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방법 논문

쥐에서 편측 경추 척수 반절개 후 완충 횡격막 활동의 기능적 회복 평가

1.3K 조회수

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DOI:

10.3791/66828

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2024년 6월 14일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic

이 논문에서

요약

호흡기 합병증은 경추 척수 손상(cSCI)이 있는 개인의 주요 사망 원인입니다. cSCI의 동물 모델은 기계론적 평가 및 전임상 연구에 필수적입니다. 여기에서는 쥐에서 편측 C2 척추 반절 (C2SH) 후 횡격막 근육 (DIAm) 활동의 기능적 회복을 평가하는 재현 가능한 방법을 소개합니다.

초록

cSCI 후 DIAm의 활성화는 부상 정도에 따라 영향을 받을 수 있습니다. 본 논문은 쥐에서 호흡하는 동안 완곡성 동측 횡격막(iDIAm) 근전도(EMG) 활동을 방해하는 cSCI의 일방적C2 반절개(C2SH) 모델을 설명합니다. DIAm 모터 제어의 회복을 평가하려면 먼저C2SH로 인한 적자 정도를 명확하게 설정해야 합니다. 호흡 중 iDIAm EMG의 완전한 초기 손실을 확인함으로써 후속 회복은 부재 또는 존재로 분류할 수 있으며 EMG 진폭을 사용하여 회복 정도를 추정할 수 있습니다. 또한,C2SH후 급성 척추 쇼크 기간 후 호흡 중 iDIAm EMG 활성이 지속적으로 부재하는 것을 측정함으로써 초기C2SH의 성공을 검증할 수 있습니다. 반대측 횡격막(cDIAm) EMG 활성을 측정하면 신경 가소성을 반영하는 C2SH의 보상 효과에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 더욱이, 깨어 있는 동물의 DIAm EMG 기록은 C2SH 이후 DIAm의 운동 제어에 대한 중요한 생리학적 정보를 제공할 수 있습니다. 이 기사에서는 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C2SH 모델을 위한 방법을 설명하며, 이는 호흡 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

서론

미국에는 300,000명 이상의 척수 손상(SCI) 환자가 있으며, 그 중 약 절반이 경추 손상을 가지고 있습니다1. 이러한 부상은 심각한 웰빙 손실을 초래하고 개인, 가족 및 의료 시스템에 재정적 부담을 줍니다. 다행히도 대부분의 SCI는 불완전하여 예비 경로를 강화할 수 있는 잠재력을 제공합니다1. 이러한 신경가소성은 인공호흡 및 비인공호흡 행동에 중요한 DIAm 활동을 포함한 적어도 일부 기능의 회복을 허용할 수 있습니다. 따라서 신경 가소성을 촉진하는 것은 SCI2 환자를 돕기 위한 유망한 연구 방법입니다.

SCI의 설치류 모델은 인간의 건강을 개선하기 위한 치료법의 발견에 실질적으로 기여할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 신경 가소성을 연구하는 데 사용되는 SCI의 고전적인 모델 중 하나는 C2 (C2SH)에서 척수의 편측 횡단 (반절개)으로, 반대쪽은 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13을 그대로 유지합니다. 횡격막 출력에 대한 C2SH의 효과와 보존된 반대측 경로의 중요성은 100여 년 전 Porter12에 의해 처음 밝혀졌으며, 그의 중요한 논문은 호흡 신경 가소성에 대한 현대 연구의 토대를 마련했습니다. C2SH모델은 호흡 리듬 생성14의 출력을 전달하는 전운동 뉴런을 포함하는 수질의 rVRG(rostral ventral respiratory group)로부터의 하강 입력을 중단한다. 이러한 rVRG 전운동 뉴런은 또한 흥분성 신경 드라이브를 횡격막 운동 뉴런으로 전달합니다(그림 1). 여러 연구자들이 C2SH 모델10,11,15,16에 대해 다른 접근 방식을 취했으며, 이는 연구 간 회복의 변동성 중 일부를 부분적으로 설명할 수 있습니다. 간단히 말해서, 접근 방식은 등쪽 funiculi를 보존하거나, 완전한 반절개를 수행하거나, 동측 rVRG의 하강 입력을 완전히 중단하지 않는 측면 부분 횡단을 수행하는 측면에서 다양합니다. 일반적으로,C2SH모델은 시간이 지남에 따라 완납 iDIAm 근전도(EMG) 활성의 자발적 회복 속도 때문에 호흡기 신경가소성을 연구하는 데 특히 유용하며, 이는 신경영양성 신호전달을 포함한 여러 요인에 의해 개선될 수 있다 17,18,19,20,21. 그러나 완곡한 iDIAm EMG 활동의 침묵으로 정의되는 초기 기능 상실은 회복을 명확하게 분류하기 전에 먼저 확립되어야 합니다. C2SH시점에서의 비활성에 대한 이러한 검증은 여러 연구 3,4,6,7,11,22,23에서 수행되지 않는다.

