쥐에서 편측 경추 척수 반절개 후 완충 횡격막 활동의 기능적 회복 평가

요약

호흡기 합병증은 경추 척수 손상(cSCI)이 있는 개인의 주요 사망 원인입니다. cSCI의 동물 모델은 기계론적 평가 및 전임상 연구에 필수적입니다. 여기에서는 쥐에서 편측 C₂ 척추 반절 (C₂SH) 후 횡격막 근육 (DIAm) 활동의 기능적 회복을 평가하는 재현 가능한 방법을 소개합니다.

초록

cSCI 후 DIAm의 활성화는 부상 정도에 따라 영향을 받을 수 있습니다. 본 논문은 쥐에서 호흡하는 동안 완곡성 동측 횡격막(iDIAm) 근전도(EMG) 활동을 방해하는 cSCI의 일방적_C2 반절개(_C2SH) 모델을 설명합니다. DIAm 모터 제어의 회복을 평가하려면 먼저_C2SH로 인한 적자 정도를 명확하게 설정해야 합니다. 호흡 중 iDIAm EMG의 완전한 초기 손실을 확인함으로써 후속 회복은 부재 또는 존재로 분류할 수 있으며 EMG 진폭을 사용하여 회복 정도를 추정할 수 있습니다. 또한,_C2SH후 급성 척추 쇼크 기간 후 호흡 중 iDIAm EMG 활성이 지속적으로 부재하는 것을 측정함으로써 초기_C2SH의 성공을 검증할 수 있습니다. 반대측 횡격막(cDIAm) EMG 활성을 측정하면 신경 가소성을 반영하는 C₂SH의 보상 효과에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 더욱이, 깨어 있는 동물의 DIAm EMG 기록은 C₂SH 이후 DIAm의 운동 제어에 대한 중요한 생리학적 정보를 제공할 수 있습니다. 이 기사에서는 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C₂SH 모델을 위한 방법을 설명하며, 이는 호흡 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

서론

미국에는 300,000명 이상의 척수 손상(SCI) 환자가 있으며, 그 중 약 절반이 경추 손상을 가지고 있습니다¹. 이러한 부상은 심각한 웰빙 손실을 초래하고 개인, 가족 및 의료 시스템에 재정적 부담을 줍니다. 다행히도 대부분의 SCI는 불완전하여 예비 경로를 강화할 수 있는 잠재력을 제공합니다¹. 이러한 신경가소성은 인공호흡 및 비인공호흡 행동에 중요한 DIAm 활동을 포함한 적어도 일부 기능의 회복을 허용할 수 있습니다. 따라서 신경 가소성을 촉진하는 것은 SCI² 환자를 돕기 위한 유망한 연구 방법입니다.

SCI의 설치류 모델은 인간의 건강을 개선하기 위한 치료법의 발견에 실질적으로 기여할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 신경 가소성을 연구하는 데 사용되는 SCI의 고전적인 모델 중 하나는 C₂ (C₂SH)에서 척수의 편측 횡단 (반절개)으로, 반대쪽은 ^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}을 그대로 유지합니다. 횡격막 출력에 대한 C₂SH의 효과와 보존된 반대측 경로의 중요성은 100여 년 전 Porter¹²에 의해 처음 밝혀졌으며, 그의 중요한 논문은 호흡 신경 가소성에 대한 현대 연구의 토대를 마련했습니다. _C2SH모델은 호흡 리듬 생성¹⁴의 출력을 전달하는 전운동 뉴런을 포함하는 수질의 rVRG(rostral ventral respiratory group)로부터의 하강 입력을 중단한다. 이러한 rVRG 전운동 뉴런은 또한 흥분성 신경 드라이브를 횡격막 운동 뉴런으로 전달합니다(그림 1). 여러 연구자들이 C₂SH 모델^10,11,15,16에 대해 다른 접근 방식을 취했으며, 이는 연구 간 회복의 변동성 중 일부를 부분적으로 설명할 수 있습니다. 간단히 말해서, 접근 방식은 등쪽 funiculi를 보존하거나, 완전한 반절개를 수행하거나, 동측 rVRG의 하강 입력을 완전히 중단하지 않는 측면 부분 횡단을 수행하는 측면에서 다양합니다. 일반적으로,_C2SH모델은 시간이 지남에 따라 완납 iDIAm 근전도(EMG) 활성의 자발적 회복 속도 때문에 호흡기 신경가소성을 연구하는 데 특히 유용하며, 이는 신경영양성 신호전달을 포함한 여러 요인에 의해 개선될 수 있다 17,18,19,20,21. 그러나 완곡한 iDIAm EMG 활동의 침묵으로 정의되는 초기 기능 상실은 회복을 명확하게 분류하기 전에 먼저 확립되어야 합니다. _C2SH시점에서의 비활성에 대한 이러한 검증은 여러 연구 3,4,6,7,11,22,23에서 수행되지 않는다.

절제된 척수의 조직학적 평가는 척수의 횡격막 운동 뉴런을 자극하는 동측 흥분성 구근 경로의 적절한 위치에 대한 손상의 증거만 제공하지만, 조직학은 생리학적 증거(예: DIAm EMG)를 대체하지 않습니다. 또한, 조직학적 평가는 최종 시점(종종 부상 후 몇 주에서 몇 달)에 생체 외에서 수행되며 "실시간" 정보를 제공하지 않습니다. 일부 연구자들은 병변의 크기가 기능적 결함 또는 그 결핍의 양과 관련이 있다고 지적했다 ^5,24,25,26. 이러한 주장의 타당성은 "기능"을 분류하는 방법(즉, 기능적 작업이 무엇이며 어떻게 정량화되는지)에 따라 크게 달라질 수 있으며, 연구 간의 차이는 동물 간에 기능적으로 동일한 병변을 생성하는 것이 어렵다는 점을 강조한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 실제로, 연구자들은 부상 정도와 사지 근육 운동 기능 사이의 관계(Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB) 점수²⁴로 정량화됨)가 선형이 아니라는 점을 강조했습니다^27,28. 이전 연구에서는_C2SH의 정도와 손상 후 완청색 iDIAm EMG 활동의 회복 정도 사이에 관계가 없음을 발견했지만10,29,30,31 다른 연구자들은 환기 기능과 백질 보존 정도 사이의 관계를 보고했습니다 ⁵. 따라서,_C2SH모델의 경우, 수술 시점 및 바람직하게는 만성 척수 손상 실험의 시간 경과 초기에 iDIAm 비활성의 기능적 검증을 위한 접근법이 유익하고 필요하다.

