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방법 논문

꼬인 고환의 고정: 고환의 허혈-재관류 손상의 쥐 모델

654 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67181

⸱

2025년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Ladoke Akintola University of Technology, 2Department of Anaesthesia, Afe Babalola University, 3Department of Pharmacology, Bowen University, 4Reproductive Biology and Toxicology Research Laboratory, Oasis of Grace Hospital

이 논문에서

요약

이 기사에서는 고환에서 허혈-재관류 손상의 병리학적 메커니즘 연구에서 재현 가능한 고환 비틀림 모델을 생성하기 위한 고환 허혈/재관류 모델을 생성하기 위한 단계별 절차를 설명합니다.

초록

허혈-재관류(IR) 손상은 고환 손상을 포함한 여러 병리와 관련이 있습니다. 허혈을 달성하기 위해 정자를 비틀는 고환 IR의 초기 동물 모델은 모델을 일관되게 재현할 수 없는 많은 기술적 어려움으로 가득 차 있습니다. 따라서 우리는 쉽게 복제할 수 있는 쥐 모델에서 고환 IR을 유도하는 간단한 방법을 제시합니다.

이 방법은 고환에서 gubernaculum을 분리하고, 음낭 주머니를 만들고, 고환을 아래쪽 극에서 시계 방향으로 720° 비틀고, 고환을 음낭 기저부에 고정하는 것입니다. 이 모델은 고환 혈관을 효과적으로 수축시키고 고환 허혈을 유도합니다. 허혈 1시간 후 고정 스티치를 제거하고 고환을 풀어줍니다. 코드와 그에 수반되는 용기를 검사하여 개통성을 확인합니다. IR 후 고환을 수집하고 조직병리학적 평가를 위해 절편합니다.

고환 조직학은 국소 출혈성 병변, 혈관 울혈, 간질 공간 확대 및 염증 세포의 침윤에 대해 검사되었습니다. 또한, 산화 스트레스(말론디알데히드, 환원된 글루타티온, 카탈라아제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제), 염증(MPO, TNF-α, IL-1β) 및 세포사멸(카스파제 3 발현)의 마커를 분석했습니다. 이 방법은 고환 IR 손상의 병태생리학을 연구하기 위한 더 간단하고 쉽게 재현 가능한 모델을 제공합니다. 더욱이 이 모델은 고환 IR 손상 관리에서 잠재적인 치료제를 탐색할 수 있는 창을 열어줍니다.

서론

고환 비틀림(TT)은 정자와 수반되는 혈관이 뒤틀려 고환 허혈을 초래하는 급성 비뇨기과 응급 상황입니다. 심한 복통, 메스꺼움, 구토가 특징입니다1. 허혈은 적시에 비틀림으로 해결되지 않으면 해당 고환의 괴사 및 손실을 초래합니다2. 그러나 고환으로의 혈류를 풀고 회복시켜 적시에 외과적 개입을 하면 허혈-재관류 손상(IRI)이 발생하여 고환과 그 기능의 조직학적 및 생화학적 파괴가 발생합니다 3,4.

TT의 동물 모델은 TT가 괴사로 진행되는 것을 방지하려는 시도에서 항상 발생하는 IRI의 메커니즘을 조사하기 위해 광범위하게 사용되었습니다 5,6. TT에는 정자 코드 클램핑과 코드 트위스트의 두 가지 모델이 있습니다. 둘 다 멸균 조건과 적절한 마취 하에 수행됩니다. 사용되는 일반적인 마취제에는 케타민 단독 또는 자일라진과 병용하는 것이 포함됩니다7. 일반적으로 사용되는 다른 마취제는 우레탄과 티오펜탈 나트륨이며 일반적으로 복강 내 투여됩니다7. 그럼에도 불구하고 두 모델 모두 한계가 있습니다.

미세혈관 클립 8,9를 사용하여 고환 동맥을 직접 클램핑하는 것이 클램프를 제거하여 재관류를 유도하기 전에 결정된 시간(보통 1시간) 동안 허혈을 유도하는 수단으로 사용되었지만, 이 방법은 고환10의 비틀림의 임상적 외관을 정확하게 모방하지 않습니다. 또한, 허혈을 달성하기 위한 정자의 외과적 비틀림11,12이 임상 양상을 더 잘 대표하지만, 주제에 대한 기사의 방법 섹션에서 접한 짧은 설명으로 해결되지 않은 많은 기술적 어려움으로 가득 차 있습니다.

