온에서) 동안 배양합니다.
    알림: 슬라이드를 건조시켜서는 안 되며 빛에 노출되지 않도록 해야 합니다. TdT 배양 완충액은 제조사의 지침에 따라 제조하였다(재조합 TdT 효소: 비오틴-dUTP 라벨링 믹스: 평형 완충액 = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
  6. 조직 샘플을 즉시 PBS로 세척하십시오. 5분씩 4번 헹굽니다. 여과지로 샘플 주변의 과도한 PBS 용액을 부드럽게 제거합니다.
  7. Streptavidin-HRP 반응을 위해 이전에 희석된 Streptavidin-HRP 반응 용액 100μL(Streptavidin-HRP: TBST = 1: 300)를 각 조직 샘플에 추가합니다. 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 샘플을 세척하고 각각 5분 동안 3번 헹굽니다.
  8. 각 파라핀 섹션에 50μL의 DAB를 추가하여 DAB 염색을 수행합니다. 현미경으로 염색을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 양성 염색이 나타나면 즉시 슬라이드를 습한 상자에 넣으십시오. 순수한 물로 씻어 반응을 멈추십시오.
  9. 슬라이드를 헤마톡실린 염색 용액에 3-5분 동안 담근 다음 순수한 물로 헹굽니다.
  10. 헤마톡실린 분화 용액에서 약 2초 동안 분화한 후 순수한 물로 즉시 헹굽니다.
  11. 몇 초 동안 헤마톡실린 리블루잉 용액을 사용하여 파란색으로 변색하고 순수한 물로 슬라이드를 깨끗이 헹굽니다.
    알림: 핵 염색 후 현미경 검사를 수행하십시오. 염색이 너무 어두우면 슬라이드를 분화 용액으로 되돌립니다. 염색이 너무 옅으면 핵 염색 단계에서 염색 과정을 다시 시작하십시오.
  12. 신선한 무수 에탄올 4라운드로 샘플을 각각 5분 동안 탈수합니다. 그런 다음 부탄올에 5분 동안 담그고 크실렌에 5분 동안 담가둡니다. 마지막으로 신선한 크실렌을 5분 더 사용합니다.
  13. 중성 껌을 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 자연 건조시키거나 60°C 오븐에서 건조시키세요.
  14. 백색광 현미경을 사용하여 조직학적 검사를 수행합니다. Apoptotic nuclei는 갈색으로 나타납니다.
  15. 해당 자가사멸 지수(AI)를 계산합니다.
    참고: 이중 맹검 방식으로 슬라이드를 관찰하십시오. TUNEL 포지티브 슬라이드에서 고배율(400x)에서 5개의 포지티브 영역을 무작위로 선택하고 각 영역에서 최소 100개의 아시나 셀을 세어 포지티브 셀의 백분율을 결정합니다. AI = (총 자가사멸 세포 수 / 총 세포 수) × 100%.

10. 유세포 분석

  1. 신선한 췌장 조직을 얻고 PBS로 관류한 후 철저히 세척하십시오.
  2. 0.5% 콜라겐분해효소 IV 소화액을 준비하고 멸균 조직 가위를 사용하여 췌장 조직을 적절하게 소화합니다.
  3. 췌장 조각과 액체 탁도의 상태에 따라 5% BSA 분해 종료 용액을 추가하고 혼합물을 저온에서 5분(~300 x g, 4°C) 동안 원심분리합니다.
  4. 소화를 종료하기 위해 상층액을 버리십시오.
  5. 췌장 세포를 재현탁시키기 위해 페닐 메탄 설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 2.5% 소 태아 혈청 세포 현탁액을 함유한 세포 배양 배지를 준비합니다.
  6. 200 메쉬 나일론 메쉬를 통해 췌장 선상 세포 현탁액을 여과하여 세포 여과를 통해 세포 현탁액을 얻습니다.
  7. 저온에서 췌장 아시나 세포 현탁액을 원심분리합니다(10.3단계에서 언급한 조건을 따름).
  8. 상층액을 버립니다.
  9. 미리 냉각된 PBS로 세포를 세척합니다.
  10. 원심 재현탁을 통해 사전 냉각된 1x 결합 완충액에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
  11. 세포 농도를 조정한 후 제조업체의 지침에 따라 Annexin V-FITC/PI로 췌장 아시나 세포에 라벨을 붙입니다.
  12. 1시간 이내에 유세포 분석을 사용하여 췌장 선상 세포에서 세포 사멸을 검출합니다.

