방법 논문

소용량 챔버에서 고해상도 호흡 측정

DOI:

10.3791/67442

⸱

2025년 7월 25일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 고분해능 호흡 측정을 위한 0.5mL 챔버가 적절한 기기 O2 배경 보정이 적용되는 경우 2.0mL 챔버와 일치하는 결과를 보여준다는 것을 보여줍니다. 샘플이 덜 필요하므로 가용성이 제한되거나 호흡 능력이 낮은 연구에 유리합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

호흡 플럭스를 조사하는 것은 대사 과정 간의 복잡한 상호 작용을 이해하는 데 결정적입니다. 샘플 가용성이 제한적이고 호흡수가 낮은 세포 및 조직에 대한 연구는 작은 실험량의 이점을 얻을 수 있습니다. 0.5mL 챔버가 Oroboros를 사용한 고분해능 호흡 측정에 사용되는 동일한 샘플 농도에서 2.0mL 챔버와 일치하는 결과를 산출하는지 조사했습니다. 배경 O2 플럭스는 공기 포화 상태에서 2.0mL 챔버보다 0.5mL에서 4배 더 높았지만 재현 가능하여 정확한 배경 보정이 가능했습니다. 최적의 교반 속도는 0.5mL 챔버에서 분당 550회전(rpm)에서 750rpm 사이였습니다. 살아있는 세포, 투과화된 세포 및 분리된 미토콘드리아의 호흡 플럭스는 14 내지 20회 적정이 있는 기질-언커플러-억제제 적정 프로토콜을 사용하여 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 병렬로 측정되었습니다. 다른 챔버 유형의 O2 플럭스는 검출 한계 내에서 동일했습니다. 2.0mL 챔버보다 거의 4배 적은 샘플이 필요한 0.5mL 챔버는 샘플의 양이 제한되어 있거나 호흡 능력이 낮은 연구에 상당한 이점을 제공합니다.

서론

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미토콘드리아 호흡 경로를 조사하는 것은 다양한 질병, 노화 또는 스트레스에 대한 반응의 근본적인 대사 메커니즘을 밝혀 치료 개입을 위한 잠재적 표적을 제공하고 진단 능력을 향상시키는 데 중요합니다 1,2,3. 고분해능 호흡계(HRR)를 사용하면 다양한 시료 유형 및 준비에 걸쳐 산화적 인산화(OXPHOS)에서 미토콘드리아 경로 및 커플링 제어를 자세히 분석할 수 있습니다4. 실험실의 부피는 호흡 측정 장비의 기본 설계 특징입니다. 이전에 설정된 챔버 부피는 Oroboros에서 2.0mL입니다. 이 부피는 낮은 기기 배경 O2 플럭스를 수반하고 교반 매체의 균질성을 보장하도록 최적화되었습니다. 이는 미토콘드리아 산소 동역학 및 투과성 근육 섬유에 필요한 저산소 및 고산소 조건에서 호흡을 정확하게 측정하기 위한 핵심 품질 기준 중 하나입니다(각각 5,6,7,8,9). 또한, 여러 멀티센서 삽입(10)은 2.0mL 챔버의 공간을 필요로 한다(표 1).

본 연구에서는 HRR을 위한 챔버 부피를 2.0mL에서 0.5mL로 줄이는 타당성을 조사했습니다. 정확도를 손상시키지 않고 더 작은 챔버에서 호흡 측정 분석에 더 낮은 세포 수 또는 조직 양을 적용할 수 있습니까? 이 질문의 명확화는 인간 조직 및 액체 생검, 1차 세포 및 느리게 성장하는 세포 배양을 조사하는 데 중요합니다1. 유사하게, 챔버 부피의 감소는 결함이 있는 미토콘드리아11 및 뇌의 지방산 산화와 같이 본질적으로 낮은 용량을 가진 미토콘드리아 경로에서 호흡 활동이 낮은 샘플의 연구에서 잠재적으로 유리합니다12. 그러나, 낮은 챔버 크기에서는O2 역확산의 아티팩트 불균형적으로 증가하고 부정확한 부피 보정13,14로 인해 분해능이 감소할 수 있습니다. 따라서 우리는 2.0mL로 보정된 클래식 부피 챔버(cV)와 비교하여 최소 실험 부피 0.5mL로 보정된 소용량 챔버(sV)를 사용하여 Oroboros의 기기 성능을 분석했습니다. 특히, 기기 배경 O2 플럭스 및 최적 교반 속도를 분석했습니다.