종종 직면하는 명백한 기술적 어려움은 허혈 기간 동안 비틀림이 풀리는 것을 방지하기 위해 고환을 음낭 바닥에 되돌리고 고정하는 것이었습니다. 일부 연구자들은 고환이 음낭벽에 고정되는 것을 언급하지 않는 반면13,14, 다른 연구자들은 백막을 꿰매어 고환을 음낭벽에 고정하도록 처방합니다 15,16,17. 고환을 음낭 벽에 고정하는 과정에 대한 설명은 대체로 매우 간단하고 명시적이지 않았습니다 7,18. 따라서 이전 기사의 방법 섹션에서 설명한 절차를 복제하려는 시도는 백막에 천공하여 고환이 손상되고 과도한 압력을 가하지 않고는 고환을 음낭으로 되돌릴 수 없는 것과 같은 심각한 실질적인 어려움에 직면했습니다. 더욱이, 실질적으로 비틀림을 유도한 후 고환을 음낭으로 되돌리는 것은 실험적 TT를 외과적으로 유도하려는 시도에서 주요 과제였습니다. 따라서 이러한 기술적 어려움으로 인해 서로 다른 조사자 간에 모델을 일관되게 재현할 수 없게 되었습니다.

따라서 쥐에서 TT 모델을 생성하기 위해 이 연구에서 설명한 절차는 이전 모델에서 직면한 기술적 어려움을 식별하고 이에 대한 솔루션을 제공합니다. 이 모델은 쉽게 재현할 수 있고 인간의 경험을 모방하는 간단한 기술을 제공합니다. 따라서 이 모델은 IRI에서 발생하는 병리학적 메커니즘 연구에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 출발점입니다.

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프로토콜

이 연구는 나이지리아 오요 주 오그보모소에 있는 라도케 아킨톨라 공과대학교 기초 의학 학부 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다(ERCFBMSLAUTECH:033/05/2024). 이 연구에는 10-12주, 체중 180 ± 10g의 수컷 알비노 Wistar 쥐 20마리가 사용되었습니다. 그들은 2주 동안 적응한 다음 가짜 수술군(SO) 또는 비틀림/비틀림 그룹(T/D)(그룹당 n = 10마리의 쥐)에 무작위로 할당되었습니다. SO 쥐는 T/D 쥐와 마찬가지로 유사한 수술을 받았지만 T/D를 유도하기 위해 고환이 뒤틀리거나 고정되지 않았습니다.

1. 수술 전 준비 및 마취

  1. 동물(SO 및 T/D 그룹)을 수술 전 12시간 금식으로 하룻밤 동안 노출시킵니다.
  2. 수술 당일 케타민 50mg/kg과 자일라진 10mg/kg의 조합으로 동물(SO 및 T/D군)을 복강내 마취하고, 발바닥 압력과 수염의 가벼운 자극에 대한 동물의 반응 부족을 관찰하여 마취의 적절성과 깊이를 확인합니다.
  3. 동물의 왼쪽 음낭, 회음부 및 사타구니 부위(SO 및 T/D 그룹)를 면도한 다음 메틸화 스피릿과 포비돈 방부액으로 세척합니다.