본 논문은 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가뿐만 아니라 C₂SH 후 호흡 중 DIAm EMG의 초기 손실을 실시간으로 확인하고 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가를 위해 DIAm EMG를 사용하는 것을 강조합니다 18,21,31,32,33. C₂SH 모델을 사용한 초기 연구에서는 DIAm EMG 10,13,30,34를 기록하기 위해 반복적인 개복술을 수행했습니다. 그러나 보다 최근의 연구는 만성 근전도 전극을 사용하여 마취되고 깨어 있는 쥐에서 근전도를 기록할 수 있습니다. 또한 만성 전극은 기흉의 위험을 줄이고 DIAm^35,36의 억제를 유발할 수 있는 반복적인 개복술이 필요하지 않습니다. 많은 연구자들이_C2SH모델의 버전을 사용했지만, 수술 당시에는 iDIAm 활성의 침묵에 대한 확인이 이루어지지 않았다 3,4,6,7,11,22,23. 이러한 비활성에 대한 확인이 없으면 후속 회복의 어느 부분이 동측 경로와 반대측 경로의 신경 가소성에 기인하는지 알기 어려우며, 이는 차별적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 rVRG에서 횡격막 운동 뉴런으로의 흡기 신경 드라이브가 주로 동측성이기 때문에 중요한 고려 사항이며, C₂SH³³ 이후 횡막 운동 뉴런에 대한 흥분성 글루타마테르 입력의 약 50%가 손실됩니다. 그러나 반대측 rVRG에서 병변 부위 아래로 감소하여 동측 횡격막 운동 뉴런을 자극하고 신경 가소성을 통해 강화하여 기능 회복을 촉진할 수 있는 흡기 흥분성 입력이 남아 있습니다. 횡격막 운동 뉴런에 대한 우세한 동측 흥분성 입력을 제거함으로써, 완납 iDIAm EMG 활성은 (적어도 마취 하에서) 손실되는 반면, cDIAm의 활성은 계속되고 심지어 향상됩니다. 따라서 호흡 중 iDIAm EMG 활동의 손실은 성공적인 C₂SH의 척도입니다 (그림 2).

일부 수준의 iDIAm EMG 활동은 깨어 있는 동물에서 C₂SH 후 1-4일 이내에 존재합니다^23,37. 또한, decerebrate 동물에서, iDIAm 활성은 상부 경추 반절제 후 몇 분 내지 몇 시간 내에 존재하며, 마취에 의해 억제된다³⁸. 또한, C₂SH의 성공은 부상 후 3일째에 마취된 쥐에서 호흡(유프니아) 중 iDIAm EMG 활성이 없음을 확인함으로써 검증됩니다. 공초점 이미징 연구는 이 손상의 초기 단계에서 횡격막 운동 뉴런의 글루타마테르직 시냅스 입력의 손실을 확인했다³⁷. 부상 후 3일째에 잔류 완청성 iDIAm EMG 활동이 있는 경우 이는 rVRG에서 동측 하강 흡기 드라이브가 불완전하게 제거되었다는 증거로 해석됩니다. 본 논문은 (1) 만성 DIAm EMG 기록, (2) C₂SH 및 (3) 깨어 있는 동물 및 마취된 동물에서의 EMG 데이터 수집의 세 섹션으로 나뉩니다. 이 프로토콜은 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C₂SH 모델을 설명하며, 이는 호흡기 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: A00003105-17-R23)의 승인을 받았습니다. 본 연구의 동물은 생후 약 3개월이고 체중이 200g에서 350g 사이인 수컷과 암컷 Sprague-Dawley 쥐의 혼합이었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 전극 이식