11. Caspase-3 및 HMGB-1의 웨스턴 블롯 검출

  1. 췌장 단백질을 추출합니다.
    1. 췌장 조직 50mg을 추출하여 작은 조각으로 자릅니다.
    2. RIPA 용해 완충액 1mL(PMSF 및 인산화 프로테아제 억제제 포함)를 추가합니다.
    3. 전기 그라인더를 사용하여 췌장 조직을 얼음에 5분 동안 균질화합니다.
    4. 균질화된 조직을 얼음 위에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
    5. 균질액을 4°C에서 4,500 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
    6. 상층액 용액을 수집하여 -80 °C에서 보관합니다.
  2. 단백질 정량화를 수행합니다.
    1. 일정량의 BSA 표준 샘플(25mg/mL)을 0.5mg/mL 농도로 희석합니다.
    2. BCA 용액 A 50 부피와 BCA 용액 B 1 부피를 혼합하여 일정량의 BCA 작업 용액을 준비하여 철저하고 균일한 혼합을 보장합니다.
    3. BSA 표준 시료를 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 및 20 μL 순서로 96웰 플레이트의 표준 시료 구멍에 넣습니다. 각 구멍의 부피를 증류수로 균형을 이루어 총 부피가 20 μL가 됩니다.
    4. 시료 구멍에 2μL의 시료를 추가한 다음 희석을 위해 18μL의 증류수를 순차적으로 추가합니다(1:9).
    5. 각 웰에 200μL의 BCA 작업 용액을 채우고 약 20-30분 동안 37°C에서 그대로 둡니다.
    6. 562nm의 파장에서 흡광도를 측정합니다. 표준 곡선을 기반으로 샘플의 단백질 농도를 계산합니다.
    7. 특정 부피의 RIPA 크래킹 용액과 희석 버퍼를 추가하여 농도가 적절한 것으로 간주되는 5-10μg/μL에 도달할 때까지 샘플을 희석합니다.
    8. 단백질 변성 후 -20°C(100°C, 10분)에서 샘플을 보관합니다.
  3. 웨스턴 블로팅을 수행합니다.
    1. SDS-PAGE를 준비합니다.
      1. 접착제 제조 금형을 설치하고 밀봉 성능을 검사합니다.
      2. 10% 분리 접착제에 TEMED를 넣고 골고루 섞는다.
      3. 기포를 피하면서 부피의 약 2/3를 차지하는 혼합물을 금형에 주입합니다.
      4. 이소프로판올을 금형에 넣고 접착제를 약 40분 동안 누릅니다.
      5. 동일한 프로그램을 사용하여 5% 농축 접착제를 구성하십시오.
      6. 이소프로판올을 붓고 즉시 접착제를 첨가하십시오.
      7. 접착제가 완전히 중합 될 때까지 빗을 수직으로 놓습니다.
    2. 전기영동 작업을 수행합니다.
      1. 예상되는 실험 제어 순서에 따라 테스트할 샘플을 역순으로 SDS-PAGE 접착제의 샘플링 구멍에 추가합니다.
      2. 단백질 마크를 동시에 추가하여 표적 단백질과 내부 기준 단백질의 위치를 확인합니다.
      3. 샘플 추가가 완료된 후 샘플을 전기영동 탱크에 넣습니다.
      4. 처음에는 80V에서 30분 동안 작동한 다음 겔을 실행하여 100V에서 60분 동안 단백질을 분리합니다.
        알림: 과도한 전기영동을 피하기 위해 브로모페놀 블루의 위치에 주의를 기울여야 합니다.
    3. 단백질 전달을 수행합니다.
      1. 오른쪽 상단 모서리에 있는 PVDF 필름을 잘라 표시로 사용합니다.
      2. PVDF 필름을 메탄올 용액에 5-10초 동안 넣어 활성화합니다.
      3. PVDF 필름을 전기영동 버퍼에 약 15분 동안 담그십시오.
      4. 전기영동 후 겔을 조심스럽게 제거하고 여분의 겔을 잘라내어 겔이 공정 내내 젖은 상태로 유지되도록 합니다.
      5. 네거티브 플레이트 → 스폰지 → 여과지 → 젤 → PVDF 필름 3 층 → 여과지 → 스폰지 → 양극판 순서로 부목을 조립합니다.
        알림: 젤과 PVDF 필름 사이에 기포가 없는지 확인하십시오.
      6. 조립된 cl을 배치amp 주변에 얼음 조각이 있는 젖은 회전 홈(검은색에서 검은색으로)에 넣습니다.
      7. 전원을 켜고 400mA에서 100분 동안 필름 전사를 시작합니다.
    4. PVDF 필름 밀봉 및 1차 및 2차 항체의 배양을 수행합니다.
      1. 전사 후 PVDF 필름을 부드럽게 제거하고 TBST로 10분 동안 헹구고 이 과정을 3-5회 반복합니다.
      2. PVDF 필름을 5% 탈지유에 2시간 동안 밀봉합니다.
      3. PVDF 필름을 제거하고 TBST로 10분 동안 헹구고 이 과정을 4회 반복합니다.
      4. PVDF 필름과 희석된 1차 항체를 4°C의 냉장고에 넣고 부드럽게 흔든 후 밤새 배양합니다.
      5. 다음날 PVDF 필름을 제거하고 TBST로 10분 동안 헹구고 이 과정을 4회 반복합니다.
      6. PVDF 필름을 HRP 표지 2차 항체 희석액에 약 2시간 동안 배양합니다.
      7. PVDF 필름을 TBST로 10분 동안 헹구고 이 과정을 4회 반복합니다.
    5. 필름을 노출시키고 분석합니다.
      1. 준비된 ECL 용액을 필름에 골고루 바릅니다.
      2. 노출계가 있는 어두운 방에서 필름을 약 2-3분 동안 노출시킨 후 보관하십시오.
      3. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행합니다.