2. 고환 허혈 유도

  1. 고환의 동원
    1. 복부에 부드럽게 아래쪽 압력을 가하여 왼쪽 고환(SO 및 T/D 그룹 모두)을 음낭으로 밀어 넣습니다.
    2. 왼쪽 고환(SO 및 T/D 그룹 모두)을 단단히 잡고 ~1.5cm 길이의 높은 음낭 절개를 하여 질막(TV) 내의 기본 고환을 노출시킵니다.
    3. 고환의 아래쪽 극(SO 및 T/D 그룹 모두), 특히 부고환 꼬리를 찾아 작은 해부 가위로 위에 있는 TV에 흠집을 만듭니다.
    4. 가위를 TV 아래에 놓고 약간 넓혀 TV의 두 가장자리를 보인 다음 구부러진 모기 동맥 겸자로 양쪽의 가장자리를 잡습니다. 이는 SO 및 T/D 그룹 모두에 적용됩니다.
      참고: 이 단계는 비틀림 유도 후 고환을 음낭으로 쉽게 되돌릴 수 있는 조직면을 설정하므로 매우 중요합니다.
    5. TV의 절개 부위(SO 및 T/D 그룹 모두)를 근위부로 ~0.5cm 확장합니다.
    6. 하복부에 부드러운 압력을 가하여 고환(SO 및 T/D 그룹 모두)을 외부화합니다.
    7. T/D 그룹의 경우에만 고환을 동원하고 고환을 식별한 다음 절단하여 음낭 바닥에서 고환을 분리합니다.
      알림: 이 단계는 고환을 비틀 수 있으므로 중요합니다. gubernaculum은 고환의 꼬리 끝에서 사타구니관까지 확장되고 손잡이 모양의 확장으로 끝나는 인대로 식별됩니다19,20.
    8. (T/D 동물의) 고환의 아래쪽 극(부고환이 있는 곳)을 잡고 시계 방향으로 720° 비틀고 시간을 기록합니다(허혈 시작 표시).
  2. 허혈성 고환 고정
    1. 꼬인 고환(T/D 동물의)을 제자리에 고정하고 긴 해부 가위를 TV 아래의 조직면을 따라 음낭으로 아래로 밀어 주머니를 만들어 음낭을 만듭니다.
    2. T/D 동물의 경우만 가위를 제자리에 고정하고 앞서 만든 음낭 주머니의 가장 낮은 지점 바깥쪽에서 크롬 2-0 봉합사를 사용하여 앵커링 스티치를 삽입하여 앵커링 스티치를 삽입합니다. 고환의 아래쪽 극에 있는 결합 조직에 스티치를 삽입하고 다시 주머니 안으로 내려와 초기 진입점 옆 바깥쪽으로 가져옵니다.
    3. 비틀린 고환(T/D 동물의)을 음낭으로 당기고 봉합사의 양쪽 끝을 부드럽게 아래쪽으로 견인하여 고환을 음낭 기저부에 고정한 다음 봉합사의 양쪽 끝을 음낭 피부에 단단히 묶습니다.
    4. 크롬 2-0을 사용하여 연속 지갑 끈 봉합사로 음낭 절개 부위 (SO 및 T / D 동물의)를 봉합합니다.
      참고: 재관류를 수행할 때 쉽게 제거할 수 있도록 권장됩니다.

3. 생화학적 및 조직병리학적 조사

참고: 생화학적 분석 및 조직병리학적 검사를 수행하는 조사자가 연구 프로토콜에 대해 눈이 멀었는지 확인하십시오.