1. 전극 준비
   1. 언급된 장비를 사용할 수 있는지 확인하십시오: (1) 다중 가닥, 스테인리스 스틸 와이어, (2) #11 날이 있는 메스, (3) 가위, 4) 해부 현미경, (5) 자, (6) 집게, (7) 25g 바늘, (8) 2개의 플라이어(압착 영역이 있는 하나 이상).
   2. 전극을 만드는 과정의 세부 사항은 그림 3에 나와 있습니다. 쌍을 이루는 차동 기록 전극에 대해 이 과정을 두 번 이상 반복합니다.
   3. 먼저 스테인리스 강선을 18cm 측정하고 자릅니다.
   4. 그림 4와 같이 와이어의 한쪽 끝에서 3cm 떨어진 곳에 기본 오버핸드 매듭을 묶습니다. 이것은 와이어의 짧은 면이 DIAm에 이식되고 봉합될 때 앵커 역할을 합니다.
   5. 메스와 외과적 해부 스코프를 사용하여 와이어의 짧은 쪽에 있는 매듭 바로 옆에 있는 2mm의 절연체를 조심스럽게 벗겨냅니다. 다중 가닥 전선의 가닥을 자르지 않도록 각별히 주의하십시오.
      알림: 이 절연되지 않은 부분은 전극의 전도성 표면 역할을 합니다. 일반적으로 신호 품질은 3개 이상의 가닥이 부주의하게 절단되면 저하되기 시작하며, 이 경우 전극을 교체합니다.
   6. 다음으로, 와이어의 짧은 쪽 끝에서 ~5mm를 벗겨낸 다음 25G 바늘의 내강에 삽입하여 전극을 DIAm에 이식하는 데 사용할 봉합사 같은 도구를 만듭니다.
      알림: 개인 취향에 따라 더 높은 게이지 바늘(예: 최대 28G)을 사용할 수도 있습니다. 더 높은 게이지 바늘의 직경이 더 얇기 때문에 기흉의 위험이 잠재적으로 줄어들 수 있습니다. 그러나 여러 가닥 와이어를 바늘의 더 작은 루멘에 삽입하는 것이 더 어려울 수도 있습니다.
   7. 이렇게하려면 포장에서 25G 바늘을 제거하고 두 펜치를 사용하여 바늘이 부러질 때까지 날카로운 비스듬한 끝에서 좌우로 ~ 1cm 떨어진 바늘을 조심스럽게 구부립니다.
      참고: 이 프로세스는 서두르지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 전단력으로 인해 바늘의 내강이 닫혀 프로세스를 반복해야 할 수 있습니다.
   8. 벗겨진 와이어의 끝 부분을 끊어진 1cm 바늘의 루멘에 삽입하고 바늘이 와이어의 나머지 절연 부분에 바로 인접하도록 합니다.
   9. 바늘과 와이어의 나머지 짧은 쪽 사이에 절연되지 않은 부분이 없는지 확인하고 바늘을 압착하여 와이어에 부착합니다.
   10. 그런 다음 두 개의 펜치를 사용하여 부착된 바늘을 조심스럽게 구부려 표준 수술용 봉합 바늘과 유사한 곡률을 만듭니다.
   11. 마지막으로 전선의 긴 쪽 끝에서 ~5mm를 벗겨냅니다(그림 3). 전극을 DIAm에 봉합한 후 와이어의 긴 쪽은 DIAm EMG 기록을 허용하기 위해 외부 액세스를 위해 터널링됩니다.
   12. 이 과정을 반복하여 차동 녹음을 위한 두 번째 전극을 만듭니다.
2. 다이어프램 EMG 전극 배치
   1. 수술 전에 (1) 작은 동물 이발기, (2) #11 날이 있는 메스, (3) 수술용 가위, (4) 겸자, (5) 마이크로 바늘 홀더를 포함한 모든 수술 장비를 멸균하거나 고압멸균하십시오.
   2. 깨끗한 케이지를 구입하고 음식, 물, 침구 및 환경 풍요로움을 제공하십시오. 가열 패드에 따로 보관하십시오. 이 케이지는 수술 후 동물을 수용하는 데 사용됩니다.
   3. 수술 부위를 적절한 소독제로 소독하고 개인 보호 장비(스크럽, 캡, 마스크 및 수술용 장갑)를 착용합니다. 이전에 준비한 전극을 70% 이소프로필 알코올 풀에 넣습니다.
   4. 마취 및 수술 중 쥐의 체온을 유지하기 위해 수술 부위에 가열 패드를 놓습니다. 멸균된 수술용 수건으로 가열 패드를 덮습니다.
   5. 쥐의 무게를 측정하고 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 적절한 마취 투여량을 계산합니다.
   6. 케타민(80mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)의 뒷다리 근육 주사 또는 기타 적절한 마취제(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)로 쥐를 마취합니다. 수술 전에 서방형 부프레노르핀(1mg/kg)과 카프로펜(5mg/kg)을 주사합니다. 동물이 더 이상 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 진행하십시오.
   7. 이위를 사용하여 쥐를 xiphoid 돌기에서 뒷다리의 대략 절반까지 면도하십시오. 또한 전극이 동물의 손이 닿지 않는 곳(보통 견갑골 주위)이 외부화되는 쥐의 등을 면도하십시오. 거즈 조각으로 여분의 머리카락을 닦아내십시오.
   8. 클로로헥시딘 글루코네이트(부피 기준 중량 4%)에 적신 멸균 거즈로 피부를 세척하여 절개를 준비합니다.
   9. 멸균된 가열 패드에 동물을 누운 자세로 놓습니다. xiphoid 과정에서 시작하여 메스와 깨끗한 #11 칼날을 사용하여 4-5cm의 꼬리 절개를 만듭니다. 이렇게 하면 밑에 있는 복부 근육층이 노출되어야 합니다.
   10. 근육층의 정중선을 따라 또 한 번 절개(3-4cm)하여 복부 내용물을 노출시킵니다. 복부 장기를 뚫지 않도록 주의하십시오.
   11. 동물의 오른쪽은 간에 가려지더라도 DIAm의 복부(즉, 하부) 표면이 보이는지 확인하십시오.
   12. 메스 손잡이나 기타 뭉툭한 도구를 사용하여 간과 다른 장기를 아래로 눌러 DIAm의 복부를 노출시킵니다.
   13. 이소프로필 알코올 풀에서 전극을 제거하고 멸균 식염수로 세척하여 사용할 전극을 준비합니다. 그런 다음 마이크로 니들 홀더를 사용하여 이전에 준비한 전극 중 하나를 DIAm의 중간 늑골 영역에서 근육 섬유에 수직으로 향하게 합니다. 근섬유는 DIAm을 가로질러 방사상으로 퍼져 있습니다.
       알림: DIAm은 얇고(~2mm) 구멍이 뚫리지 않아야 합니다. 오히려, 목표는 전극 와이어의 절연되지 않은 부분(그림 3)을 DIAm 내에 내장하는 것입니다.
   14. 수술용 현미경을 사용하여 전극 봉합사(바늘 끝)를 DIAm에 조심스럽게 삽입합니다. 바늘의 곡률이 전극을 DIAm의 복부 표면 안팎으로 안내하도록 하여 와이어의 절연되지 않은 부분 전체가 근육에 완전히 박히도록 합니다.
   15. 와이어의 매듭이 DIAm에 고정될 때까지 바늘을 조심스럽게 당깁니다. 전극 와이어의 절연되지 않은 부분(2mm)이 바늘이 DIAm에 처음 들어간 지점에 매듭이 있는 DIAm 내에 완전히 있는지 확인합니다.
   16. 그런 다음 전극선에서 바늘을 잘라 날카로운 물건 용기에 버리십시오.
   17. 두 개의 집게를 사용하여 봉합사(3-0) 바늘이 DIAm에서 나온 지점에 매듭을 묶습니다. 이렇게 하려면 와이어의 짧은 쪽에 고리를 묶고 고리를 DIAm의 복부 표면까지 밀어 넣은 다음 고리를 조심스럽게 조여 매듭을 만듭니다. 전극(절연되지 않은 부분)은 이제 입구와 출구 지점 모두에 고정되어야 합니다.
   18. 와이어의 짧은 쪽의 초과 부분을 잘라냅니다.
   19. 1.2.14-1.2.18 단계에 따라 첫 번째 전극에서 ~3mm 떨어진 DIAm의 같은 쪽에 있는 다른 전극을 봉합합니다.
   20. 같은 방식으로 반대쪽 반구에 전극 쌍 삽입을 수행합니다.
   21. 다음으로, 전극 와이어의 긴 쪽이 모두 복강 외부에 있는지 확인하고 복부를 닫기 위해 근육층을 봉합(3-0)하기 시작합니다. 각 전극 쌍에 대해 고리를 만들고 고정합니다.
       알림: DIAm에 긴장을 일으키지 않고 쥐가 늘어날 수 있도록 복강 내에 2-3cm의 와이어가 남아 있는지 확인하십시오.
   22. 식염수로 과도한 혈액을 닦아낸 다음 근육층을 연속적인 패턴으로 봉합(3-0)하여 복막을 닫습니다.
   23. 쥐의 내측 등쪽 피부에서 열린 복부 피부까지 16G 카테터를 터널링하고 한 쌍의 전극 와이어를 쥐의 뒤쪽으로 당깁니다.
   24. 반대쪽에 두 번째 카테터로 이 과정을 반복하고 두 번째 쌍의 전극 와이어를 당겨 통과시킵니다.
   25. 단속 봉합 패턴에서 3-0 봉합사로 복부 피부를 봉합합니다.
   26. 다음으로, 각 쌍에 대해 전극 와이어를 매듭으로 묶고 제자리에 봉합합니다.
   27. 동물에게 피하 식염수 주사를 제공합니다(동물 질량 50g당 ~1ml). 동물을 온열 패드 위의 깨끗한 케이지에 넣어 회복하십시오.
       참고: 개복술은 DIAm 활성을 억제할 수 있다^35,36. EMG 측정의 정량 분석 전에 최소 72시간을 허용하십시오.

