방법 논문

Exclusion Derived Mesenchymal Stem Cells with High Yields and Low Damage(높은 수율과 낮은 손상의 탯줄 유래 중간클립 줄기세포의 분리)

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DOI:

10.3791/66835

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2024년 7월 5일

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1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

이 논문에서

요약

이 연구는 Wharton's jelly(WJ)의 무결성을 보존하기 위한 고유한 둔부 해부 절차를 제시하여 WJ가 덜 손상되고 수확된 중간엽 줄기 세포(MSC)의 양과 생존력을 높입니다. 이 방법은 기존의 날카로운 해부 방법에 비해 우수한 수율과 증식 능력을 보여줍니다.

초록

중간엽 줄기 세포(MSC)는 놀라운 재생 및 면역 조절 특성을 가진 다능 세포의 집단입니다. 탯줄(UC)에서 추출한 Wharton's jelly(WJ)는 MSC의 뛰어난 공급원으로 생물의학 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 그러나 제한된 공급과 기존 방법의 표준화 부족과 같은 문제가 발생했습니다. 이 기사에서는 탯줄에서 온전한 WJ를 절개하여 MSC 수율을 향상시키는 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법은 둔기 절개를 사용하여 상피층을 제거하여 전체 WJ의 무결성을 유지하고 수확된 MSC의 양과 생존력을 증가시킵니다. 이 접근 방식은 기존의 날카로운 해부 방법에 비해 WJ 폐기물을 크게 줄입니다. WJ-MSC의 순도를 보장하고 외부 세포 영향을 최소화하기 위해 UC를 뒤집은 후 내부 장력을 사용하여 내피를 박리하는 절차를 수행했습니다. 또한, 페트리 접시는 부착 및 세포 성장을 개선하기 위해 외식물 배양 중에 짧은 시간 동안 뒤집혔습니다. 비교 분석을 통해 제안된 방법의 우수성을 입증했으며, 기존 방법보다 더 나은 생존력을 가진 WJ 및 WJ-MSC의 더 높은 수율을 보여주었습니다. 두 방법 모두에서 세포 표면 마커의 유사한 형태 및 발현 패턴은 다양한 응용 분야에서 이들의 특성화와 순도를 확인합니다. 이 방법은 WJ-MSC 분리를 위한 고수율 및 고생존력 접근법을 제공하여 MSC의 임상 적용에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.

서론

1991년 Wharton's jelly(WJ)에서 중간엽 줄기세포(MSC)를 처음 분리한 이래로 이러한 다능성 줄기세포는 재생 특성과 다중 계통 분화 능력1으로 인해 연구자들로부터 상당한 주목을 받았습니다. MSC는 골수, 말초 혈액, 치수, 지방 조직, 태아(인간 유산) 및 출산 관련 조직을 포함한 다양한 출처에서 분리할 수 있습니다2. 탯줄(UC)은 비침습적 특성, 풍부한 세포 수율 및 분화 능력으로 인해 유망한 저장소로 부상했으며 높은 증식률, 분화 가능성 및 면역 조절 특성을 나타냅니다3. 태아 MSC는 강력한 줄기 및 면역 특성을 나타내어 지난 20년 동안 수행된 임상 시험 및 기초 연구의 주요 초점이 되었습니다 2,4,5. UC 유래 MSC는 골수 또는 지방 조직과 같은 다른 MSC 공급원에 비해 치료 잠재력이 우수합니다 6,7.

UC는 양수 상피, 3 개의 혈관 (2 개의 동맥과 1 개의 정맥) 및 WJ3로 알려진 젤라틴 물질로 구성됩니다. 흥미롭게도, UC는 내피와 중피로만 구성되는 단순한 혈관 구조를 구성하지만 tunica adventitia는 구성하지 않습니다. WJ에는 림프나 신경이 포함되어 있지 않다8. UC는 분절 분리에 이상적인 고유한 구조를 제공합니다. UC-MSC는 주로 WJ에 있습니다. MSC는 양막, 양막하(양막과 양막은 탯줄 내벽 영역으로도 지정됨) 및 WJ8의 혈관 주위 영역을 포함하여 WJ의 다른 구획에서 분리될 수 있습니다. WJ의 각 영역은 고유한 구조, 면역조직화학적 특성 및 기능 3,6을 가지고 있습니다.