  1. 실험 기간이 끝나면 동물을 밤새 12시간 금식시키고 안락사시킵니다(케타민 50mg/kg 및 자일라진 ip 10mg/kg).
  2. 부착 구조에서 왼쪽 고환을 제거하고 분리합니다.
  3. 각 그룹의 고환 조직 10개 중 5개를 균질화 완충액(PBS에 용해된 0.25 M 자당, 0.5 mM EDTA, 5 mM 히스티딘 및 PI, pH 7.4)에 균질화하고 나머지 5개의 고환 조직을 조직학적 평가를 위해 Bouin 용액에 고정합니다.
  4. 균질액을 10,000 × g 에서 4°C에서 15분 동안 냉간 원심분리기에서 회전시켜 생화학적 분석을 위한 상청액을 얻습니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 표준 실험실 키트를 사용하여 효소 비색 분석으로 고환 크산틴 산화효소(XO) 활성을 결정합니다.
  6. 비색법에 의한 고환 말론디알데히드(MDA) 함량 분석21.
    1. 지질 과산화 중에 생성되는 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS)을 이용한 지질 과산화 농도 측정
      참고: 이 방법은 2-티오바르비투르산(TBA)과 지질 과산화의 최종 생성물인 말론디알데히드 사이의 반응을 기반으로 합니다. 산성 pH에서 가열하면 532nm에서 흡광도가 측정되는 분홍색 발색원 복합체([TBS] 2-말론디알데히드 부가물)가 생성됩니다.
      1. 500μL의 트리클로로아세트산(TCA)으로 200μL의 시료를 탈단백하고 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리합니다.
      2. 상청액 0.1mL에 0.75% TBA 1mL를 첨가하고 100°C에서 20분 동안 수조에서 끓인 후 얼음물로 식힌다.
      3. 블랭크에 대해 분광 광도계를 사용하여 532nm에서 샘플/표준물질의 흡광도를 읽습니다. 표준 곡선에서 외삽하여 생성된 TBARS의 농도를 결정합니다.
  7. 이전에 보고된 바와 같이 확립된 프로토콜을 사용하여 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)22, 카탈라아제23 및 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)24 의 고환 활성을 분석합니다.
    1. SOD 결정
      1. 시료 1mL를 증류수 9mL에 희석하여 1/10 희석액을 만듭니다. 분광 광도계 평형을 위해 이 희석된 샘플 0.2mL를 0.05M 탄산염 완충액(pH 10.2) 2.5mL에 첨가합니다.
      2. 혼합물에 새로 준비된 0.3mM 아드레날린 0.3mL를 첨가하여 반응을 시작하고 반전으로 빠르게 혼합합니다.
      3. 참조 큐벳에 완충액 2.5mL, 기질(아드레날린) 0.3mL 및 물 0.2mL를 추가합니다.
      4. 480nm에서 150초 동안 30초마다 흡광도의 증가를 모니터링합니다.
    2. 카탈라아제 결정
      1. 고환 균질액의 상청액 1mL를 희석수 19mL와 혼합하여 샘플을 1:29로 희석합니다.
      2. 10mL 평평한 바닥 플라스크에 H2O2 용액 4mL와 인산염 완충액 5mL를 취합니다.
      3. 적절하게 희석된 효소 제제 1mL(단계 4.6.3.1)를 반응 혼합물(단계 4.6.3.2)과 37°C에서 부드럽게 소용돌이치는 동작으로 혼합합니다. 반응 혼합물 1mL를 빼내고 60초 간격으로 중크롬산염/아세트산 시약 2mL에 첨가합니다.
      4. 653nm에서의 흡광도를 인증된 카탈라아제 표준물질의 흡광도와 비교하여 샘플의 카탈라아제 수준을 결정합니다.
    3. GPx 분석
      1. 샘플을 포함하는 반응 혼합물을 37°C에서 3분 동안 배양하고, 0.5mL의 10% 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하고, 3,000rpm에서 5분 동안 원심분리한다.
      2. 상청액 1mL에 인산염 완충액 2mL와 5'-5'-디티오비스-(2-디니트로벤조산(DTNB) 용액 1mL를 첨가하고, 블랭크에 대해 412nm에서 흡광도를 판독한다.
      3. 표준 곡선을 플로팅하고 곡선에서 나머지 GSH의 농도를 외삽하여 글루타티온 퍼옥시다제 활성을 결정합니다.
  8. MPO 및 종양 괴사 인자-알파(TNFα) 분석
    참고: 이 분석은 과산화수소의 존재 하에서 구아이아콜을 산화된 구아이아콜로 산화시키는 것을 포함합니다. 산화된 형태의 구아이아콜은 갈색을 띠며 470nm에서 광도계로 측정됩니다.
    1. 표준 ELISA 키트를 사용하여 고환 골수과산화효소(MPO) 활성21,25 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 수치를 결정합니다.
  9. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색26,27 및 카스파제 3 발현에 대한 면역조직화학을 이용한 조직병리학적 검사
    1. Bouin의 체액에서 고환 조직을 보존하십시오. 조직을 톨루엔으로 세척하고 파라핀 왁스에 담근 다음 60°C에서 밤새 배양합니다.
    2. ~5μm 두께의 절편을 채취하여 탈파라핀화 및 재수화한 다음 예열된 구연산염 완충액을 사용하여 항원을 회수한 다음 30분 동안 냉각시킵니다.
    3. 실험실 물티슈로 슬라이드를 청소하고 소수성 펜으로 단면 영역을 표시한 다음 가습 챔버에 슬라이드를 배열합니다.
    4. 과산화수소를 사용하여 내인성 과산화효소 활성을 차단한 후 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 슬라이드를 PBS로 한 번 헹구고 단백질 블록을 도포한 다음 10분 동안 배양합니다.
    5. 슬라이드를 PBS 2x로 헹구고, 해당 1차 항체(caspase 3)를 적용하고, 슬라이드를 45분 동안 배양하고, PBS로 2x를 헹굽니다.
    6. 2차 항체를 도포하고 25분 동안 배양한 후 PBS 2x로 헹구고 HRP 중합체를 첨가합니다. 25분 동안 배양 주기를 반복하고 PBS로 2회 헹굽니다.
    7. 디아미노벤지딘(DAB) 기질에서 절편을 5분 동안 배양하고, PBS로 2회 헹구고, 헤마톡실린으로 대조염색하고, 증류수로 헹구다.
    8. 절편에 청색 용액을 바르고, 헹구고, 탈수하고, 청소하고, 정성적 검사를 위해 장착합니다.
    9. 광학 현미경으로 조직을 검사하고 현미경에 부착된 디지털 카메라로 100배 및 400배 배율로 현미경 사진을 찍습니다.

