방법 논문

췌장암의 마우스 모델에서 종양 침윤 림프구의 유세포 분석 기반 분리 및 치료 평가

DOI:

10.3791/67413

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2025년 1월 17일

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1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

이 논문에서

요약

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우리는 양자 세포 전달을 위해 유세포 분석을 통해 마우스의 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델에서 종양에 대한 TIL의 특정 세포 독성을 검증하여 췌장암에 대한 입양 세포 요법 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

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췌장암은 예후가 좋지 않고 치료 옵션이 제한된 공격적인 악성 종양입니다. 종양 침투 림프구(TIL)와 같은 환자 자신의 면역 세포를 다시 주입하기 전에 분리하고 활성화하는 양자 세포 요법은 유망한 실험적 접근 방식입니다. 그러나 전임상 췌장암 모델에서 양자 세포 전달을 위한 기술은 잘 확립되어 있지 않습니다. 여기에서는 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델의 TIL을 사용한 입양 세포 치료에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 시술은 살아있거나 방사선 조사된 마우스 췌장암 세포를 형광 표지된 리포터 마우스에 이식하여 면역 세포 유입을 시작한 다음, 유세포 분석 분류 및/또는 종양 반응성 T 세포를 생체 외 활성화 및 확장하여 원발성 종양에서 림프구를 분리하고, 이러한 활성화된 T 세포를 복강 내로 종양 보유 마우스에 이식한 다음 인터루킨-2 투여를 수행합니다. 생물발광 종양 이미징을 통해 정형소 종양 성장 및 치료에 대한 반응을 종적으로 모니터링할 수 있으며, 특히 종양 특이적 세포독성 효과를 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식은 췌장암 환자를 위한 입양 세포 전달 요법 개발과 관련된 물류를 요약합니다. 그 결과, 무관한 림프구 대조군에 비해 양양으로 이식된 종양 반응성 T 세포의 향상된 항종양 효능을 입증했습니다. 이 다재다능한 방법론은 췌장암에서 입양 면역 요법에 대한 생체 내 연구뿐만 아니라 세포 처리 매개변수 및 조합 치료 요법의 최적화를 가능하게 합니다.

서론

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췌장암 면역요법은 초기 단계에 있으며, 주로 마우스 모델에 대한 전임상 탐구 및 검증이 진행 중입니다1. 현재 췌장암의 치료법에는 수술, 화학 요법, 방사선 요법 및 표적 요법이 포함됩니다. 불행히도 이러한 방법은 종양 병변을 완전히 근절하지 못하여 재발과 진행으로 이어지는 경우가 많습니다. 전통적인 치료법은 종양 세포에 초점을 맞추지만, 종양 세포와 종양 침윤 림프구(TIL), 섬유아세포 및 세포외 기질2로 구성된 관련 기질을 모두 포함하는 종양 미세환경(TME)을 간과하는 경우가 많습니다. TIL은 세포독성 T세포, 도우미 T세포, 조절 T세포, B세포, NK세포, 대식세포, 골수성 억제세포를 포함하는 TME 내의 면역세포입니다3. 이 세포는 종양의 성장과 치료 결과에 영향을 미치는 면역 반응에 참여합니다4.

양자 세포 요법(ACT)은 환자의 면역 세포를 채취하여 체외에서 변형 및 확장한 다음 다시 도입하여 종양 세포를 표적으로 삼고 죽이는 것입니다. ACT의 일종인 TIL 요법은 흑색종, 폐암....

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프로토콜

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생쥐 군집은 AAALAC International 인증 시설에 보관되며 모든 관련 USDA, HHS 및 NIH 규정 및 표준을 준수합니다. 톈진 의과대학 암 연구소(Tianjin Medical University Cancer Institute)와 병원 동물 관리 및 사용 위원회(Hospital Animal Care and Use Committee)는 균주 선택의 근거, 실험 그룹 할당, 동물 수 및 무작위 배정에 대한 통계적 타당성을 포함한 모든 동물 절차를 검토하고 승인했습니다.

1. 종양 유도

  1. KPC-Luc 세포주11 을 사용하여 마우스에서 정소성 췌장 종양을 유도합니다.
  2. KPC-Luc 세포를 트립신화하고 PBS로 2회 세척한 후 30% 기저막 매트릭스(BMM)를 사용하여 PBS에서 1 x 106 cells/mL의 농도로 재현탁하여 세포 현탁액을 준비합니다.
  3. 4%의 유도 용량으로 이소플루란으로 마우스를 마취한 다음 2%의 유지 용량으로 전환합니다. 필요에 따라 발열 패드와 모니터를 사용하여 열 지원을 제공합니다. 건조함을 방지하기 ....