UC의 WJ에서 분리된 MSC는 다른 지역의 MSC에 비해 우수한 임상적 유용성을 가진 것으로 널리 알려져 있다3. WJ-MSC는 다계통 분화 잠재력, 면역 조절 특성, 파라크린 효과, 항염증 효과 및 면역 특권 특성으로 인해 다양한 질병의 치료를 위한 전임상 및 임상 환경에서 광범위하게 연구되었습니다 2,3. WJ-MSC는 이식편대숙주병(GvHD), 이식편거부척척증, 크론병, 자가면역질환 및 심혈관질환 9,10,11,12,13,14를 포함한 다양한 질병 치료에 대한 유망성이 입증되었습니다. WJ-MSC에 대한 임상 수요가 계속 증가함에 따라 탯줄의 공급 부족은 현재 탯줄의 광범위한 응용 분야에 장애물이 되고 있습니다.

WJ-MSC의 수율은 세포 추출에 사용되는 방법에 따라 달라진다15. WJ-MSC는 외식물 배양 또는 효소 분해를 통해 분리할 수 있지만, 후자의 방법은 증식 시간이 길어 세포 손상의 위험을 증가시키고 세포 생존율을 감소시킬 수 있습니다16. 그러나 수많은 연구에 따르면 외식물 배양법은 세포 수율과 생존율을 증가시키고, 외식물 조직에서 방출되는 파라크린 인자도 세포 증식을 촉진하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다17,18.

이 연구는 고유한 해부 접근 방식을 적용하여 전체 WJ를 얻어 WJ에 대한 손상을 최소화하면서 증식 능력, 생존력 및 양이 향상된 MSC를 수득했습니다. 이 혁신적인 방법은 WJ-MSC를 격리하기 위한 간소화된 전략을 제공하여 MSC 응용 분야의 중요한 요구 사항을 해결합니다.

프로토콜

샘플은 중국 광둥성에 있는 Shenzhen Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital의 동의한 건강한 기증자로부터 얻었습니다. 연구를 위한 인체 샘플 사용은 베이징 중의약 대학 선전 병원 윤리 위원회(SZLDH2020LSYM-095) 및 선전 룽강구 산부인과 및 아동 건강 관리 병원 의료 윤리 위원회(LGFYYXLLS-2020-005)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 승인된 지침에 따라 수행되었습니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 인간의 탯줄 채취

  1. 무균 상태에서 협력 병원에서 인간 탯줄 샘플을 얻습니다.
    참고: 35세 미만의 기증자, 가급적이면 간염, 성병 또는 유전 질환의 병력이 없는 프리미파라를 선택하십시오. B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 거대세포바이러스에 대한 입학 시험 결과는 음성이어야 합니다. 분만 방법으로 제왕절개를 선택하십시오.
  2. 약 10-15cm 길이의 직선적이고 손상되지 않은 UC 조각을 선택하십시오.
  3. 지혈 겸자로 양쪽 끝을 봉합하고 제왕 절개로 만삭 신생아를 출산한 직후 겸자 사이의 안쪽 끝에 수술용 매듭으로 결찰합니다. ( 그림 1, 단계 1과 같이 수집된 UC).
    참고: 제왕절개 수술은 채취물이 무균 상태임을 보장합니다. 더 나은 인장 강도를 위해 0 또는 2-0 크기의 봉합사의 수술 매듭을 사용하십시오.
  4. 수술용 가위를 사용하여 집게와 매듭 사이에 묶인 탯줄을 자릅니다(그림 1, 1단계).
  5. 식염수로 헹구어 표면의 오염된 혈전을 제거하고 20mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 멸균 50mL 플라스틱 튜브로 즉시 옮깁니다.
    참고: 이송 중에는 어떠한 항생제도 사용되지 않았습니다.
  6. 튜브를 밀봉합니다. 폴리스티렌 상자에 넣어 얼음 위에 놓고 실험실로 운반하기 전에 4°C에서 보관합니다.
    알림: 수집 후 4시간 이내에 코드를 절개하십시오.