2. 경추 척추 반절부

1. 이전과 같이 멸균 수술 영역을 준비합니다.
2. 수술 전에 모든 수술 장비를 고압멸균하거나 멸균하십시오. 필요한 장비: (1) 작은 동물 이발기, (2) #11 날이 있는 메스, (3) 수술용 가위, (4) 집게, (5) 롱거, (6) 견인기, (7) 각진 해부 칼.
3. DIAm EMG 전극 이식 후 약 72시간 후에 쥐의 무게를 측정하고 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 적절한 마취 투여량을 계산합니다.
4. 쥐를 마취하기 전에 쥐를 Bowman 스타일의 케이지에 넣고 3.2단계에 설명된 대로 양측 DIAm EMG를 기록합니다.
5. 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 복강내 주사 또는 현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜에 따라 기타 적절한 마취제로 쥐를 마취합니다. 수술 전에 서방형 부프레노르핀(1mg/kg)을 피하로 주사하고 카프로펜(5mg/kg)을 복강내로 주사합니다.
6. 동물이 더 이상 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 진행하십시오. 약 15분마다 발가락 꼬집으로 마취 깊이를 확인하십시오.
7. 수술을 시작하기 전에 쥐를 엎드린 자세로 놓고 3.3단계에 설명된 대로 마취된 쥐의 EMG를 기록합니다.
   알림: 모든 녹음이 쥐가 같은 위치에 있는 상태에서 수행되었는지 확인하십시오.
8. 목에서 귀 높이까지 털을 깎고 젖은 거즈로 제거합니다.
9. 클로로헥시딘 글루코네이트(부피 기준 중량 4%)로 피부를 청소하고 동물을 멸균 수술용 커버(상부 등쪽 제외)로 덮습니다.
10. 메스를 사용하여 4cm의 꼬리 관절을 절개합니다. 피부를 수축시키고 견봉 평탄근을 자릅니다. 그런 다음 마름모꼴 근육을 절개하여 척추 근육을 노출시킵니다.
    참고: 견봉 플라페지우스는 중간 승모근이며 근육 섬유는 척추와 거의 평행합니다. 마름모꼴 근육은 견봉 플라페지우스 아래의 평면에 노출되어 있으며 근육 섬유는 대각선으로 뻗어 있습니다.
11. 척추 근육을 C₁ 에서 C₃으로 수축시킵니다.
    참고: 척추 근육은 척추 바로 옆에 있습니다.
12. 수술용 현미경을 통해 보면서 주요 동맥이나 신경이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 rongeur를 사용하여 C₂ 에서 후궁 절제술을 조심스럽게 수행합니다.
13. C 2에서 경막을 자르고 집어넣습니다_.
14. 척추 반절개를 수행하는 동안 노출된 전극 와이어를 쥐의 등에서 증폭기에 연결합니다. 자세한 내용은 3단계를 참조하십시오.
15. DIAm EMG를 모니터링하는 동안 그림 2A와 같은 방식으로 등뿌리가 척수로 들어가는 지점 바로 아래에 각진 절개 칼을 삽입하고 복부 표면의 중간 지점까지 절단합니다.
    알림: 전자 열 패드를 사용하는 경우 소음을 피하기 위해 EMG를 모니터링하는 동안 열 패드를 꺼야 할 수 있습니다.
16. 이 절편 후 몇 초 이내에 부상과 동측인 완곡한 DIAm EMG 활성이 멈추고 cDIAm EMG 활성의 보상적 증가가 분명한지 확인합니다(그림 2C).
17. 완곡한 iDIAm EMG 활동이 지속되면 그림 2C에 강조 표시된 대로 해부 칼로 다른 절단을 수행하십시오. 그러나 정중선을 가로질러 절단하지 마십시오. 반대쪽으로 자르면 동물이 죽을 가능성이 큽니다.
18. 멸균 봉합사로 근육을 봉합한 다음 피부를 봉합합니다(3-0).
19. 수분을 유지하기 위해 동물 질량 50g당 1mL의 식염수를 피하 주사하고 회복을 위해 가열 패드가 있는 깨끗한 케이지에 동물을 넣습니다. 동물이 수술에서 회복하는 동안 모니터링하십시오.
20. 약 72시간 후(Day 3 Post-C₂SH), 프로토콜 단계 3.2에 따라 깨어 있는 쥐의 EMG 활동을 기록합니다. 쥐의 등쪽에 있는 실밥이 손상되지 않도록 주의하십시오.
21. 다음으로, 수술용 비행기에 필요한 것보다 더 가벼운 용량의 마취제(정상 용량의 1/3에서 1/2 사이)를 사용하여 쥐를 다시 한 번 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따라). 쥐가 온전한 각막 반사를 보이고 발가락 꼬집음에 반응하는 한 추가 투여가 이루어질 수 있습니다.
22. 프로토콜 단계 3에 따라 DIAm EMG 활동을 모니터링합니다.
    알림: iDIAm EMG 활동의 초기 평가에 사용된 것과 동일한 위치에 쥐를 놓습니다.
23. 완충 iDIAm EMG 활성(즉, 흡기 cDIAm EMG 활성과 함께 위상별 활성)이 3일째에 없는 경우 초기_C2SH가 성공적이었다고 결론을 내리고 추가 분석을 위해 동일한 동물을 포함합니다.

3. 데이터 수집 및 분석

1. 일반 설정 및 데이터 추출
   1. 프리앰프의 대역 통과 필터를 100Hz(고역 통과) 및 1000Hz(저역 통과)로 설정합니다.
      참고: 이러한 필터 설정은 움직임 아티팩트를 제거하고 근육 내 DIAm EMG 신호의 주파수 성분 대부분을 유지하면서 60Hz 노이즈 및 ECG 오염(~75Hz에서 피크 전력)을 크게 줄입니다. 나이퀴스트 이론에 따라 2000Hz의 샘플링 주파수로 디지털화하여 앨리어싱을 피하고 화합물 EMG의 모터 단위 활동을 기록할 수 있는 적절한 해상도를 허용합니다. 100Hz 미만의 주파수 범위에 대한 특수 주파수 성분 분석을 수행하는 경우 관심 주파수가 필터링되지 않도록 전치 증폭기 필터 설정을 지정하는 것이 중요합니다.
   2. 컴퓨터의 시각화 소프트웨어에서 두 채널(좌측 및 우측 반격막 EMG)을 모니터링하고 추가 분석을 위해 데이터를 적절한 형식으로 저장합니다.
   3. 분석을 위한 충분한 데이터를 확보하기 위해 최소 1-2분의 완곡 녹음을 수집합니다.
   4. 데이터가 세 개 이상의 시점에서 수집되는지 확인합니다.
      1. C₂SH 이전에 깨어 있고 마취된 상태에서 기준선 완곡 녹음을 설정합니다.
      2. 마취된 상태에서 완곡한 iDIAm EMG 활성의 침묵을 확립하기 위한 C₂SH 수술 중.
      3. C-C₂후 3일째에 SH를 사용하여 완곡성 iDIAm EMG 활성의 부재가 지속되는지 확인하고 척추 쇼크 ^2,39 또는 부프레노르핀과 같은 호흡기 억제제의 투여에 영향을 받지 않는 깨어 있는 동물의 결핍 정도에 대한 초기 지점을 설정합니다.
   5. 디지털화된 신호에 대해 계산을 수행할 수 있는 소프트웨어(예: Matlab, Python, R)를 사용하여 DIAm EMG 기록을 분석합니다. 기본 프로세스는 다음과 같습니다.
      1. 원시 EMG 파일을 로드합니다. 필터링 설정에 따라 신호의 DC 오프셋을 고려해야 할 수도 있습니다.
         참고: 쉬운 수정은 원시 EMG 신호 자체에서 원시 EMG 신호의 평균을 빼는 것입니다.
      2. 50ms의 이동 윈도우로 EMG 신호의 제곱평균제곱근을 계산합니다. 이 작업은 신호의 끝에 도달할 때까지 한 번에 하나의 샘플 포인트씩 50ms 계산 창을 앞으로 이동하여 수행할 수 있습니다.
         참고: 개별 DIAm EMG 이벤트의 분석은 가장 높은 통계적 검정력을 제공하며 eupneic 및 non-eupneic 활동의 클러스터링을 허용합니다. 따라서, DIAm EMG에서 개별 호흡의 시작 및 오프셋을 감지하는 것이 가장 중요하며, 이는 이전 보고서⁽⁴⁰)에서 강조된 바와 같습니다.
   6. 이전 보고서⁴¹과 같이 순간 호흡수 및 파열 지속 시간의 히스토그램을 시각화하여 eupneic 활동의 필터링을 수행합니다.
2. 깨어있는 녹음.
   1. Bowman 스타일의 설치류 우리에 쥐를 넣어 깨어 있는 녹음을 수행합니다. 원통형 Bowman 스타일의 케이지는 최대 750g의 성인 쥐를 수용 할 수 있습니다.
   2. Bowman 스타일 케이지의 한쪽에 있는 금속 막대를 풀고 안에 있는 쥐를 부드럽게 달래십시오. 금속 막대를 다시 조여 쥐를 원통형 케이지에 가둡니다.
      알림: 녹음을 진행하기 전에 최소 30분 동안 쥐를 케이지에 적응시키십시오. 가능하면 측정하기 전에 여러 일 동안 쥐를 Bowman 스타일 케이지에 적응시키는 것이 가장 좋습니다. 이 적응 단계에서 쥐가 우리에 있는 동안 간식을 제공하는 것이 좋습니다.
   3. 외부의 시각적 자극을 최소화하려면 종이 타월이나 이와 유사한 물체를 사용하여 쥐의 머리가 있는 우리 앞쪽에 텐트를 만듭니다. 또한 시끄러운 소음을 최소화하고 모든 지점에서 쥐의 신체적 편안함을 보장하십시오.
      알림: 불편함의 명백한 징후에는 안절부절, 빠른 호흡, 케이지에 대한 몸부림이 포함됩니다. 이러한 징후 중 하나라도 관찰되면 쥐를 집 우리로 돌려보내고 쥐가 더 차분해질 때 녹음을 시도해야 할 수 있습니다.
   4. 작은 쥐(<300g)의 경우 충전재(예: 종이 타월, 면봉)를 케이지의 추가 공간에 삽입하여 쥐가 180도 회전하지 않도록 합니다.
   5. 쥐가 적응한 후 쥐 등쪽에서 나오는 전선을 아날로그 신호를 아날로그-디지털 변환기에 공급하는 전치 증폭기에 조심스럽게 연결하고 3.1단계에 설명된 절차를 따릅니다.
3. 마취 녹음
   1. 매번 같은 위치에 쥐를 놓고, 가급적이면 깨어 있는 쥐의 자세를 더 가깝게 모방하는 경향이 있습니다.
   2. rat dorsum에서 나오는 전선을 프리앰프에 연결하고, 아날로그 신호를 아날로그-디지털 변환기에 공급하고 3.1단계에 설명된 절차를 따릅니다.
4. 동물 회수
   1. 회복을 위한 침구가 없는 깨끗하고 빈 쥐 우리 안에 쥐를 넣으십시오.
   2. 케이지를 가열 패드에 놓습니다.
   3. 처음 3시간 동안 또는 쥐가 움직이기 시작할 때까지 일정한 간격(<15분)으로 쥐를 모니터링합니다. 동물이 다시 깨어날 때까지 덜 규칙적인 간격(30분)으로 모니터링하십시오.
   4. 쥐가 보행을 할 수 있게 된 후에는 침구, 음식과 물에 접근할 수 있는 환경적 풍부함이 있는 깨끗한 새장에 넣으십시오.
   5. 실험이 진행되는 동안 적어도 하루에 한 번 쥐를 계속 모니터링하십시오. 체중/수유 능력의 변화뿐만 아니라 절개 부위와 봉합사의 무결성에 특히 주의를 기울이십시오.