절제된 척수의 조직학적 평가는 척수의 횡격막 운동 뉴런을 자극하는 동측 흥분성 구근 경로의 적절한 위치에 대한 손상의 증거만 제공하지만, 조직학은 생리학적 증거(예: DIAm EMG)를 대체하지 않습니다. 또한, 조직학적 평가는 최종 시점(종종 부상 후 몇 주에서 몇 달)에 생체 외에서 수행되며 "실시간" 정보를 제공하지 않습니다. 일부 연구자들은 병변의 크기가 기능적 결함 또는 그 결핍의 양과 관련이 있다고 지적했다 5,24,25,26. 이러한 주장의 타당성은 "기능"을 분류하는 방법(즉, 기능적 작업이 무엇이며 어떻게 정량화되는지)에 따라 크게 달라질 수 있으며, 연구 간의 차이는 동물 간에 기능적으로 동일한 병변을 생성하는 것이 어렵다는 점을 강조한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 실제로, 연구자들은 부상 정도와 사지 근육 운동 기능 사이의 관계(Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB) 점수24로 정량화됨)가 선형이 아니라는 점을 강조했습니다27,28. 이전 연구에서는C2SH의 정도와 손상 후 완청색 iDIAm EMG 활동의 회복 정도 사이에 관계가 없음을 발견했지만10,29,30,31 다른 연구자들은 환기 기능과 백질 보존 정도 사이의 관계를 보고했습니다 5. 따라서,C2SH모델의 경우, 수술 시점 및 바람직하게는 만성 척수 손상 실험의 시간 경과 초기에 iDIAm 비활성의 기능적 검증을 위한 접근법이 유익하고 필요하다.

본 논문은 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가뿐만 아니라 C2SH 후 호흡 중 DIAm EMG의 초기 손실을 실시간으로 확인하고 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가를 위해 DIAm EMG를 사용하는 것을 강조합니다 18,21,31,32,33. C2SH 모델을 사용한 초기 연구에서는 DIAm EMG 10,13,30,34를 기록하기 위해 반복적인 개복술을 수행했습니다. 그러나 보다 최근의 연구는 만성 근전도 전극을 사용하여 마취되고 깨어 있는 쥐에서 근전도를 기록할 수 있습니다. 또한 만성 전극은 기흉의 위험을 줄이고 DIAm35,36의 억제를 유발할 수 있는 반복적인 개복술이 필요하지 않습니다. 많은 연구자들이C2SH모델의 버전을 사용했지만, 수술 당시에는 iDIAm 활성의 침묵에 대한 확인이 이루어지지 않았다 3,4,6,7,11,22,23. 이러한 비활성에 대한 확인이 없으면 후속 회복의 어느 부분이 동측 경로와 반대측 경로의 신경 가소성에 기인하는지 알기 어려우며, 이는 차별적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 rVRG에서 횡격막 운동 뉴런으로의 흡기 신경 드라이브가 주로 동측성이기 때문에 중요한 고려 사항이며, C2SH33 이후 횡막 운동 뉴런에 대한 흥분성 글루타마테르 입력의 약 50%가 손실됩니다. 그러나 반대측 rVRG에서 병변 부위 아래로 감소하여 동측 횡격막 운동 뉴런을 자극하고 신경 가소성을 통해 강화하여 기능 회복을 촉진할 수 있는 흡기 흥분성 입력이 남아 있습니다. 횡격막 운동 뉴런에 대한 우세한 동측 흥분성 입력을 제거함으로써, 완납 iDIAm EMG 활성은 (적어도 마취 하에서) 손실되는 반면, cDIAm의 활성은 계속되고 심지어 향상됩니다. 따라서 호흡 중 iDIAm EMG 활동의 손실은 성공적인 C2SH의 척도입니다 (그림 2).

일부 수준의 iDIAm EMG 활동은 깨어 있는 동물에서 C2SH 후 1-4일 이내에 존재합니다23,37. 또한, decerebrate 동물에서, iDIAm 활성은 상부 경추 반절제 후 몇 분 내지 몇 시간 내에 존재하며, 마취에 의해 억제된다38. 또한, C2SH의 성공은 부상 후 3일째에 마취된 쥐에서 호흡(유프니아) 중 iDIAm EMG 활성이 없음을 확인함으로써 검증됩니다. 공초점 이미징 연구는 이 손상의 초기 단계에서 횡격막 운동 뉴런의 글루타마테르직 시냅스 입력의 손실을 확인했다37. 부상 후 3일째에 잔류 완청성 iDIAm EMG 활동이 있는 경우 이는 rVRG에서 동측 하강 흡기 드라이브가 불완전하게 제거되었다는 증거로 해석됩니다. 본 논문은 (1) 만성 DIAm EMG 기록, (2) C2SH 및 (3) 깨어 있는 동물 및 마취된 동물에서의 EMG 데이터 수집의 세 섹션으로 나뉩니다. 이 프로토콜은 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C2SH 모델을 설명하며, 이는 호흡기 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: A00003105-17-R23)의 승인을 받았습니다. 본 연구의 동물은 생후 약 3개월이고 체중이 200g에서 350g 사이인 수컷과 암컷 Sprague-Dawley 쥐의 혼합이었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 전극 이식