2. 탯줄에서 Wharton's jelly의 격리

  1. 아래 단계에 따라 탯줄을 처리하십시오.
    1. 수술 기구, 무균 포장된 90mm 접시, 1000μL 피펫, 멸균 PBS, 75% 에탄올 용액 및 무이종 인간 MSC 배양 배지가 들어 있는 멸균 트레이를 준비합니다.
      알림: 톱니가 있는 집게와 모기 clamps를 사용하면 미끄러운 코드를 효율적으로 처리할 수 있습니다.
    2. 생물 안전 캐비닛 내부에 항목을 배치하기 전에 필요한 항목과 작업 영역을 표면으로 오염 제거합니다.
      알림: 작업을 시작하기 전에 몇 분 동안 작업 영역 공기가 제거되도록 하십시오.
    3. 튜브 표면을 소독하고 샘플을 생물 안전 캐비닛의 페트리 접시에 제거합니다. 매듭이 있는 샘플을 75% 에탄올에 30초 동안 담근 다음 새 페트리 접시에서 멸균 PBS로 여러 번 헹굽니다.
      알림: 75% 에탄올에 담그기 전에 코드를 결찰해야 하며, 코드를 손상 없이 완전히 소독하려면 담그는 시간을 30초에서 1분으로 제한해야 합니다.
    4. 매듭을 자르고 두 매듭 사이의 코드를 외과 용 가위와 집게로 가로 가로로 약 2cm 길이의 짧은 조각으로 자릅니다.
      알림: 매듭이 있는 코드의 끝은 폐기해야 합니다. UC의 길이는 너무 길거나 짧아서는 안 됩니다. 두 조건 모두 작업의 난이도를 높일 수 있습니다.
    5. 탯줄의 다른 쪽 끝에서 나오는 액체가 완전히 투명해질 때까지 1000μL 피펫을 사용하여 PBS로 정맥(더 큰 혈관)을 관류합니다19.
  2. 탯줄을 절개합니다.
    1. 이미 자른 조각 중 하나를 새 페트리 접시에 옮깁니다.
      알림: 두 개의 동맥과 하나의 정맥은 단면8 에 눈에 띄게 노출되어야 합니다(그림 2B).
    2. 작업 내내 코드가 젖은 상태로 유지하기 위해 적절한 양의 PBS를 추가하십시오.
    3. 집게로 탯줄을 잡고 모기 클램프를 사용하여 주요 축을 따라 동맥을 빼냅니다.
      알림: 동맥벽은 탄성이 높으므로 동맥이 찢어진 경우 탯줄의 다른 쪽 끝에서 잡아당기십시오.
    4. 집게의 한쪽 날을 배꼽 정맥에 삽입한 다음 단단히 조여서 집게가 두꺼운 쪽에 고정되도록 두꺼운 면이 위를 향하도록 코드를 수평으로 고정합니다.
    5. 메스를 사용하여 겸자의 다른 쪽 날 가장자리를 따라 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 양수 상피 층을 선형 절개합니다(그림 3).
      알림: 가능한 한 적은 WJ를 절단하여 Wharton's 젤리의 무결성을 보존하십시오.
    6. 절단 간격의 한쪽 모서리에서 시작합니다. 톱니형 클램프로 양수 상피의 모서리를 들어 올리고 상피의 내부 표면을 따라 각막 가위로 수평으로 조금 더 자릅니다.
      1. Wharton's jelly와 양수 상피를 클램프로 분리하고 UC의 한쪽 끝 전체 원으로 점차 확장합니다. 상피층을 세로로 벗겨냅니다(그림 3).
        참고: Wharton's jelly는 조밀한 양수 상피8로 둘러싸인 점액 결합 조직입니다. 전체 작업은 원활해야 하지만 박리 중에 어려움이 있는 경우 모기 클램프를 사용하여 둔한 해부에 사용할 수 있습니다.
    7. 겸자의 양쪽 블레이드를 정맥 내부에 삽입하고 WJ의 일부를 클램프 한 다음 뒤집어 배꼽 정맥의 상피를 노출시킵니다(그림 3).
    8. 내부 장력으로 인해 정맥의 상피와 혈관 주위 WJ 사이에 분리가 생성되므로 정맥의 상피를 쉽게 벗겨냅니다(그림 3).
  3. 기존의 비교 방법을 사용하여 UC를 절개합니다20.
    1. 이미 절단된 다른 s를 선택하십시오.amp이전 코드와 거의 같은 무게의 le를 새 Petri 접시로 옮깁니다.
    2. 탯줄을 따라 세로로 자르고 UC를 펴서 혈관과 WJ를 노출시킵니다.
    3. 탯줄 정맥과 두 개의 동맥을 제거하고 가위와 메스로 내피층에서 WJ를 제거합니다.