결과

이 기사에서 제시된 접근 방식은 C₂SH의 랫 모델에서 DIAm EMG를 평가하기 위한 명확한 기준을 설정하여 작업자 간 변동성을 최소화합니다. 첫째, 그림 2와 같이_C2SH직후 완곡한 iDIAm EMG 활성의 중단을 관찰해야 합니다. 그렇지 않은 경우 eupneic iDIAm 활성이 사라질 때까지 2차 횡단을 수행할 수 있습니다. 둘째,_C-2SH 후 3일째에 동물을 마취하는 동안 완곡한 iDIAm EMG가 계속 없는지 확인해야 합니다. 그림 4A는 부상 후 3일째에 마취 하에 완곡한 iDIAm EMG 활동이 지속적으로 부재한 것으로 결정된 성공적인 C₂SH의 예를 보여줍니다. 그림 4B는 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 동물에서 DIAm EMG 활동을 보여주며, 부상 전 기준선과 비교하여 iDIAm 활성의 감소(부재는 아님)를 강조합니다. 특히, cDIAm EMG 활성은 깨어 있는 상태와 마취된 상태 모두에서 증가합니다. 3일째의 마취된 기록은 초기 C₂SH가 성공적이었음을 입증하지만, 깨어 있는 동물에서 정량 분석을 수행해야 합니다. 깨어 있는 동물에서_C-2SH 후 3일차의 DIAm EMG 활동은 회복의 시작점을 나타냅니다. 그림 4B는 깨어 있는 쥐에서 3일째에 iDIAm EMG 활동이 감소하지만 없는 것은 아님을 보여줍니다.

일부 경우에,_C2SH는 완곡한 iDIAm EMG 활성의 완전한 중단을 동반하지 않는다(그림 5A). 부적절한_C2SH는 본 원고에 요약된 접근법을 사용하는 모든 사례의 5% 미만에서 발생한다; 그러나 C₂SH 후 3 일째에 DIAm EMG 활성에 대한 평가를 각 쥐에 대해 수행하여 C₂SH의 성공을 검증하는 것이 중요합니다. 그림 5A는 손상 후 3 일째에 쥐의 DIAm EMG 활동의 예를 보여주며, C₂SH는 3 일째까지 완곡한 iDIAm EMG 활동을 제거하는 데 부적절했습니다. C2SH의 효능에 대한 검증은 동물이 마취된 상태에서 수행되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 지속적인 완곡성 근전도 활동은 하행 동측 척추 경로의 적어도 일부가 보존되었음을 시사하며, 이는 결과의 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 그림 5B는 깨어 있는 쥐에서 3일째에 iDIAm EMG 활성이 감소하지만 없는 것은 아님을 보여줍니다. 그러나 동측 하강 입력을 절약하면 초기 적자를 줄일 수 있습니다.