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결과

실험적 마우스 모델링 과정은 그림 1에 나와 있습니다. 주입 완료 12시간 후, 오픈 필드 비디오 레코더를 사용하여 5주기 동안 다양한 실험 그룹의 마우스의 이동 거리와 부동성 지속 시간을 모니터링했습니다(그림 2A). 5 사이클 동안 PI V 그룹의 마우스는 3 분 이내에 낮은 수준의 이동 거리를 유지한 반면, 3 분 이내의 부동성 비율은 각 후속 사이클마다 증가했습니다 (그림 2B, C). 또한, 5 사이클 동안 다른 실험 그룹에서 마우스의 총 이동 거리에 대한 통계 분석이 수행되었습니다. PI V 그룹은 다른 실험 그룹에 비해 총 이동 거리가 가장 작았으며 그 차이는 통계적으로 유의했습니다(p < 0.001)(그림 2D,E

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토론

현재 중증 급성 췌장염 환자의 높은 사망률을 개선할 수 있는 효과적인 수단이 부족합니다. 면역 안정성 기전을 향상시키는 약물의 효능을 조사하는 것이 중요합니다. 중증 급성 췌장염에 대한 이상적인 동물 모델이 시급히 필요합니다. C57BL/6J 유전적 배경을 가진 마우스는 SAP 병태생리학 연구를 포함한 생물의학 연구에 널리 사용됩니다. B6J 마우스에서 70년 이상 진행된 유전적 분화로 인해 여러 엑손이 자발적으로 결실되었고15 이로 인해 Caerulein에 의한 췌장 손상에 대한 민감도가 감소했다16. 또한 급성 췌장염의 기존 동물 모델은 외과적 외상이나 대형 동물에만 적용할 수 있는 등의 한계가 있어 이러한 모델을 사용한 과학적 연구에 어려움을 겪습니다. 따라서 이 특정 유전자 균주를 사용하여 안정적이고 효율적이며 편리한 동물 모델을 구축하는 것이 매우 중요합니다.