3. UC-MSC의 격리 및 배양

  1. 수집된 WJ를 미리 라벨이 붙은 90mm 페트리 접시에 넣고 가위와 집게로 1-3mm 조각으로 자릅니다.
  2. 바닥에 캡이 있는 접시를 뒤집고 5% CO2 인큐베이터에 37분 동안 30분 동안 넣어 조각과 플라스틱 표면 사이의 부착을 강화합니다.
  3. 접시를 뒤집고 추가 배양을 위해 적절한 양의 인간 MSC 배양 배지를 부드럽게 추가합니다.
    알림: 가장 낮은 속도를 사용하여 조각이 여전히 부착되어 있는지 확인하십시오.
  4. 인간 MSC 배양 배지를 3일마다 교체하십시오. 배지의 2/3를 교환하고 처음 7일 동안은 2일마다 섬유질 세포의 증식 모습을 관찰하고, 전체 배지를 교체하고, 그 이후에는 매일 관찰합니다.
    알림: 처음 7일 동안은 페트리 접시를 움직이지 마십시오. 섬유아세포 유사 세포의 뚜렷한 성장은 약 4일 만에 관찰되었습니다.
  5. 합류가 80%에 도달할 때까지의 서브컬처.
    참고: 이 단계는 7-10일이 걸립니다.
    1. PBS, 0.25% 트립신 및 이종이 없는 인간 MSC 배양 배지를 수조에서 37°C로 사전 예열합니다.
    2. 피펫으로 상층액을 흡입한 후 PBS로 헹구고 페트리 접시를 두드려 세포가 제거될 때까지 예열된 0.25% 트립신으로 세포를 분리합니다.
    3. 예열된 MSC 배양액을 4:1의 비율로 혼합하여 트립신을 비활성화하고, 세포 현탁액을 수집한 후 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
      참고: 이러한 셀은 통로 0(P0)으로 간주됩니다.
    4. 피펫으로 상층액을 버리고, 인간 MSC 배양 배지에서 세포를 재현탁하고, 증식을 위해 1x104 cells/cm2 의 파종 밀도로 새로운 페트리 접시에 접종합니다.
  6. 혈구계를 사용하여 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 통로에서 증폭 후 두 가지 방법의 총 세포 수를 계산합니다. 첫 번째, 세 번째 및 다섯 번째 단락에서 현미경으로 세포 형태를 결정합니다.
    참고: 이러한 셀의 형태는 P0 셀과 유사해야 합니다.
  7. 유세포 분석 및 기타 실험을 위해 다섯 번째 통로에 있는 세포를 사용합니다.

4. 유세포분석에 의한 세포 표면 마커의 발현

  1. 0.25% 트립신으로 통로 5(P5) 세포를 분리하고 세포 염색 완충액으로 세포를 세척한 다음 4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리합니다. 세포 염색 완충액으로 펠릿을 각각 100μL까지 재현탁시킵니다.
  2. 각 튜브에 라벨을 붙이고 알로피코시아닌(APC), 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC) 또는 피코에리트린(PE)과 접합된 적절한 양의 항체를 추가합니다: CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE는 제조업체의 지침21에 따라 사용됩니다. 실온의 어두운 곳에서 15-20분 동안 배양합니다.
  3. 염색된 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 피펫으로 상층액을 흡인하고 세포 염색 완충액으로 한 번 세척합니다.
  4. 300 μL의 세포 염색 완충액으로 세포의 원심분리 및 재현탁을 반복합니다.
  5. 유세포 분석기를 통해 세포를 실행하고 제조업체의 지침에 따라 항체 염색 세포를 분석합니다.