그림 1: 개념적 프레임워크. rVRG(rostral ventral respiratory group)는 경추 척수(cervical spinal cord)의 횡격막 운동 뉴런(phrenic motor neuron)에 하강 입력을 보냅니다(C_{3-C 5}). 이러한 하강 축삭의 대부분은 동측 횡격막 운동 뉴런 풀을 자극하지만 작은 부분은 정중선을 건너 반대쪽 운동 뉴런 풀을 활성화합니다. C₂SH 직후, rVRG에서 동측 횡격막 운동 뉴런 풀로의 하강 입력이 중단됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 대표적인 C₂SH 및 DIAm EMG 활동. (A) 중요한 구조가 표시된 쥐의 척수와 tran site(빨간색 음영)의 횡단도가 표시됩니다. 척추 병변은 등뿌리가 들어가는 지점 바로 아래에 절개 칼을 삽입하고 대략 정중선(음영 처리된 반투명 빨간색 영역)까지 절단하여 수행됩니다. 외측 및 복부 funiculi의 주요 운동 기관이 절단되지만 dorsal funiculi는 보존됩니다. (B) 동측 운동 뉴런 활동의 침묵을 묘사하는 종단도는 만족스러운 병변의 실시간 확인에 사용되는 원시 EMG 추적을 보완합니다(C). 척수에 병변이 생기면 완납 iDIAm EMG 활동이 중단되며, 이는 횡격막 운동 뉴런에 대한 동측 입력이 절단되었음을 시사합니다. 한편, cDIAm EMG는 그림과 같이 즉시 활성을 증가시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 전극 제조. DIAm EMG 전극을 제조하는 공정이 표시됩니다. 기본 프로세스에는 적절한 길이의 와이어 측정 및 절단(1단계), 고정 매듭을 묶고 절연체를 벗겨 전극을 노출시키고(2단계), 와이어에 25게이지 바늘을 부착(3단계 및 4단계), 바늘을 구부려 수술용 봉합사 바늘과 유사한 곡률을 부여(5단계)하는 작업이 포함되었습니다. 그리고 절연체를 벗겨내어 EMG를 기록하기 위한 증폭기에 연결될 전선의 일부를 노출시킵니다(6단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 성공적인 척추 반절제. (A) DIAm EMG 활성은 마취된 쥐에서 C₂SH 이전과 부상 후 3일째에 나타납니다. 부상 후 3일째에 이 쥐에서 완곡한 iDIAm EMG 활동의 증거는 없으며, 이는 초기 C₂SH가 성공적이었음을 나타냅니다. 부상 전 상태와 비교하여 cDIAm EMG 활동의 보상적 증가와 호흡수의 증가에 유의하십시오. (B) DIAm EMG 활성은_C-2SH 후 3일차에 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 쥐에서 나타났습니다. 완전히 침묵하지는 않았지만 iDIAm EMG 활동이 감소했다는 명백한 증거가 있습니다. 부상 전 상태와 비교하여 cDIAm EMG 활동의 보상적 증가와 호흡수의 증가에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 척추 반절리 실패. (A) DIAm EMG 활성은 마취된 쥐에서 C₂SH 이전과 부상 후 3일째에 나타납니다. 이 쥐에서 eupneic iDIAm EMG 활동은 부상 후 3일째까지 지속되었으며, 이는 초기_C2SH가 부적절했음을 나타냅니다. 따라서, 이 쥐는 기능 회복에 대한 추가 분석에서 제외되었다. C2SH가 실패했음에도 불구하고 cDIAm EMG 활성의 보상적 증가에유의하지만, 호흡수의 증가는 미미하다. (B) DIAm EMG 활성은_C-2SH 후 3일차에 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 실행으로 표시됩니다. iDIAm EMG 감소, cDIAm EMG 활동 증가, 호흡수의 약간의 증가에 대한 증거가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

C₂ 척추 반절개
이 기사에서 설명하는 절차는 등쪽 funiculi를 보존하면서 lateral and ventral funiculi를 가로지르는 C₂ 척추 병변의 검증 역할을 하는 DIAm EMG 활성의 평가를 강조합니다(그림 2A). 제안된 수술 접근법에는 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 쥐의 보행 기능을 보존하는 등쪽 funiculi를 보존하면서 횡격막 운동 뉴런에 대한 동측 입력을 여전히 절단합니다. 둘째, DIAm EMG를 모니터링함으로써 동물이 마취되는 동안 수술 중 초기에 완곡성 iDIAm EMG 활성을 제거하는 C₂ 병변의 효능을 검증할 수 있습니다. 부상 후 3일째에 동물이 마취되는 동안 완곡한 iDIAm EMG 활동이 실제로 계속 침묵하는지 확인합니다. 이전에 횡격막 운동 뉴런에 대한 rVRG 흥분성 입력과 횡격막 운동 뉴런의 NMDA 수용체 발현은 손상 후 3-7일에 감소하고 글루타마터직 시냅스 입력과 NMDA 수용체 발현은 모두 부상 후 7일 후에 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 나타났습니다^33,42. 이러한 데이터는 C₂ 병변 10,13,29,30,33의 조직 학적 확인과 결합되어 손상 후 3 일째에 마취하에 지속적인 비활동이 초기 C₂SH의 효능에 대한 정보를 제공한다는 것을 시사합니다. 여러 해에 걸쳐 수행 된 연구에서 30 % -40 % 사이의 마취 하에서의 자연 회복률은 C₂SH 후 14 일째에 상대적으로 안정적인 속도로 나타났습니다 ^도 18,19,20,29,31,43에 도시된 바와 같이,_C2SH의 성공을 검증하는 이 방법이 재현 가능하고 신뢰할 수 있음을 시사한다.

C₂SH 절차에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 중요한 것은, 여기에서 제안된 C₂SH 모델은 등쪽 funiculi를 살려 주어 사지 운동 결손을 일으키지 않는다는 것입니다. 등쪽 funiculi를 포함하는 전체 C₂ 척추 반절부 모델에서, 사지 운동 결손은 상당히 더 큽니다 3,4,5,6,7,37. 따라서,_C2SH모델(그림 2A)의 추가적인 이점은 마취된_C2 병변 쥐에서 완곡한 iDIAm EMG 활성을 침묵시키는 것 외에도, 쥐가 보행 및 기타 기능 측면에서 가짜 후궁절제술 쥐와 기능적으로 유사하다는 것이다. 따라서 일반적으로 스스로 먹이를 먹고 몸을 손질할 수 있으며, 이는 돌봄 부담을 줄이는 동시에 DIAm 신경 운동 제어 및 호흡 신경 가소성에 대한 연구를 가능하게 합니다. C₂ 모델이 적절하게 구현되도록 하려면 과도한 병변을 피하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 등뿌리가 척수로 들어가는 곳 바로 아래에 절개 칼을 삽입하는 것과 복부 부분을 아껴서 자르는 것은 모두 유용한 경험 법칙입니다. 목표는 eupneic iDIAm EMG 활동이 중단되도록 하는 것입니다. 필요한 경우 여러 개의 작은 절단으로 이 작업을 수행할 수 있습니다. 실제로, C₂SH 다음 주에는 동물이 보행에 어려움을 겪고 음식 알갱이에 손을 뻗는 데 어려움을 겪는 경우 척수에 과도한 손상이 있었는지 여부가 명확해질 것입니다.

전극 배치 및 EMG 기록
만성 DIAm EMG 전극은 다른 접근법에 비해 몇 가지 분명한 이점이 있습니다. 전극은 C₂SH 시술 몇 일 전에 이식할 수 있으며(이식해야 함) 회복을 위한 충분한 시간을 허용하고 동일한 수술 세션 동안 개복술과 C₂SH가 필요하지 않습니다. 이는 개복술이 DIAm^35,36의 억제를 유발한다는 것이 잘 알려져 있기 때문에 중요합니다. 만성 DIAm 전극을 이식함으로써, 이전 작업^10,13에서 수행된 반복적인 개복술도 필요하지 않습니다. 또한 각 세션 동안 전극이 DIAm에 삽입되지 않기 때문에 기흉의 위험이 줄어듭니다. 그러나 전극 배치의 결과로 잠재적으로 심각한 여러 부작용이 발생할 수 있습니다. 반복적인 전극 삽입을 피함으로써 기흉의 위험이 감소하지만 완전히 무효화되는 것은 아니며 실제로 기흉이 발생하여 즉각적인 사망이나 장기적인 문제를 일으킬 수 있습니다. 이러한 위험을 줄이려면 DIAm을 통해 나사산을 끼우는 바늘이 DIAm의 상부 표면에 구멍을 뚫지 않도록 하는 것이 가장 좋습니다. 또한 전극 와이어를 조작하는 동안 DIAm에 손상을 줄 수 있는 날카로운 집게를 사용하지 마십시오. 때때로 쥐는 복부의 실밥을 씹을 수 있으며, 자신의 장치에 맡기면 잠재적으로 스스로 내장을 제거할 수 있습니다. 쥐는 이러한 유형의 행동을 조기에 감지하기 위해 전극 배치 후 정기적으로 관찰해야 합니다. 어떤 경우에는 바늘 손상을 복구하기 위해 쥐를 마취시키는 것이 가능할 수 있습니다. 그러나 수술 중과 수술 후에 적절한 통증 완화를 제공하고 수술 중 멸균 필드가 파손되지 않도록 하여 이러한 행동을 완화하는 것이 가장 좋습니다. 극단적인 경우, 실밥을 반복적으로 제거하는 쥐를 안락사시켜야 할 수도 있습니다.