  1. 전극 준비
    1. 언급된 장비를 사용할 수 있는지 확인하십시오: (1) 다중 가닥, 스테인리스 스틸 와이어, (2) #11 날이 있는 메스, (3) 가위, 4) 해부 현미경, (5) 자, (6) 집게, (7) 25g 바늘, (8) 2개의 플라이어(압착 영역이 있는 하나 이상).
    2. 전극을 만드는 과정의 세부 사항은 그림 3에 나와 있습니다. 쌍을 이루는 차동 기록 전극에 대해 이 과정을 두 번 이상 반복합니다.
    3. 먼저 스테인리스 강선을 18cm 측정하고 자릅니다.
    4. 그림 4와 같이 와이어의 한쪽 끝에서 3cm 떨어진 곳에 기본 오버핸드 매듭을 묶습니다. 이것은 와이어의 짧은 면이 DIAm에 이식되고 봉합될 때 앵커 역할을 합니다.
    5. 메스와 외과적 해부 스코프를 사용하여 와이어의 짧은 쪽에 있는 매듭 바로 옆에 있는 2mm의 절연체를 조심스럽게 벗겨냅니다. 다중 가닥 전선의 가닥을 자르지 않도록 각별히 주의하십시오.
      알림: 이 절연되지 않은 부분은 전극의 전도성 표면 역할을 합니다. 일반적으로 신호 품질은 3개 이상의 가닥이 부주의하게 절단되면 저하되기 시작하며, 이 경우 전극을 교체합니다.
    6. 다음으로, 와이어의 짧은 쪽 끝에서 ~5mm를 벗겨낸 다음 25G 바늘의 내강에 삽입하여 전극을 DIAm에 이식하는 데 사용할 봉합사 같은 도구를 만듭니다.
      알림: 개인 취향에 따라 더 높은 게이지 바늘(예: 최대 28G)을 사용할 수도 있습니다. 더 높은 게이지 바늘의 직경이 더 얇기 때문에 기흉의 위험이 잠재적으로 줄어들 수 있습니다. 그러나 여러 가닥 와이어를 바늘의 더 작은 루멘에 삽입하는 것이 더 어려울 수도 있습니다.
    7. 이렇게하려면 포장에서 25G 바늘을 제거하고 두 펜치를 사용하여 바늘이 부러질 때까지 날카로운 비스듬한 끝에서 좌우로 ~ 1cm 떨어진 바늘을 조심스럽게 구부립니다.
      참고: 이 프로세스는 서두르지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 전단력으로 인해 바늘의 내강이 닫혀 프로세스를 반복해야 할 수 있습니다.
    8. 벗겨진 와이어의 끝 부분을 끊어진 1cm 바늘의 루멘에 삽입하고 바늘이 와이어의 나머지 절연 부분에 바로 인접하도록 합니다.
    9. 바늘과 와이어의 나머지 짧은 쪽 사이에 절연되지 않은 부분이 없는지 확인하고 바늘을 압착하여 와이어에 부착합니다.
    10. 그런 다음 두 개의 펜치를 사용하여 부착된 바늘을 조심스럽게 구부려 표준 수술용 봉합 바늘과 유사한 곡률을 만듭니다.
    11. 마지막으로 전선의 긴 쪽 끝에서 ~5mm를 벗겨냅니다(그림 3). 전극을 DIAm에 봉합한 후 와이어의 긴 쪽은 DIAm EMG 기록을 허용하기 위해 외부 액세스를 위해 터널링됩니다.
    12. 이 과정을 반복하여 차동 녹음을 위한 두 번째 전극을 만듭니다.
  2. 다이어프램 EMG 전극 배치
    1. 수술 전에 (1) 작은 동물 이발기, (2) #11 날이 있는 메스, (3) 수술용 가위, (4) 겸자, (5) 마이크로 바늘 홀더를 포함한 모든 수술 장비를 멸균하거나 고압멸균하십시오.
    2. 깨끗한 케이지를 구입하고 음식, 물, 침구 및 환경 풍요로움을 제공하십시오. 가열 패드에 따로 보관하십시오. 이 케이지는 수술 후 동물을 수용하는 데 사용됩니다.
    3. 수술 부위를 적절한 소독제로 소독하고 개인 보호 장비(스크럽, 캡, 마스크 및 수술용 장갑)를 착용합니다. 이전에 준비한 전극을 70% 이소프로필 알코올 풀에 넣습니다.
    4. 마취 및 수술 중 쥐의 체온을 유지하기 위해 수술 부위에 가열 패드를 놓습니다. 멸균된 수술용 수건으로 가열 패드를 덮습니다.
    5. 쥐의 무게를 측정하고 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 적절한 마취 투여량을 계산합니다.
    6. 케타민(80mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)의 뒷다리 근육 주사 또는 기타 적절한 마취제(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)로 쥐를 마취합니다. 수술 전에 서방형 부프레노르핀(1mg/kg)과 카프로펜(5mg/kg)을 주사합니다. 동물이 더 이상 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 진행하십시오.