기질-분리자-억제제 적정(SUIT) 프로토콜은 OXPHOS 분석에서 호흡수 및 상태를 평가하는 데 사용됩니다. SUIT 프로토콜은 호흡 측정 분석당 14-20회 적정으로 구성되었으며 몇 pmol∙s-1∙mL-1에서 수백 pmol∙s-1∙mL-1에 이르는 호흡 O2 플럭스를 수반했습니다. 결합-제어 상태에는 누출률 L, 즉 아데노신-5'-이인산(ADP)을 아데노신-5'-삼인산(ATP)으로 인산화하는 데 사용할 수 없고 양성자 누출, 양성자 슬립, 양이온 순환 및 전자 누출의 결과인 호흡의 소산 성분이 포함됩니다. OXPHOS 용량 P는 ODP의 존재 하에서 O2 소비(산화)로 측정된 전자 전달이 ATP 합성(인산화)과 결합될 때 미토콘드리아의 호흡을 설명합니다. 분리된 상태의 전자 전달 용량 E는 미토콘드리아 기질의 존재 하에서 양성체의 적정에 의해 정량화됩니다15. 잔류 산소 소비량 rox는 복합체 I 및 복합체 III 억제제 로테논 및 항마이신 A를 첨가한 후 결정됩니다.

우리는 sV 및 cV 챔버에서 세포와 미토콘드리아 제제의 호흡을 측정했습니다. 혈소판은 거핵구의 무핵 세포질 단편이며 쉽게 얻을 수 있는 인간 미토콘드리아 공급원을 나타냅니다. 따라서 혈소판은 온전한 원형질막을 가진 살아있는 세포(또는 세포 입자)의 모델로 적용되었습니다. 혈액 세포의 호흡은 전신 미토콘드리아 질환의 바이오마커 역할을 하며 대사 활성 기관의 생체 에너지 적합성과 상관관계가 있지만 16,17,18,19, 이러한 발견은 일반화될 수 없습니다 20,21,22. 인간 섬유아세포는 미토콘드리아 기능 장애의 세포 모델로 적용하기 위해 선택되었습니다 1,23,24,25. 원형질막의 온전함은 세포 생존력에 필요하지만 선택적 투과화는 세포질과 주변 배지 사이의 분자 교환을 허용합니다. 따라서, 화학적으로 투과화된 원형질막을 갖는 섬유아세포는 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 사용되고 미토콘드리아 하위 집단을 분리하는 데 필요한 분리된 미토콘드리아와 비교하여 투과화된 세포의 예로 연구되었습니다26,27.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 혈소판에 대한 연구를 위해 8명의 지원자가 연구 참여에 대한 서면 동의서를 제공했으며 이는 스웨덴 윤리 검토 기관(Nr. 2013/181)의 승인을 받았습니다. 남성 신생아의 인간 피부 섬유아세포 2개를 ATCC에서 구입하여 체코 보건부의 윤리적 승인에 따라 사용했습니다(프로젝트: AZV MZ CR NU22-07-00474). 생쥐와 관련된 절차는 오스트리아 동물 실험법에 따라 수행되었으며 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추동물 동물 보호를 위한 유럽 협약(Tierversuchsgesetz 2012; 지침 2010/63/EU; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3B/2016)을 참조하십시오. 실험 동물의 수를 최소화하기 위해 3R 원칙을 적용했습니다.