5. 세포 계수 방법에 의한 세포 성장 곡선 결정

  1. 두 가지 방법을 사용하여 P5 세포의 단일 세포 현탁액을 인간 MSC 배양 배지에 희석하여 준비합니다.
  2. 24웰 플레이트에 웰당 8,000개의 세포를 파종하고 각 분석법의 총 21개 웰을 파종합니다.
    알림: 파종하기 전에 피펫으로 불어서 흡입하여 세포를 부드럽게 혼합합니다.
  3. 파종 후 24시간 후에 3개의 웰에서 세포를 수확합니다. 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행하여 평균값을 계산합니다.
    알림: 셀 카운팅 전에 플레이트를 흔듭니다. 세포 응집체의 형성을 방지하기 위해 진탕 기간을 연장할 수 있습니다.
  4. 총 24일 동안 7시간마다 셀 카운팅을 반복합니다. X축에 시간(d)을 사용하고 Y축에 세포 수(x104/mL)를 사용하여 성장 곡선을 플로팅합니다.

결과

UC-MSC를 수집 및 배양하는 절차와 후속 분석은 그림 1에 요약되어 있습니다. UC는 독특한 방법을 사용하여 여러 섹션으로 깔끔하게 해부되었습니다. 주요 절차의 특정 작동 다이어그램은 그림 2에 설명되어 있습니다. 외식물 배양에서 얻은 세포의 성장은 정기적으로 모니터링되고 기록되었습니다. 부착성 방추형 세포는 외식물을 배양한 후 약 4일 후에 관찰되었으며 점점 더 소용돌이 모양으로 기어 들어갔습니다. 이들 세포는 또한 P0로 확인되었으며, 증식 및 패시징 동안 균일한 크기와 형태를 유지하면서 후속 패시징을 위해 계속 증식했습니다. 기존 방법과 현재 방법은 세포 크기와 형태 측면에서 무시할 수 있는 차이를 보였습니다(그림 3).

기존의 절개 방법은 혈관과 UC의 내부 상피에서 WJ를 긁어내는 것입니다. WJ 수율은 중량 조정에 의해 두 방법 간에 상당한 차이를 나타냈습니다. WJ의 수율은 2cm 코드(2.4g ± 0.2g)에서 WJ의 중량 백분율을 측정하여 계산할 수 있습니다. 현재 방법과 기존 방법 간의 WJ 수율 비율을 비교한 결과, 새로운 접근 방식을 사용하여 WJ 수율이 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 4A). UC의 등가 중량에서 두 방법으로 동시에 수확한 WJ-MSC의 총량을 계산하여 추가 분석한 결과, 통로 수가 증가함에 따라 세포 양에서 뚜렷한 차이가 있음을 보여주었습니다(그림 4B). 성장 곡선은 새로운 방법에서 MSC의 증식 속도가 2일 후 동일한 접종 밀도에서 기존 방법보다 훨씬 더 높았다는 것을 나타냅니다(그림 4C). 이러한 실험은 동일한 재료의 효율적인 공급을 증가시키는 효율적인 방법을 허용하는 현재 방법의 장점을 보여줍니다.

국제세포유전자치료학회(International Society for Cell and Gene Therapy, ISCT) 가이드라인의 MSC 정의에 대한 최소 기준에 따라, MSC의 면역표현형은 CD105, CD44, CD90, CD73(95% 이상)의 양성 발현을 보이는 반면, CD45, CD19, CD34, CD11b 및 HLA-DR(2% 미만)은 없습니다22. WJ 유래 MSC는 정량적 유세포 분석을 통해 조사되었습니다(그림 5). 두 방법 모두에 의해 분리된 세포는 표면 항원 CD105, CD44, CD90 및 CD73(모두 99% 이상)에 대해 매우 양성이었으며, 표면 분자 CD45, CD19, CD34, CD11b 및 HLA-DR의 발현은 검출 가능한 수준 이하로 발현되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 세포 표면 마커의 결과를 기반으로 부착 세포를 MSC로 미세하게 간주할 수 있으며 식별 및 순도를 보장할 수 있습니다.