    7. 이위를 사용하여 쥐를 xiphoid 돌기에서 뒷다리의 대략 절반까지 면도하십시오. 또한 전극이 동물의 손이 닿지 않는 곳(보통 견갑골 주위)이 외부화되는 쥐의 등을 면도하십시오. 거즈 조각으로 여분의 머리카락을 닦아내십시오.
    8. 클로로헥시딘 글루코네이트(부피 기준 중량 4%)에 적신 멸균 거즈로 피부를 세척하여 절개를 준비합니다.
    9. 멸균된 가열 패드에 동물을 누운 자세로 놓습니다. xiphoid 과정에서 시작하여 메스와 깨끗한 #11 칼날을 사용하여 4-5cm의 꼬리 절개를 만듭니다. 이렇게 하면 밑에 있는 복부 근육층이 노출되어야 합니다.
    10. 근육층의 정중선을 따라 또 한 번 절개(3-4cm)하여 복부 내용물을 노출시킵니다. 복부 장기를 뚫지 않도록 주의하십시오.
    11. 동물의 오른쪽은 간에 가려지더라도 DIAm의 복부(즉, 하부) 표면이 보이는지 확인하십시오.
    12. 메스 손잡이나 기타 뭉툭한 도구를 사용하여 간과 다른 장기를 아래로 눌러 DIAm의 복부를 노출시킵니다.
    13. 이소프로필 알코올 풀에서 전극을 제거하고 멸균 식염수로 세척하여 사용할 전극을 준비합니다. 그런 다음 마이크로 니들 홀더를 사용하여 이전에 준비한 전극 중 하나를 DIAm의 중간 늑골 영역에서 근육 섬유에 수직으로 향하게 합니다. 근섬유는 DIAm을 가로질러 방사상으로 퍼져 있습니다.
      알림: DIAm은 얇고(~2mm) 구멍이 뚫리지 않아야 합니다. 오히려, 목표는 전극 와이어의 절연되지 않은 부분(그림 3)을 DIAm 내에 내장하는 것입니다.
    14. 수술용 현미경을 사용하여 전극 봉합사(바늘 끝)를 DIAm에 조심스럽게 삽입합니다. 바늘의 곡률이 전극을 DIAm의 복부 표면 안팎으로 안내하도록 하여 와이어의 절연되지 않은 부분 전체가 근육에 완전히 박히도록 합니다.
    15. 와이어의 매듭이 DIAm에 고정될 때까지 바늘을 조심스럽게 당깁니다. 전극 와이어의 절연되지 않은 부분(2mm)이 바늘이 DIAm에 처음 들어간 지점에 매듭이 있는 DIAm 내에 완전히 있는지 확인합니다.
    16. 그런 다음 전극선에서 바늘을 잘라 날카로운 물건 용기에 버리십시오.
    17. 두 개의 집게를 사용하여 봉합사(3-0) 바늘이 DIAm에서 나온 지점에 매듭을 묶습니다. 이렇게 하려면 와이어의 짧은 쪽에 고리를 묶고 고리를 DIAm의 복부 표면까지 밀어 넣은 다음 고리를 조심스럽게 조여 매듭을 만듭니다. 전극(절연되지 않은 부분)은 이제 입구와 출구 지점 모두에 고정되어야 합니다.
    18. 와이어의 짧은 쪽의 초과 부분을 잘라냅니다.
    19. 1.2.14-1.2.18 단계에 따라 첫 번째 전극에서 ~3mm 떨어진 DIAm의 같은 쪽에 있는 다른 전극을 봉합합니다.
    20. 같은 방식으로 반대쪽 반구에 전극 쌍 삽입을 수행합니다.
    21. 다음으로, 전극 와이어의 긴 쪽이 모두 복강 외부에 있는지 확인하고 복부를 닫기 위해 근육층을 봉합(3-0)하기 시작합니다. 각 전극 쌍에 대해 고리를 만들고 고정합니다.
      알림: DIAm에 긴장을 일으키지 않고 쥐가 늘어날 수 있도록 복강 내에 2-3cm의 와이어가 남아 있는지 확인하십시오.
    22. 식염수로 과도한 혈액을 닦아낸 다음 근육층을 연속적인 패턴으로 봉합(3-0)하여 복막을 닫습니다.
    23. 쥐의 내측 등쪽 피부에서 열린 복부 피부까지 16G 카테터를 터널링하고 한 쌍의 전극 와이어를 쥐의 뒤쪽으로 당깁니다.
    24. 반대쪽에 두 번째 카테터로 이 과정을 반복하고 두 번째 쌍의 전극 와이어를 당겨 통과시킵니다.
    25. 단속 봉합 패턴에서 3-0 봉합사로 복부 피부를 봉합합니다.
    26. 다음으로, 각 쌍에 대해 전극 와이어를 매듭으로 묶고 제자리에 봉합합니다.
    27. 동물에게 피하 식염수 주사를 제공합니다(동물 질량 50g당 ~1ml). 동물을 온열 패드 위의 깨끗한 케이지에 넣어 회복하십시오.
      참고: 개복술은 DIAm 활성을 억제할 수 있다35,36. EMG 측정의 정량 분석 전에 최소 72시간을 허용하십시오.