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결과

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수용 마우스는 TIL 전달의 효능을 철저히 평가하기 위해 7개 그룹으로 나뉩니다. (a) 식염수 대조군(블랭크 대조군): 기준선 역할을 하기 위해 식염수 주사를 받는 마우스. (b) IL-2 전용(블랭크 대조군): 사이토카인 단독의 효과를 설명하기 위해 IL-2 주사를 맞은 마우스. (c) 투여된 기증자 마우스와 동일한 단일 처리(양성 대조군): 직접 처리와 TIL 전이를 비교하기 위해 기증자 마우스와 동일한 처리를 받은 마우스. (d) IL-2(음성 대조군)가 있는 대조군 기증자의 TIL: 치료되지 않은 종양에서 TIL의 효과를 평가합니다. (e) IL-2(음성 대조군)를 가진 대조군 기증자의 PBMC: 말초 혈액 세포와 TIL의 효과를 비교합니다. (f) IL-2(치료 효과)로 치료받은 기증자의 TIL: 치료받은 기증자의 TIL의 효능을 평가하기 위한 1차 실험 그룹. (g) IL-2(비특이적 세포독성 조절)로 처리된 공여자의 PBMC: 치료된 마우스의 전신 면역 세.......

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토론

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췌장암에 대한 잠재적인 면역요법은 양자면역요법, 면역관문억제제, 종양백신과 같은 종양세포를 표적으로 하고 제거하는 면역체계를 강화할 수 있다12. TIL 요법은 종양에서 림프구를 추출하고 확장한 다음 환자에게 다시 주입합니다. TIL 요법은 다른 양세포치료제와 비교했을 때, 다양한 TCR 클론성, 우수한 종양 유도 능력, 낮은 off-target 독성을 가지고 있어 고형 종양 치료에 유리하다13.

Rosenberg6과 동료들은 쥐에서 TIL을 분리하여 in vitro에서 IL-2로 확장한 다음 전이성 흑색종 숙주에 재주입하여 상당한 항종양 반응을 보여주었습니다. 이러한 성공은 다양한 고형 종양에 대한 TIL(이)와 관련된 임상시험에 박차를 가하는 계기가 되었습니다. 그러나 고형.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없다고 선언했습니다. 언어 편집을 위해 ChatGPT와 Claude-3를 사용하는 동안 저자는 기사에 포함하기 전에 ChatGPT 또는 Claude-3에서 생성된 단어와 문장을 주의 깊게 검토하고 검증했습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC) 보조금, 보조금 번호 82272767 및 Y.M.에 대한 82072691의 지원을 받았습니다. 저자는 팀원들의 토론과 협력에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생물 발광 이미징 시스템PerkinElmerIVIS Spectrum종양 성장 모니터링용
소 혈청 알부민 VSolarbioA8020세포 재현탁
세포 여과기(40 μ m 또는 70 μ m)JetCSS013040세포 현탁액 여과용
CentrifugeEppendorf5810R세포 채취 및 준비용
CO2 챔버Tianjin LiliangN/A마우스 안락사용
콜라겐분해효소Sigma-AldrichC5138소화 용액용
CD3-APC 항체Biolegend100236유세포 분석용 염색
CD45-APC/Fire750 항체Biolegend100154유세포 분석 염색
C57BL/6 알비노 마우스Jackson Laboratory58Donor and recipient mice
Dispase IIGibco17105-041분해 용액
DNase ISparkJadeAC1711분해 용액
D-Luciferin potassium saltBeyotimeST198-10g라이브 이미징용
에탄올(75%)N/A살균용
Fc 차단제BD Biosciences553142유세포 분석 염색용
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701세포 배양용
유세포 분석기BD BiosciencesFACSAria III세포 분류용
IL-2(인터루킨-2)PeproTech200-02투여용 이식 후
IsofluraneShandong AnteN/A마약용
KPC-Luc 세포주PI lab 생성N/A정형소 췌장 종양 유도용
Matrigel MatrixCorning356234정소성 이식용
PBS(인산염 완충 식염수)ServicebioG4207-500ML세포 세척 및 재현탁용
RPMI 1640 mediumGibco11875093소화액 준비용
멸균 후드ESCON/A 멸균 종양 추출 및 처리용
멸균 가위 및 겸N/A종양 추출용
봉합사(4-0, PGA 흡수성 봉합사)Jinhuan MedicalR413상처 봉합용
주사기Jiangxi Fenglin1 mL 0.45 × 16RWLB주입용
조직 배양 플레이트 12 웰제트TCP001012종양 소화용
용 자

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al.

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재인쇄 및 허가

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Tumor Infiltrating LymphocytesFlow CytometryAdoptive Cell TherapyPancreatic Cancer ModelTIL IsolationTumor Reactive T CellsBioluminescent ImagingCell SortingInterleukin 2 AdministrationOrthotopic Tumor

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