카에룰레인(Caerulei...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Huainan City의 건강 및 의료 과학 연구 프로젝트(No. HNWJ2023005); Huainan City의 시립 지도 과학 기술 계획 프로그램(No.2023151); Anhui Provincial College 학생들의 혁신 및 기업가 정신 교육 프로그램 (No. S202310361254); "50· Stars of Science and Technology" 화이난시와 안후이성 핵심 임상 전문 건설 프로젝트의 혁신 팀. 관련 테스트 데이터를 제공해 주신 Anhui University of Science and Technology의 First Affiliated Hospital 실험실 부서에 감사를 표하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
20&배; 구연산 항원 복구 용액(pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국G1202-250 ml
아밀라아제마인드레이, 중국
Annexin V-FITC/PIWuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국  G1511  1:20으로 희석
Anti-HMGB1 토끼 pAB우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 GB11103  1:1800
BCA 단백질 정량 검출 키트우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 기술 유한 유한 기술 유한 회사 중국G2026-200T
BD FACSCanto II 유세포 분석기BD 생명 과학, 산호세, 캘리포니아, 95131, 미국BD FACSCanto II
BSA우한 servicebio 기술 유한 공사, 중국GC305010-100g
C57BL/6J CavionExperimental Animal Co., 창저우, 중국라이센스 번호 SCXY (Su) 2011– 0003
세룰타이드  MCE, 뉴저지, 미국17650-98-5 50 & 마이크로; g/kg
화학발광 이미저Cytiva CO.,LTD.; 미국
구연산 항원 복구 용액(건조 분말 pH 6.0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국G1201-5 L
콜라게나제 IV우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국  GC3050140.5 mg/mL
DAB(SA-HRP) Tunel 세포 세포사멸 검출 키트Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, 중국G1507-100 L
치수 EXL(LM 통합 화학 시스템 포함Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield, USAYZB/USA 8311-2014
ECL 개발자Wuhan servicebio Technology Co.,Ltd, 중국
에오신 염료(알코올 용해성)우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국G1001-100 ml
EthoVision XT  Noldus, 네덜란드
FITC 라벨 염소 안티 토끼 IgG우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 공사, 중국GB22303  1:50으로 희석
전자동 혈액 세포 분석기Zybio Inc. 중국  Zybio-Z3 CRP
GapDH우한 servicebio Technology Co.,Ltd, 중국GB11103  1:1500으로 희석
헤마트톡실린 블루 리턴 용액우한 servicebio Technology Co.,Ltd, 중국G1040-500 ml
헤마트실린 분화 솔루션우한 servicebio Technology Co.,Ltd, 중국G1039-500 ml
헤마트톡실린 염료우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA 키트njjcbio Co., Ltd, 중국
균질화기우한 서비스바이오 기술 Co., Ltd, 중국KZ-III-F; IC111150 100222
HRP 표지 염소 안티 토끼 IgG우한 서비스바이오 테크놀로지 유한 유한 유한 회사 중국GB23303  1:1500
IL-6 ELISA 키트우한 서비스 바이오 테크놀로지 유한 유한GEM0001
리파아제 마인드레이, 중국
지포다당류 우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국GC20500915 mg/kg
저온 고속 원심분리기Changsha Pingfan Apparatus& Instrument Co., Ltd., 중국TGL-20M
멤브레인 파괴 액체우한 서비스바이오 기술 Co., Ltd, 중국G1204
마이크로톰Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; 중국CR-601ST
나일론 메쉬우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국200 메쉬
원스텝 TUNEL 세포 사멸 검출 키트(DAB 염색 방법)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, 중국G1507-100T
파라핀 조직 포매 기계PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; 중국 창저우PBM-A
병리학적 조직 건조 장치PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; 창저우, 중국PHY-III
인산염 완충 식염수우한 서비스 바이오 기술 유한 회사G4202-100ML
PMSF우한 서비스 바이오 기술 유한 회사G2008-1 ml
양성 형광 현미경올림푸스 공사, 도쿄, 일본BX53
프로 칼시토닌마인드레이, 중국
PVDF 멤브레인Millipore, 미국0.22 & micro; m
RIPA우한 서비스바이오 기술 유한 회사, 중국G2002-100 ml
SDS-PAGE비요타임 바이오테크놀로지, 중국P0012A
TNF-&알파; ELISA 키트우한 servicebio Technology Co., Ltd, 중국GEM0004
초음파 수조DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; 중국KQ-200KDE
웨스턴 블롯Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국
웨스턴 블롯 이미징 시스템글로벌 생명 과학 IP Holdco LLC, 일본Amersham ImageQuant 800 
월풀 믹서SCILOGEX; 미국
) 로 희석 회사 중국 중국

참고문헌

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