2. 경추 척추 반절부

  1. 이전과 같이 멸균 수술 영역을 준비합니다.
  2. 수술 전에 모든 수술 장비를 고압멸균하거나 멸균하십시오. 필요한 장비: (1) 작은 동물 이발기, (2) #11 날이 있는 메스, (3) 수술용 가위, (4) 집게, (5) 롱거, (6) 견인기, (7) 각진 해부 칼.
  3. DIAm EMG 전극 이식 후 약 72시간 후에 쥐의 무게를 측정하고 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 적절한 마취 투여량을 계산합니다.
  4. 쥐를 마취하기 전에 쥐를 Bowman 스타일의 케이지에 넣고 3.2단계에 설명된 대로 양측 DIAm EMG를 기록합니다.
  5. 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 복강내 주사 또는 현지 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜에 따라 기타 적절한 마취제로 쥐를 마취합니다. 수술 전에 서방형 부프레노르핀(1mg/kg)을 피하로 주사하고 카프로펜(5mg/kg)을 복강내로 주사합니다.
  6. 동물이 더 이상 발가락 꼬집음에 반응하지 않으면 진행하십시오. 약 15분마다 발가락 꼬집으로 마취 깊이를 확인하십시오.
  7. 수술을 시작하기 전에 쥐를 엎드린 자세로 놓고 3.3단계에 설명된 대로 마취된 쥐의 EMG를 기록합니다.
    알림: 모든 녹음이 쥐가 같은 위치에 있는 상태에서 수행되었는지 확인하십시오.
  8. 목에서 귀 높이까지 털을 깎고 젖은 거즈로 제거합니다.
  9. 클로로헥시딘 글루코네이트(부피 기준 중량 4%)로 피부를 청소하고 동물을 멸균 수술용 커버(상부 등쪽 제외)로 덮습니다.
  10. 메스를 사용하여 4cm의 꼬리 관절을 절개합니다. 피부를 수축시키고 견봉 평탄근을 자릅니다. 그런 다음 마름모꼴 근육을 절개하여 척추 근육을 노출시킵니다.
    참고: 견봉 플라페지우스는 중간 승모근이며 근육 섬유는 척추와 거의 평행합니다. 마름모꼴 근육은 견봉 플라페지우스 아래의 평면에 노출되어 있으며 근육 섬유는 대각선으로 뻗어 있습니다.
  11. 척추 근육을 C1 에서 C3으로 수축시킵니다.
    참고: 척추 근육은 척추 바로 옆에 있습니다.
  12. 수술용 현미경을 통해 보면서 주요 동맥이나 신경이 손상되지 않았는지 확인하기 위해 rongeur를 사용하여 C2 에서 후궁 절제술을 조심스럽게 수행합니다.
  13. C 2에서 경막을 자르고 집어넣습니다.
  14. 척추 반절개를 수행하는 동안 노출된 전극 와이어를 쥐의 등에서 증폭기에 연결합니다. 자세한 내용은 3단계를 참조하십시오.
  15. DIAm EMG를 모니터링하는 동안 그림 2A와 같은 방식으로 등뿌리가 척수로 들어가는 지점 바로 아래에 각진 절개 칼을 삽입하고 복부 표면의 중간 지점까지 절단합니다.
    알림: 전자 열 패드를 사용하는 경우 소음을 피하기 위해 EMG를 모니터링하는 동안 열 패드를 꺼야 할 수 있습니다.
  16. 이 절편 후 몇 초 이내에 부상과 동측인 완곡한 DIAm EMG 활성이 멈추고 cDIAm EMG 활성의 보상적 증가가 분명한지 확인합니다(그림 2C).
  17. 완곡한 iDIAm EMG 활동이 지속되면 그림 2C에 강조 표시된 대로 해부 칼로 다른 절단을 수행하십시오. 그러나 정중선을 가로질러 절단하지 마십시오. 반대쪽으로 자르면 동물이 죽을 가능성이 큽니다.
  18. 멸균 봉합사로 근육을 봉합한 다음 피부를 봉합합니다(3-0).
  19. 수분을 유지하기 위해 동물 질량 50g당 1mL의 식염수를 피하 주사하고 회복을 위해 가열 패드가 있는 깨끗한 케이지에 동물을 넣습니다. 동물이 수술에서 회복하는 동안 모니터링하십시오.
  20. 약 72시간 후(Day 3 Post-C2SH), 프로토콜 단계 3.2에 따라 깨어 있는 쥐의 EMG 활동을 기록합니다. 쥐의 등쪽에 있는 실밥이 손상되지 않도록 주의하십시오.
  21. 다음으로, 수술용 비행기에 필요한 것보다 더 가벼운 용량의 마취제(정상 용량의 1/3에서 1/2 사이)를 사용하여 쥐를 다시 한 번 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따라). 쥐가 온전한 각막 반사를 보이고 발가락 꼬집음에 반응하는 한 추가 투여가 이루어질 수 있습니다.
  22. 프로토콜 단계 3에 따라 DIAm EMG 활동을 모니터링합니다.
    알림: iDIAm EMG 활동의 초기 평가에 사용된 것과 동일한 위치에 쥐를 놓습니다.
  23. 완충 iDIAm EMG 활성(즉, 흡기 cDIAm EMG 활성과 함께 위상별 활성)이 3일째에 없는 경우 초기C2SH가 성공적이었다고 결론을 내리고 추가 분석을 위해 동일한 동물을 포함합니다.