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그림 1: 탯줄에서 WJ-MSC의 해부 및 분리에 대한 개략도. 1단계: 신생아에서 인간 탯줄 샘플을 채취하여 식염수로 헹구고 정맥을 관류합니다. 그런 다음 코드를 2cm 조각으로 자릅니다. 2단계: Pure Wharton's Jelly(WJ)는 동맥, 양수 상피 및 정맥 상피를 분리하는 현재 방법을 사용하여 얻습니다. 전통적인 방법도 비교에 사용됩니다. 그에 따라 탯줄을 절개합니다. 3 단계 : 절개 된 WJ를 1-3mm 조각으로 자르고 접시를 인큐베이터에 30 분 동안 거꾸로 놓아 조각과 플라스틱 표면 사이의 부착을 강화합니다. 그런 다음 WJ 조각을 배양하고 80% 합류점에 도달할 때까지 1 x 104 cells/cm2 의 파종 밀도로 통과시킵니다. 4단계: 유세포 분석은 중간엽 줄기 세포(MSC) 표면 마커를 분석하여 P5 세포를 특성화하는 데 사용됩니다. 5단계: 세포의 증식 능력은 세포 계수 방법을 사용하여 세포 성장 곡선을 그려서 결정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 탯줄의 해부학적 구조와 해부의 개략도. (A) 동맥(A), 정맥(V), Wharton's jelly(WJ)를 강조하는 UC의 단면과 후속 해부는 UC를 다른 구획으로 분리합니다. (B) 양막 상피층을 제거하는 개략도. 절개는 양수 상피의 점선을 따라 이루어지며 탯줄의 측면 모서리에서 시작하여 상피를 분리합니다. (C) 정맥 상피를 제거하는 개략적인 시연. 코드를 뒤집으면(화살표 방향은 힘의 방향을 나타냄) 정맥 상피가 제거를 위해 노출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 1차 배양 및 통로 WJ-MSC의 형태학적 특징. 외식물에서 구별되는 섬유아세포 성장은 약 4일(화살표로 표시)에 관찰할 수 있으며 점점 더 소용돌이와 같은 성장 패턴을 나타냅니다. 외식물은 제거되고 하위 배양되었습니다. 분리된 세포는 시각화된 크기 및 형태와 관련하여 균질했습니다. 두 방법 사이의 세포의 크기와 형태에서 미미한 차이가 관찰되었습니다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: WJ 수율과 배양된 MSC의 성장 특성에 대한 그래픽 비교 분석. (A) 두 방법 모두에 대해 초기 중량이 2.4g ± 0.2g인 2cm UC를 사용한 WJ 수율 비교. WJ 수율 = (WJ의 무게) / (처리되지 않은 코드의 초기 무게. WJ 수율의 비율(%) = (WJ 수율) / (현재 방법의 평균 WJ 수율) × 100. (B) 두 가지 방법에 의한 동일한 조건에서의 배양 및 통과 후 세포 계수 비교. (C) 두 방법 모두에서 P5 세포의 성장 곡선. 모든 실험에는 3개의 생물학적 복제가 포함되었으며 통계적 차이는 양방향 분산 분석법(***p < 0.001)으로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 유세포분석으로 분석한 MSC의 세포 표면 발현. 기존 방법과 현재 방법으로 수집된 P5 세포는 유세포 분석 분석을 거칩니다. 표면 항원 CD44, CD105, CD90 및 CD73은 매우 양성(모두 99% 이상)인 반면, CD45, CD19, CD34, CD11b 및 HLA-DR 표면 분자의 발현은 검출 한계 미만이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

MSC는 재생 의학에 심오한 영향을 미치는 역동적인 연구 분야입니다22. 그들의 독특한 특성은 과학적 탐구의 초점이 되며 광범위한 질병 및 부상 치료에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다7. WJ-MSC는 MSC의 별개의 부분집합이며, 이는 혈관간 상피와 양막 상피(23) 사이에 위치한 UC 내의 젤라틴 결합 조직에서 얻을 수 있습니다. MSC의 임상적 응용은 충분한 세포 수를 확보하는 데 있다24. 그러나, 통로 수가 증가함에 따라, 세포는 어느 정도의 노화 현상을 보이기 시작했고, MSCs의 증식 능력은 P524 이후 점차 감소하였다. 따라서 MSC 수율을 향상시키기 위한 방법을 최적화하는 것이 필수적입니다.