4. 통계 분석

  1. 선택한 소프트웨어로 통계 분석을 수행합니다. Anderson-Darling 테스트, D'Agostino 및 Pearson 테스트, Shapiro-Wilk 테스트를 수행하여 정규성을 테스트합니다.
  2. 두 그룹 간의 유의미한 차이를 테스트하기 위해 pair가 없는 t-검정을 수행합니다: SO와 T/D.
  3. 데이터를 평균± 평균의 표준 오차로 표시합니다. 유의 수준을 p < 0.05, p < 0.01 및 p < 0.001로 설정합니다(그림 범례에 보고된 대로).

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결과

XO 활성, MDA 수준 및 고환의 SOD, 카탈라아제 및 GPx 활성을 산화 스트레스의 마커로 사용했습니다. 비틀림/비틀림(T/D)은 가짜 수술 쥐에 비해 T/D 쥐에서 XO 활성 및 MDA 수준을 현저하게 증가시키고 SOD, 카탈라아제 및 GPx의 고환 활성을 감소시켰으며(그림 1), T/D 유발 손상에서 산화 스트레스의 역할을 묘사합니다.

또한 염증의 매개체인 TNF-α와 호중구 침윤의 지표인 MPO를 염증의 지표로 사용하였다. T/D는 가짜 수술 쥐와 비교할 때 T/D 쥐의 고환 조직에서 TNF-α 농도를 유의하게 증가시켰습니다(그림 2A). 고환의 T/D는 또한 가짜 수술 동물과 비교할 때 골수과산화효소의 고환 활성을 유의하게 증가시켰습니다(

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토론

이 논문과 함께 제공되는 비디오는 고정 접근법을 사용한 고환 IRI 연구를 위한 TT의 외과적 유도에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다. 이 방법은 클램핑 기술7에 의해 발생하는 고환의 장기간의 외부화를 방지하는 동시에 인간에서 TT의 임상 양상을 보다 밀접하게 모델링한다는 점에서 특히 유용합니다10,12.

규정된 기간 동안 허혈이 확립되면 고환에 접근하기 위해 지갑 끈 스티치를 제거하고, 음낭의 고정 스티치를 제거하여 움직이고, 시계 반대 방향으로 720° 돌려 비틀린 고환을 풀고 고환을 크롬 2-0을 사용하여 연속 봉합사로 닫힌 음낭으로 고환을 되돌립니다. 프로카인 페니실린 분말을 절개 부위에 도포하여 감염을 예방합니다. 고환을 음낭으로 되돌리기 전에 탯줄과 그에 수...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이로써 절차의 촬영 및 편집을 도와준 보건과학대학 시청각 부서장인 Mr Ojeniran의 도움을 인정합니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 cc 주사기해당사항 없음해당사항 없음마취용
2-0 크롬 봉합사해당사항 없음해당사항 없음수술용
Bard Parker 나이프 손잡이해당사항 없음해당사항 없음수술용
곡선형 모기 동맥 클램프해당사항 없음해당사항 없음수술용
해부용 가위해당사항 없음해당사항 없음수술용
GraphPad Prism (버전 8.0.2)
케타민 주사Swiss Parenterals LTD 구자라트 인도2321154마취제
파라세타몰 주사산시 중바오 제약, 중국220637진통제
포비돈JAWA International Limited 나이지리아135S방부제 세척
프로카인 페니실린 분말안후이 청시 제약 유한공사 중국201906수술용
수술용 블레이드해당사항 없음해당사항 없음수술용
수술용 장갑전장 화양 라텍스 제품 중국210325
스티치 가위해당사항 없음해당사항 없음수술용
톱니형 해부 클램프해당사항 없음해당사항 없음수술용
자일라진 주사Bioveta 체코 공화국396228A마취제
광학 현미경Novel Microscope, 중국해당사항 없음조직 병리 학적 평가용
디지털 카메라Hayear, 중국해당사항 없음조직 병리 학적 평가용
TNF-&알파; 키트Elabscience, 미국E-EL-H0109분석용
Thermo Fischer 키트 (카스파제 3 발현을 위한 마우스 항 카스파제 3 모노클로날)Thermo Fischer Scientific Inc., 미국해당사항 없음면역 조직 화학 (카스파제 3)용
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