3. 데이터 수집 및 분석

  1. 일반 설정 및 데이터 추출
    1. 프리앰프의 대역 통과 필터를 100Hz(고역 통과) 및 1000Hz(저역 통과)로 설정합니다.
      참고: 이러한 필터 설정은 움직임 아티팩트를 제거하고 근육 내 DIAm EMG 신호의 주파수 성분 대부분을 유지하면서 60Hz 노이즈 및 ECG 오염(~75Hz에서 피크 전력)을 크게 줄입니다. 나이퀴스트 이론에 따라 2000Hz의 샘플링 주파수로 디지털화하여 앨리어싱을 피하고 화합물 EMG의 모터 단위 활동을 기록할 수 있는 적절한 해상도를 허용합니다. 100Hz 미만의 주파수 범위에 대한 특수 주파수 성분 분석을 수행하는 경우 관심 주파수가 필터링되지 않도록 전치 증폭기 필터 설정을 지정하는 것이 중요합니다.
    2. 컴퓨터의 시각화 소프트웨어에서 두 채널(좌측 및 우측 반격막 EMG)을 모니터링하고 추가 분석을 위해 데이터를 적절한 형식으로 저장합니다.
    3. 분석을 위한 충분한 데이터를 확보하기 위해 최소 1-2분의 완곡 녹음을 수집합니다.
    4. 데이터가 세 개 이상의 시점에서 수집되는지 확인합니다.
      1. C2SH 이전에 깨어 있고 마취된 상태에서 기준선 완곡 녹음을 설정합니다.
      2. 마취된 상태에서 완곡한 iDIAm EMG 활성의 침묵을 확립하기 위한 C2SH 수술 중.
      3. C-C2후 3일째에 SH를 사용하여 완곡성 iDIAm EMG 활성의 부재가 지속되는지 확인하고 척추 쇼크 2,39 또는 부프레노르핀과 같은 호흡기 억제제의 투여에 영향을 받지 않는 깨어 있는 동물의 결핍 정도에 대한 초기 지점을 설정합니다.
    5. 디지털화된 신호에 대해 계산을 수행할 수 있는 소프트웨어(예: Matlab, Python, R)를 사용하여 DIAm EMG 기록을 분석합니다. 기본 프로세스는 다음과 같습니다.
      1. 원시 EMG 파일을 로드합니다. 필터링 설정에 따라 신호의 DC 오프셋을 고려해야 할 수도 있습니다.
        참고: 쉬운 수정은 원시 EMG 신호 자체에서 원시 EMG 신호의 평균을 빼는 것입니다.
      2. 50ms의 이동 윈도우로 EMG 신호의 제곱평균제곱근을 계산합니다. 이 작업은 신호의 끝에 도달할 때까지 한 번에 하나의 샘플 포인트씩 50ms 계산 창을 앞으로 이동하여 수행할 수 있습니다.
        참고: 개별 DIAm EMG 이벤트의 분석은 가장 높은 통계적 검정력을 제공하며 eupneic 및 non-eupneic 활동의 클러스터링을 허용합니다. 따라서, DIAm EMG에서 개별 호흡의 시작 및 오프셋을 감지하는 것이 가장 중요하며, 이는 이전 보고서(40)에서 강조된 바와 같습니다.
    6. 이전 보고서41과 같이 순간 호흡수 및 파열 지속 시간의 히스토그램을 시각화하여 eupneic 활동의 필터링을 수행합니다.
  2. 깨어있는 녹음.
    1. Bowman 스타일의 설치류 우리에 쥐를 넣어 깨어 있는 녹음을 수행합니다. 원통형 Bowman 스타일의 케이지는 최대 750g의 성인 쥐를 수용 할 수 있습니다.
    2. Bowman 스타일 케이지의 한쪽에 있는 금속 막대를 풀고 안에 있는 쥐를 부드럽게 달래십시오. 금속 막대를 다시 조여 쥐를 원통형 케이지에 가둡니다.