WJ-MSC를 격리하는 가장 효율적인 방법은 무결성을 유지하면서 전체 WJ를 해부하는 것입니다6. 연구에 따르면 탯줄 경계 영역의 이러한 경계 세포는 혈관 간 WJ-MSC보다 이동 특성이 더 높고 증식률이 더 높습니다23. 그러나, WJ를 해부하는 영역과 방법은 표준화되지 않았으며, WJ-MSC 내의 줄기세포 집단이 동일한 품질을 공유하는지 여부는 여전히 불분명하다3.

이전 연구에서는 탯줄의 다양한 구획에서 유래한 WJ-MSC의 특성에 상당한 차이가 있는 것으로 나타났으며, 세포는 양수 표면 가까이에 위치하여 향상된 증식 능력을 나타낸다3. UC를 절개하고 WJ-MSC를 분리하는 현재의 독특한 방법은 라이닝 WJ의 손실과 세포 손상을 모두 줄여 세포 수율과 생존력을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 UC를 거의 손상되지 않은 WJ로 쉽게 처리할 수 있는 방법을 보여줍니다. 프로토콜의 주요 단계는 박리와 둔부 절개를 통해 상피층을 제거하는 것입니다. 혁신 단계는 모기 클램프로 상피층을 세로로 벗겨내는 것입니다. 이러한 접근법은 가위(25)를 이용한 종래의 날카로운 해부에 의해 야기되는 인접한 세포 손상을 감소시키는데 효과적이다.

정맥의 내피는 연약하고 제거하기 어렵습니다. 탯줄에서 양수 상피를 제거한 후 탯줄을 정맥을 통해 뒤집어 내피를 노출시킵니다. 그런 다음 WJ에 의해 생성된 내부 장력을 사용하여 정맥의 내피를 벗겨냄으로써 후속 세포 배양 과정에서 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 간섭의 간섭을 최소화합니다.

외식물 배양법은 사용 가능한 다른 방법에 비해 수율이 높기 때문에 채택된다18. 부착되지 않은 세포는 인간 MSC 배양 배지의 교환을 통해 점차적으로 제거되며, 그 결과 세포(26)가 손실됩니다. 플라스틱에 부착되지 않는 외식물은 이전 경험에서 세포 성장을 방해할 수 있습니다. 인큐베이터의 내부 온도와 외부 온도 변화로 인해 조직에서 방출되는 수증기의 영향을 고려해야 합니다. 페트리 접시의 건조 상태를 유지하기 위해 배양 중에 뚜껑이 바닥에 있는 상태에서 30분 동안 접시를 거꾸로 뒤집는 혁신적인 단계가 구현되었습니다. 이러한 접시의 반전은 조직과 페트리 접시 표면 사이의 접촉에 수증기가 응결되는 것을 방지했으며, 이는 차례로 엑소좀이 플라스틱 표면에 더 잘 부착되어 세포 성장을 개선할 수 있도록 했습니다.

현재의 방법은 얻어진 WJ의 중량 퍼센트와 배양 및 통과된 MSC의 양을 측정함으로써 종래의 해부 방법과 비교된다; WJ의 상당히 높은 수율과 수확된 MSC의 추가 수량이 새로운 방법에 의해 나타났습니다. 이러한 각 구획에서 줄기세포 집단을 분리하는 모든 프로토콜은 다른 구획에서 세포 오염의 위험을 수반하지만, 그 결과는 중간엽 마커의 높은 발현(모두 99% 이상)과 조혈 및 내피 마커의 최소 검출을 특징으로 하는 분리된 MSC의 순도를 입증했습니다(데이터 표시 안 됨). 그 결과 WJ-MSC가 순수하고 ISCT 지침21에 따라 다양한 응용 분야에 적합하다는 것이 입증되었습니다. 배양된 MSC는 단기간에 섬유아세포와 유사한 세포를 나타냈고, 세포는 점점 더 소용돌이 모양의 세포로 형성되어 큰 증식 잠재력과 이동 특성을 보여주었습니다.