1. 볼륨 보정

  1. 소용량 챔버(s V) 또는 클래식 볼륨 챔버(cV)를 Oroboros에 장착합니다(그림 1A,B; 표 1).
  2. Oroboros를 켜고 DatLab에 연결합니다.
  3. 챔버를 건조시키십시오.
  4. 0.54mL의 H2O를 sV(0.50 mL 유효 실험 부피 플러스 0.04 mL 모세관 사부 부피)로 피펫팅 또는 2.07 mL의 H2O를 cV(2.00 mL 유효 부피 플러스 0.07 mL 모세관 사부피)로 피펫팅합니다.
    알림: 유리 실린더 상단과 폴리옥시메틸렌(POM) 챔버 홀더 사이의 액체 손실을 방지하려면 피펫 팁을 유리 챔버 벽에 닿을 만큼 깊게 삽입하십시오.
  5. 교반기를 켭니다.
  6. 챔버를 닫기 전에 모세관을 건조하게 유지하면서 마개의 O-링을 적십니다. 부피 교정 링을 풀고 액체가 마개 모세관을 채우고 모세관 상단의 용기에 작은 방울이 나타날 때까지 마개를 아래쪽으로 삽입합니다(표 1).
  7. 스토퍼를 연속적으로 삽입할 때 보정된 부피가 얻도록 부피 교정 링을 조여 위치를 고정합니다.

2. 오로보로스 일반 설정

  1. DatLab 소프트웨어를 시작합니다.
  2. 실험 온도(37°C)와 교반 회전 속도를 챔버 sV에서 550rpm(9.2Hz 또는 초당 회전수) 또는 챔버 cV에서 750rpm(12.5Hz)으로 설정합니다. 데이터 샘플링 간격을 2초로 설정하여 기기 O2 백그라운드 테스트에서 80초(40개 데이터 포인트) 또는 호흡 측정의 경우 40초(20개 데이터 포인트)에 걸쳐 평활화합니다.
    참고: 마그네틱 교반기 바(폴리비닐리덴 디플루오라이드[PVDF]로 코팅된 AlNiCo; 표 1) 챔버의 교반기 수준에서 3.5mT 전계 강도를 갖는 펄스 회전 자기장에 의해 교반됩니다.
  3. MiR05 또는 후속 실험에 사용된 것과 동일한 배양 배지에서 공기 보정28 을 수행합니다.
  4. 실험을 시작하기 직전에 제로 산소 교정을 가끔 수행하지 마십시오.
    1. O2-Zero 분말을 50mM 인산염 완충액(pH 8.0)에 sV 또는 cV 챔버에 대해 각각 2.5mM 또는 10mM의 농도로 용해시켜 신선한 Na-디티오나이트 원액을 준비합니다.
    2. Na-디티오나이트를 과도하게 적정하여 O2 농도 0 μM14,28에서 원시 신호 R0 또는 제로 전류[μA]를 얻습니다.

3. 계측 O2 배경 테스트

  1. 챔버 sV
    1. 공기 교정 후 챔버를 닫습니다. O2 농도가 공기 포화도에서 약 150μM로 감소할 때까지 약 60분 동안 산소 신호를 모니터링합니다. 플롯 'O2 기울기 음수'에 J°1에서 J°4 사이의 4개 표시를 설정합니다.
      참고: 실험을 시작하기 전에 매일 이 기기 O2 배경 테스트를 수행하십시오.
    2. 선택 사항: 해밀턴 주사기를 사용하여 단계 2.4.1에 따라 제조된 Na-디티오나이트를 적정하여 100μM의 O2 농도에 도달합니다(그림 1C).
      참고: 다른 프로토콜에서 Na-디티오나이트는 적정-주입 마이크로펌프(TIP2k; 보충 그림 1 및 보충 그림 2)을 사용하여 기기 배경 O2 플럭스28을 결정하는 표준 방법과 비교합니다.
  2. 챔버 cV
    1. 공기 보정 후 챔버를 닫고 O2 기울기가 안정화될 때까지 기다린 다음 플롯 'O2 기울기 음'28에 J°1 표시를 설정합니다. 해밀턴 주사기를 사용하여 2.4.1단계에 따라 준비된 Na-디티오나이트를 적정합니다. 챔버 sV의 산소 체계와 일치시키고 O2 농도를 150μM로 낮추기 위해 0.7 μL 단계로 합니다.
    2. 또 다른 Na-디티오나이트 적정 단계(약 7μL)를 추가하여O2 농도를 100μM로 낮춥니다(그림 1D).
  3. 기기 O2 배경 데이터 분석
    1. DatLab28에서 기기 O2 배경 기울기를 계산합니다. 상단 메뉴에서 플럭스/기울기를 선택합니다.
    2. O2 배경 보정 창을 엽니다. O2 배경의 소스로 활성 파일을 선택하고 선형 회귀 계산에 사용할 J° 표시를 선택합니다. O2 배경 보정을 적용합니다.