      알림: 녹음을 진행하기 전에 최소 30분 동안 쥐를 케이지에 적응시키십시오. 가능하면 측정하기 전에 여러 일 동안 쥐를 Bowman 스타일 케이지에 적응시키는 것이 가장 좋습니다. 이 적응 단계에서 쥐가 우리에 있는 동안 간식을 제공하는 것이 좋습니다.
    3. 외부의 시각적 자극을 최소화하려면 종이 타월이나 이와 유사한 물체를 사용하여 쥐의 머리가 있는 우리 앞쪽에 텐트를 만듭니다. 또한 시끄러운 소음을 최소화하고 모든 지점에서 쥐의 신체적 편안함을 보장하십시오.
      알림: 불편함의 명백한 징후에는 안절부절, 빠른 호흡, 케이지에 대한 몸부림이 포함됩니다. 이러한 징후 중 하나라도 관찰되면 쥐를 집 우리로 돌려보내고 쥐가 더 차분해질 때 녹음을 시도해야 할 수 있습니다.
    4. 작은 쥐(<300g)의 경우 충전재(예: 종이 타월, 면봉)를 케이지의 추가 공간에 삽입하여 쥐가 180도 회전하지 않도록 합니다.
    5. 쥐가 적응한 후 쥐 등쪽에서 나오는 전선을 아날로그 신호를 아날로그-디지털 변환기에 공급하는 전치 증폭기에 조심스럽게 연결하고 3.1단계에 설명된 절차를 따릅니다.
  3. 마취 녹음
    1. 매번 같은 위치에 쥐를 놓고, 가급적이면 깨어 있는 쥐의 자세를 더 가깝게 모방하는 경향이 있습니다.
    2. rat dorsum에서 나오는 전선을 프리앰프에 연결하고, 아날로그 신호를 아날로그-디지털 변환기에 공급하고 3.1단계에 설명된 절차를 따릅니다.
  4. 동물 회수
    1. 회복을 위한 침구가 없는 깨끗하고 빈 쥐 우리 안에 쥐를 넣으십시오.
    2. 케이지를 가열 패드에 놓습니다.
    3. 처음 3시간 동안 또는 쥐가 움직이기 시작할 때까지 일정한 간격(<15분)으로 쥐를 모니터링합니다. 동물이 다시 깨어날 때까지 덜 규칙적인 간격(30분)으로 모니터링하십시오.
    4. 쥐가 보행을 할 수 있게 된 후에는 침구, 음식과 물에 접근할 수 있는 환경적 풍부함이 있는 깨끗한 새장에 넣으십시오.
    5. 실험이 진행되는 동안 적어도 하루에 한 번 쥐를 계속 모니터링하십시오. 체중/수유 능력의 변화뿐만 아니라 절개 부위와 봉합사의 무결성에 특히 주의를 기울이십시오.

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결과

이 기사에서 제시된 접근 방식은 C2SH의 랫 모델에서 DIAm EMG를 평가하기 위한 명확한 기준을 설정하여 작업자 간 변동성을 최소화합니다. 첫째, 그림 2와 같이C2SH직후 완곡한 iDIAm EMG 활성의 중단을 관찰해야 합니다. 그렇지 않은 경우 eupneic iDIAm 활성이 사라질 때까지 2차 횡단을 수행할 수 있습니다. 둘째,C-2SH 후 3일째에 동물을 마취하는 동안 완곡한 iDIAm EMG가 계속 없는지 확인해야 합니다. 그림 4A는 부상 후 3일째에 마취 하에 완곡한 iDIAm EMG 활동이 지속적으로 부재한 것으로 결정된 성공적인 C2SH의 예를 보여줍니다. 그림 4B는 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 동물에서 DIAm EMG 활동을 보여주며, 부상 전 기준선과 비...