이 연구에서 설명한 프로토콜에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 양수 상피의 분리에서 알 수 있듯이 작업자에게 필요한 숙련도가 높습니다. 이는 연구 또는 임상 응용 분야에서 널리 채택되는 것을 방해할 수 있습니다. 둘째, 프로토콜은 해부 중 수동 조작에 크게 의존하며, 이로 인해 실험 또는 작업자 간의 불일치가 발생할 수 있습니다. 해부 과정의 표준화는 프로토콜(25)의 신뢰성과 재현성을 향상시킬 것이다. 또한 기존 방법과의 다른 비교가 부족하여 답변되지 않은 질문이 남아 있습니다.

결론적으로, 현재의 방법은 양수 상피 및 혈관에서 온전한 WJ를 분리하는 효율적인 방법을 제공하여 혈관 주위 및 양수 하 Wharton's 젤리를 포함하는 수확을 얻을 수 있습니다. 역배양 단계의 도입은 MSC 부착 개선에 더욱 기여합니다. 기존 방법과의 비교 분석은 더 높은 WJ 수율을 얻고 더 나은 증식 능력을 가진 더 많은 MSC를 수확하는 측면에서 제안된 프로토콜의 상당한 이점을 보여줍니다. 이 발견은 또한 세포 표면 마커 발현의 뚜렷한 패턴으로 나타나는 분리된 MSC의 순도를 강조합니다. 이 방법은 MSC 수율과 증식 능력을 향상시켜 MSC 생산을 증대시키는 비용 효율적인 방법을 제공할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82172107), 중국 광둥성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Guangdongprovince, China (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), 선전의학연구기금(Shenzhen Medical Research Fund, SMRF. D2301015), 선전시 과학기술혁신위원회(JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031), 룽강구 경제기술발전특별기금(LGKCYLWS2022007).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
APC anti-human CD44 항체 바이오레전드 
24-웰 세포 배양 플레이트Thermo Scientific142475
APC anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) 항체 바이오레전드 
APC 마우스 IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) 항체Biolegend 
400122 오토클레이브히라야마HVE-50
자동 세포 카운터CountstarFL-CD
BAMBANKER 동결 보존 솔루션Wako302-14681
세포 염색 버퍼Biolegend 
원심 분리기Eppendorf5424R
클린 벤치Shanghai ZhiChengC1112B
CO2 인큐베이터Thermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
전기 온도 조절 블라스트 오븐Shanghai JingHongDHG-9423A
FITC anti-human CD105 항체 바이오레전드 
323204 FITC anti-human CD90 (Thy1) 항체 바이오레전드 
FITC 마우스 IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) 항체Biolegend 400110
유세포 분석BeckmanCytoFLEX
혈구계Superior Marienfeld640410
세포 내 염색 투과화 세척 버퍼 (10×) 바이오레전드 
역 생물학 현미경ZEISSAxio Vert. A1
액체 질소 저장 탱크Thermo ScientificCY50935-70
일반 식염수 (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anti-human CD11b 항체Biolegend 
PE anti-human CD19 항체 바이오레전드 
PE 항-인간 CD34 항체Biolegend 
PE anti-human CD45 항체Biolegend 368510
PE anti-human HLA-DR 항체 바이오레전드 
PE 마우스 IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) 항체Biolegend 
PE 마우스 IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) 항체Biolegend 
정밀 전자 저울SatoriusPRACTUM313-1CN
눈송이 제빙기ZIEGRAZBE 30-10
멸균 50mL 플라스틱 튜브Greniner227270
온도 조절 수조Shanghai YiHengHWS12
Trypsin 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-Advanced헬리오스 
초순수 및 순수 정화 시스템Milli-QMilli-Q 참조
Xeno-Free 인간 MSC 배양 매체FUKOKU 
338806344006420201328108421002393112392506343606307606400114400214HPCFDCGL50T2011301

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