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그림 1: 소용량(sV) 및 클래식 용량(cV) 챔버 및 기기 O2 배경 테스트. (A) 챔버 sV. (B) 챔버 cV. (C) 기울기 음수 및 J°1 표시, sV (0.5mL, 녹색) 및cV (2.0mL, 파란색)의 대표적인 흔적. (D) 해당 산소 농도 및 R1 표시. 3개의 수동 Na-디티오나이트 적정(약 0.7 μL, 10 mM 스톡, cV) 및 각각 sV 및 cV 챔버에서 2.5 mM 및 10 mM 스톡의 최종 7.0 μL 적정. 적정으로 인한 스파이크가 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. Oroboros 챔버에 샘플 추가

참고: 샘플은 부분 부피 대체(본 연구에서 혈소판 및 섬유아세포) 또는 전체 부피 대체(본 연구에서 분리된 미토콘드리아)의 두 가지 방법으로 챔버에 추가할 수 있습니다.

  1. 부분 볼륨 교체
    1. 완전히 삽입된 스토퍼를 제거합니다. MiR05에서 볼륨 V를 피펫팅하고 폐기합니다. Vout은 혈소판의 경우 60-70 μL, 섬유아세포의 경우 80-150 μL이며, 스톡 세포 현탁액의 세포 농도에 따라 계산됩니다.
    2. Vout과 동일하게 동일한 부피의 VJ.i의 스톡 세포 현탁액(알려진 세포 농도 포함)을 챔버에 피펫팅합니다(그림 2).
    3. 유효 실험 부피 V(0.5mL 및 2.0mL)보다 큰 실제 부피 V'(0.54mL 및 2.07mL)로 실험 세포 농도를 계산합니다.
      참고: 스톡 세포 현탁액 및 실험 세포 농도의 농도는 작은 적정 오류와 양립할 수 있는 VJ.i = Vout의 부피를 얻도록 계획되어야 합니다. 혈소판 실험에서 모세관 사부피가 0.05mL인 챔버 sV에 프로토타입 스토퍼를 사용했습니다.
  2. 전체 볼륨 교체
    1. 챔버에서 전체 배지를 빨아들이고 각각 sV 또는 cV 챔버의 실험 샘플 농도에서 최소 0.54mL 또는 2.07mL의 분리된 미토콘드리아 원액으로 교체합니다.
    2. 챔버를 닫고 스토퍼 용기에서 과도한 미토콘드리아 원액을 빨아냅니다.
      참고: 완전한 용적 교체는 해밀턴 주사기를 사용하여 스토퍼 모세관을 통해 폐쇄된 챔버로 적정하여 발생할 수 있는 미토콘드리아 농도의 변동성을 배제합니다. 후자의 방법은 농축된 스톡 현탁액(예를 들어, 분리된 미토콘드리아)에서 제조된 작은 직경의 샘플에 적용할 수 있습니다. 그러나 해밀턴 주사기의 51mm 길이 바늘(내경 0.41mm)에 가해지는 전단력에 의해 깨지기 쉬운 세포를 원형질막의 잠재적 손상에 노출시킵니다. 이것은 스토퍼를 제거하고 부분 또는 전체 부피 교체를 통해 샘플을 챔버로 피펫팅함으로써 방지됩니다. 세 가지 유형의 미토콘드리아 제제가 연구되었습니다. 샘플 준비는 보충 파일 1 1,26,29,30에 설명되어 있습니다.
  3. 살아있는 세포: 인간 혈소판
    1. 혈소판이 포함된 냉동 바이알을 37°C의 수조에 삽입하고 얼음이 거의 남지 않을 때까지 내용물을 해동합니다.
    2. 냉동 바이알을 열고 예열된 배지 1mL(DPBS + 10mM EGTA, 37°C)를 천천히 방울로 추가합니다.
    3. 혈소판을 부드럽게 혼합하고 총 부피 10mL의 예열 배지(DPBS + 10mM EGTA, 37°C)가 있는 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 스윙 아웃 로터(가속 6, 브레이크 2)를 사용하여 실온(RT)에서 1000g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
    4. 혈소판을 0.25mL의 DPBS + 10mM EGTA(RT)에 재현탁하고 157 · 106 내지 210 · 106 x·mL-1 0.5mL 챔버 및 164 · 106 에서 220 · 10 2.0mL 챔버의6 x·mL-1(기본 단위 x에 대한 자세한 내용은31 참조).
      참고: 하나의 Oroboros에는 각각 위치 A와 B에 sV 및cV 챔버가 장착되었으며, 각각 위치 B와 A에sV 및cV 챔버가 장착된 다른 Oroboros와 병렬로 사용되었습니다.
  4. 투과화 세포: 인간 섬유아세포
    1. 공칭 세포 농도 0.75 · 106 x·mL-1 두 챔버 유형 모두에서 실제 농도를 계산합니다(단계 4.1.3).
      참고: 서로 다른 Oroboros 기기가 병렬로 사용되었으며 각각 sV 또는 cV 챔버가 장착되어 있습니다.
  5. 분리된 미토콘드리아: 마우스 심장
    1. 15μL의 미토콘드리아 현탁액을 5985μL의 미토콘드리아 호흡 배지(MiR05)에 첨가하면 0.013-0.026mg∙mL-1 범위의 스톡 미토콘드리아 단백질 농도가 됩니다.
    2. 완전한 부피 교체를 통해 미토콘드리아 현탁액을 Oroboros 챔버에 추가합니다.
      참고: 하나의 Oroboros는 각각 위치 A와 B에 sV 및 cV 챔버가 장착되었으며, 각각 위치 B와 A에 sV 및cV 챔버가 장착된 다른 Oroboros와 병렬로 사용되었습니다.