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토론

C2 척추 반절개
이 기사에서 설명하는 절차는 등쪽 funiculi를 보존하면서 lateral and ventral funiculi를 가로지르는 C2 척추 병변의 검증 역할을 하는 DIAm EMG 활성의 평가를 강조합니다(그림 2A). 제안된 수술 접근법에는 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 쥐의 보행 기능을 보존하는 등쪽 funiculi를 보존하면서 횡격막 운동 뉴런에 대한 동측 입력을 여전히 절단합니다. 둘째, DIAm EMG를 모니터링함으로써 동물이 마취되는 동안 수술 중 초기에 완곡성 iDIAm EMG 활성을 제거하는 C2 병변의 효능을 검증할 수 있습니다. 부상 후 3일째에 동물이 마취되는 동안 완곡한 iDIAm EMG 활동이 실제로 계속 침묵하는지 확인합니다. 이전에 횡격막 운동 뉴런에 대한 rVRG 흥분성 입력과 횡격막 운동 뉴런의 NMDA 수용체 발현은 손상 후 ...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 NIH 자금 출처(NIH R01HL146114)를 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25 G 바늘Cardinal Health1188825100Covidien Monoject Hypdermic 표준 바늘 : 25 G x 1 "(0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet BraidedEthiconJ774D3-0 봉합
Adson-Brown 집게Fine Science Tools11627-12팁 모양 : 직선, 팁 : 상어 이빨, 팁 너비 : 1.4mm, 팁 크기 : 2 x 1.4 m, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸, 길이 : 12cm
Bowman 스타일 케이지Braintree ScientificPOR-530무게 범위: 250 최대 750g; 최대 길이: 9"(228mm); 기본 장치는 .5"(123mm) 보석 아크릴로 구성됩니다.
Castroviejo 바늘 홀더파인 사이언스 도구12565-14팁 모양: 직선, 팁 너비: 1.5 mm, 클램핑 길이: 10 mm, 잠금: 예, 가위: 아니오, 합금 / 재질: 스테인레스 스틸, 길이: 14 cm, 톱니 모양:
예, 특징: 텅스텐 카바이드
클립 리드 1m TP 차폐Biopac Systems, IncLEAD110S용 차폐 리드선
LabChartLabChart LabChart 7.3.8다중 채널 기록 및 실시간 평가를 위한 데이터 기록, 시각화 및 분석
소프트웨어 데이터 분석 소프트웨어 - Matlab 2023bMathworks, Inc.버전 23.2사후 분석을 위한 범용 프로그래밍 언어
Dissecting KnifeFine Science Tools10056-12절삭날: 4mm, 두께: 0.5mm, 합금/재질: 스테인리스강, 길이: 12.5cm, 블레이드 모양: 각도 30°C;
Dumont #3 포셉스파인 사이언스 도구11293-00스타일: #3, 팁 모양: 직선, 팁: 표준, 팁 치수: 0.17 x 0.1 mm, 길이: 12 cm, 합금 / 재질: Dumostar
근전도 증폭기Biopac Systems, IncEMG100CEMG 증폭기
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14팁 모양: 곡선, 컵 크기: 2.5mm, 합금 / 재질: 스테인리스 스틸, 길이: 13cm, 조인트 액션: 단일
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16021-14합금 / 재질: 스테인리스 스틸, 길이: 14cm, 조인트 액션: 단일, 컵 크기: 1mm, 팁 모양: 곡선형
절연 전원 공급 장치 모듈Biopac Systems, IncIPS100CBiopac Systems, Inc.의 MP 시리즈 데이터 수집 시스템
Kelly HemostatsFine Science Tools와 독립적으로 100 시리즈 증폭기 모듈을 운영합니다.13019-14팁 : 톱니 모양, 팁 너비 : 1.5mm, 클램핑 길이 : 22mm, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸, 길이 : 14cm, 팁 모양 : 곡선
나이프 큐렛V. MuellerVM101-4414팁 : 날카로움, 팁 직경 : 2mm
마이크로 해부 가위Biomedical Research Instruments, Inc.11-2420길이: 4", 각도: 스트레이트, 블레이드 길이: 23mm
다중 가닥 스테인리스 스틸 와이어Cooner Wire, Inc.AS 631AWG 40; 전체 직경 : 0.011 mm (절연 포함), 0.008 mm (절연 제외).
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508데이터 수집 시스템
메스 블레이드 #11Fine Science Tools10011-00블레이드 모양: 각짐, 절삭날: 20mm, 두께: 0.4mm, 합금/재질: 탄소강
메스 핸들 #3Fine Science Tools10003-12합금 / 재질: 스테인리스강, 길이: 12cm
Sprague Dawley RatInotiv주문 코드: 002Sprague Dawley는 근친 쥐 (암컷과 수컷)를 이월했습니다.
현미경OlympusSZ61수술용 현미경 
봉합사 절단 가위George Tiemann & Co.110-1250SB합금 / 재질: 스테인리스강, 팁 모양: 직선, 팁: 샤프/블런트, 길이: 4.5"
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-08팁: 날카로움, 절삭날: 2.5mm, 팁 직경: 0.05mm, 길이: 8cm, 합금/재질: 스테인리스강, 톱니 모양: 아니오, 팁 모양: 스트레이트
Weitlaner 리트랙터코드만50-5647프롱: 2 x 3 블런트, 길이: 4.5"
사 EMG 데이터 수집 소프트웨어 수술용

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