EMG 신호의 기록 및 분석은 본 연구의 주요 초점이 아니며 각 실험실에서 사용할 수 있는 특정 장비 및 소프트웨어에 크게 의존합니다. 장비 정보는 재료 표에 제공되지만 EMG 활동을 증폭하고 기록하기 위한 다양한 하드웨어 옵션이 존재하며 세부 사항은 각 실험실의 기능, 가용성 및 경제성의 조합에 따라 달라집니다. 그러나 언급해야 할 중요한 EMG 기록의 몇 가지 일반적인 원칙이 있습니다. 한 가지 잠재적인 문제는 이식된 전극의 이동 또는 파괴이며, 이는 DIAm EMG의 정량적 평가를 제한할 수 있습니다. 전극이 DIAm에서 떨어져 나갔거나 쥐가 외부화된 와이어를 섭취하거나 손상시킨 경우 EMG 활동을 기록할 수 없거나 소음 수준이 변경될 수 있습니다. 이는 전극이 DIAm에 단단히 고정되어 있는지 확인함으로써 피할 수 있으며, DIAm 전극 배치 수술 중에 높은 신호 대 잡음비(SNR)를 가진 신호를 기록할 수 있습니다. 또한, 전극 와이어를 등쪽 높은 곳에 외부화하고 쥐가 전극 와이어에 접근할 수 없도록 과도한 와이어를 차단하는 것은 모두 만성 전극의 성공에 도움이 됩니다. 외부화된 전선에 대한 대안으로서, 헤드 캡(³⁷) 또는 텔레메트리(^44,45)가 합리적인 선택일 수 있다. 두 가지 방법 모두 깨어 있는 동물에서 녹음을 더 쉽게 얻을 수 있지만 단순히 다중 가닥 와이어를 외부화하는 것보다 구현하기가 약간 더 어려울 수 있습니다. 근처의 모든 전자 소스는 잠재적으로 소음의 원인이 될 수 있습니다. 모든 장비를 적절하게 접지하고, 차폐 케이블을 사용하고, 활성 녹음이 진행되는 동안 쥐를 만지지 않는 것이 가장 중요합니다. 녹음 중에 전자 열 패드를 끄는 것 외에도 조명, 주변 장비, 전기적으로 작동되는 수술 테이블 및 기타 이러한 장치는 저소음 녹음을 위해 일시적으로 꺼야 할 수 있습니다. 환경적 영향을 최소화하려면 DIAm EMG 녹음을 위해 켤 필요가 없는 전자 장비를 꺼야 합니다. 가능하면 녹음은 전기적으로 차폐된 방에서 이루어져야 합니다. 시간이 지남에 따라 DIAm EMG 전극 주변의 조직 흉터와 섬유화는 전극의 전도도를 감소시켜 SNR을 감소시킬 수 있습니다. 또한 자세가 약간만 바뀌어도 DIAm EMG 신호에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 잠재적으로 복잡할 수 있는 문제를 최소화하기 위해 DIAm EMG는 기록 세션 전반에 걸쳐 동일한 자세의 쥐와 함께 기록해야 합니다.

또 다른 중요한 고려 사항은 필터링 및 샘플링 설정입니다. 전극의 유형(즉, 근육 내 대 식도/표면)은 신호의 주파수 함량을 결정하고 결과적으로 신호에 적합한 고역 및 저역 통과 필터를 결정하는 데 매우 중요합니다. 표면/식도 DIAm EMG⁴⁶에 대한 최적의 필터를 결정하기 위해 상당한 노력이 기울여졌습니다. 쥐 DIAm에 대한 유사한 연구는 수행되지 않았지만 이전에 우리는 쥐에서 만성 근육 내 전극을 사용하여 기록된 DIAm EMG의 전체 주파수 함량이 1000Hz 미만이고 중심 주파수는 약 300Hz⁴⁷임을 효과적으로 보여주었습니다. 표면 및 근육 내 전극을 통해 얻은 인간의 상완 이두근 근근 파워 스펙트럼의 평균 및 중간 주파수를 직접 비교한 결과, Christensen et ^al.48은 표면 전극에 비해 근육 내 전극의 평균 및 중간 주파수가 약 3배 더 높다는 것을 발견했습니다. DIAm에서 연구자들은 양극성 식도 전극 49,50,51,52,53,54를 사용할 때 약 100Hz의 중심 주파수를 보고했으며, 이는 이전에 근육 내 전극에 대해 결정된 300Hz가 Christensen et ^al.48이 보여준 것과 거의 일치함을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 설치류 모델에서 근육 내 DIAm EMG를 사용하는 여러 발표된 연구에서는 고역 통과 필터를 300Hz 4,37,55,56에 배치했으며 일부는 500Hz 57까지 높였습니다. 이러한 필터링 접근 방식이 DIAm EMG 신호의 진폭을 적어도 1/2까지 실질적으로 줄일 수 있다는 것은 논란의 여지가 없습니다. 우리는 훨씬 덜 파괴적인 접근법을 제안합니다: (1) ECG 파워 스펙트럼의 대부분이 100Hz 미만이고 DIAm EMG 파워 스펙트럼의 비교적 적은 수가 100Hz 미만이기 때문에 100Hz에서 고역 통과 필터링을 하고(^51,52) (2) 파형 정합⁵⁸에 의해 남은 ECG를 제거합니다. 따라서 대부분의 연구에서 DIAm EMG에 적합한 필터는 100Hz에서 1000Hz 사이로 설정할 수 있으며, 데이터 내의 모든 관련 기능을 캡처하기 위해 최소 2000Hz의 샘플링 주파수를 설정할 수 있습니다. 그런 다음 이전 보고서^40,41,47,58에 게시된 기술을 사용하여 DIAm EMG의 상세한 분석을 수행할 수 있습니다.

깨어 있거나 마취된 동물
특히, 일부 연구에서는 cSCI의_C2SH모델이 eupneic iDIAm EMG^23,37의 완전한 비활성으로 이어지지 않는다는 점을 강조했습니다. 어떤 의미에서, 이것은 놀라운 일이 아닌데, 이전에 언급했듯이, "돌파적" 활동은 더 높은 추진력을 필요로 하는 행동(예: 심호흡 및 기도 폐색에 대한 반응) 중에 발생한다는 것입니다.^4,7,29,42. 이러한 데이터는 C₂SH 모델을 지속적인 비활성의 실제 모델로 생각하는 것이 적절하지 않을 수 있음을 시사합니다. 실제로, 충동은 완전한 C₂SH³⁷ 후 4일 후에 빠르면 나타날 수 있도록 깨어 있는 동물에서 충분히 높은 것으로 보이지만, 부상 후 1일에도 일관되게 존재하지는 않는다²³. 모든 경우에, 마취는 이전 보고서^23,38에서 강조되고 그림 4 및 그림 5에서 나타난 바와 같이, 상부 경추 척추 반절개 후 iDIAm 활동을 억제한다. 본 원고에서 제안된 예비 등쪽 funiculi를 가진 C₂SH를 가진 깨어 있는 쥐의 DIAm EMG 활성에 대한 발표된 데이터는 없습니다(그림 2A). 향후 연구에서는 이 C₂SH 모델을 사용하여 깨어 있는 동물에서 DIAm EMG 활동의 시간 경과에 대한 자세한 특성을 제공해야 합니다. 그렇긴 하지만, 손상 후 3일째에 마취 하에 완충 iDIAm 비활성이 계속 나타나지 않는 것에 대한 검증을 수행하여 척수가 처음에 병변화/절제된 실험 조건을 모방하는 것은 여전히 신중합니다. 부상 후 3일째에 깨어 있는 동물에서 완구심 iDIAm EMG 활성이 나타날 수 있는 경우, 마취제를 절반만 투여해도 일반적으로 완곡성 iDIAm EMG 활성이 완전히 중단된다는 점에 유의해야 합니다. 이 복용량으로 동물들은 침착하고 진정됩니다. _C2SH동안과 부상 후 3일째에 완충성 iDIAm EMG 활동의 침묵을 확인하는 것 외에도,_C2SH ^9,29,59의 부위 및 범위에 대한 조직학적 확인을 수행하기 위해 말단 실험 후에 척수를 추출하는 것이 권장됩니다. 손상에 대한 조직학적 확인은 침묵된 완곡성 iDIAm EMG 활동의 기능적 확인과 결합될 때 성공적인 C₂SH의 강력한 증거를 제공합니다.

본 논문은 쥐에서 cSCI의 C₂SH를 제시하며, 이는 부상 후 3일째에 마취 하에 계속 침묵하면서 완곡한 iDIAm EMG 활동의 즉각적인 침묵으로 이어집니다. 본 원고에서 제안된_C2SH모델에서 등쪽 funiculus의 보존으로 인해, 사지 운동 기능이 보존되어 off-target 효과를 피할 수 있다. 이를 통해 상대적으로 건강한 쥐에서 높은 자궁경부 병변이 DIAm 신경 운동 조절에 미치는 영향에 대한 종단 연구를 수행할 수 있으므로 연구자의 관리 부담을 최소화할 수 있습니다. 부상 후 3일째에 마취 상태에서 비활성을 검증하면 완혈성 iDIAm EMG의 후속 회복 정도를 평가하기 위한 명확한 기준선이 설정됩니다. 이 접근법은 쥐에서 C₂SH를 수행하기위한 엄격하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 모델은 호흡기 신경가소성의 시간 경과와 잠재적인 치료 전략과의 교차점에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25 G 바늘	Cardinal Health	1188825100	Covidien Monoject Hypdermic 표준 바늘 : 25 G x 1 "(0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided	Ethicon	J774D	3-0 봉합
Adson-Brown 집게	Fine Science Tools	11627-12	팁 모양 : 직선, 팁 : 상어 이빨, 팁 너비 : 1.4mm, 팁 크기 : 2 x 1.4 m, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸, 길이 : 12cm
Bowman 스타일 케이지	Braintree Scientific	POR-530	무게 범위: 250 최대 750g; 최대 길이: 9"(228mm); 기본 장치는 .5"(123mm) 보석 아크릴로 구성됩니다.
Castroviejo 바늘 홀더	파인 사이언스 도구	12565-14	팁 모양: 직선, 팁 너비: 1.5 mm, 클램핑 길이: 10 mm, 잠금: 예, 가위: 아니오, 합금 / 재질: 스테인레스 스틸, 길이: 14 cm, 톱니 모양: 예, 특징: 텅스텐 카바이드
클립 리드 1m TP 차폐	Biopac Systems, Inc	LEAD110S	용 차폐 리드선
	LabChart	LabChart LabChart 7.3.8	다중 채널 기록 및 실시간 평가를 위한 데이터 기록, 시각화 및 분석
소프트웨어 데이터 분석 소프트웨어 - Matlab 2023b	Mathworks, Inc.	버전 23.2	사후 분석을 위한 범용 프로그래밍 언어
Dissecting Knife	Fine Science Tools	10056-12	절삭날: 4mm, 두께: 0.5mm, 합금/재질: 스테인리스강, 길이: 12.5cm, 블레이드 모양: 각도 30°C;
Dumont #3 포셉스	파인 사이언스 도구	11293-00	스타일: #3, 팁 모양: 직선, 팁: 표준, 팁 치수: 0.17 x 0.1 mm, 길이: 12 cm, 합금 / 재질: Dumostar
근전도 증폭기	Biopac Systems, Inc	EMG100C	EMG 증폭기
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	팁 모양: 곡선, 컵 크기: 2.5mm, 합금 / 재질: 스테인리스 스틸, 길이: 13cm, 조인트 액션: 단일
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14	합금 / 재질: 스테인리스 스틸, 길이: 14cm, 조인트 액션: 단일, 컵 크기: 1mm, 팁 모양: 곡선형
절연 전원 공급 장치 모듈	Biopac Systems, Inc	IPS100C	Biopac Systems, Inc.의 MP 시리즈 데이터 수집 시스템
Kelly Hemostats	Fine Science Tools	와 독립적으로 100 시리즈 증폭기 모듈을 운영합니다.13019-14	팁 : 톱니 모양, 팁 너비 : 1.5mm, 클램핑 길이 : 22mm, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸, 길이 : 14cm, 팁 모양 : 곡선
나이프 큐렛	V. Mueller	VM101-4414	팁 : 날카로움, 팁 직경 : 2mm
마이크로 해부 가위	Biomedical Research Instruments, Inc.	11-2420	길이: 4", 각도: 스트레이트, 블레이드 길이: 23mm
다중 가닥 스테인리스 스틸 와이어	Cooner Wire, Inc.	AS 631	AWG 40; 전체 직경 : 0.011 mm (절연 포함), 0.008 mm (절연 제외).
PowerLab 8/35	ADInstruments	PL3508	데이터 수집 시스템
메스 블레이드 #11	Fine Science Tools	10011-00	블레이드 모양: 각짐, 절삭날: 20mm, 두께: 0.4mm, 합금/재질: 탄소강
메스 핸들 #3	Fine Science Tools	10003-12	합금 / 재질: 스테인리스강, 길이: 12cm
Sprague Dawley Rat	Inotiv	주문 코드: 002	Sprague Dawley는 근친 쥐 (암컷과 수컷)를 이월했습니다.
현미경	Olympus	SZ61	수술용 현미경
봉합사 절단 가위	George Tiemann & Co.	110-1250SB	합금 / 재질: 스테인리스강, 팁 모양: 직선, 팁: 샤프/블런트, 길이: 4.5"
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	팁: 날카로움, 절삭날: 2.5mm, 팁 직경: 0.05mm, 길이: 8cm, 합금/재질: 스테인리스강, 톱니 모양: 아니오, 팁 모양: 스트레이트
Weitlaner 리트랙터	코드만	50-5647	프롱: 2 x 3 블런트, 길이: 4.5"