figure-protocol-2
그림 2: 부분 부피 교체에 의한 세포 현탁액의 추가. (a) 0.5mL 챔버 sv 및 (b) 2.0mL 챔버 cv에 첨가. (1) 기기 배경 O2 플럭스 JO 2° 측정을 위한 호흡 매체 V 부피와 채워진 스토퍼 모세관 Vstc가 있는 밀폐 챔버. (2) 스토퍼를 제거하고 Vstc를 챔버로 배출하여 총 부피 V'= V+Vstc가 됩니다. (3) 매체 Vout = -V J.i.의 부분 제거 볼륨 V''= V'+V출력이 챔버에 남아 있습니다. (4) 호흡 측정 스톡 세포 현탁액의 부피 V J.i를 사용하여 하위 샘플을 챔버에 피펫팅하여 희석된 세포 현탁액의 총 부피 V# = V+Vstc를 생성합니다. (5) 실험 부피 V에서 부피별 O2 플럭스 JV,O 2를 측정하기 위해 채워진 스토퍼 모세관(데드 볼륨 Vstc)이 있는 밀폐 챔버. 이 수치는 HRR41의 세포 수 및 정규화의 그림 2A에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. SUIT 프로토콜

  1. 보충 표 1에 나열된 화학 물질의 원액을 해밀턴 마이크로 시린지를 사용하여 챔버에 적정하고 적정량을 조정하여 sV 및 cV 챔버에서 동일한 실험 농도를 얻습니다(그림 6, 8, 10의 그림 범례 참조).
  2. 프로토콜 SUIT-003_D018 32,33을 선택합니다(본 연구의 혈소판의 경우).
  3. 프로토콜 SUIT-001_D004 4,15,34,35 및 SUIT-002_D007 4,15,35,36(본 연구의 섬유아세포의 경우)을 선택합니다.
  4. 프로토콜 SUIT-002_D005 4,15,35,37을 선택합니다(본 연구에서 분리된 미토콘드리아의 경우).

6. SUIT 데이터 분석

  1. DatLab에서 선택한 플롯의 섹션을 정의하기 위해 표시 를 설정합니다.
  2. 상단 메뉴에서 플럭스/슬로프 를 선택합니다. 플럭스/기울기(Flux/Slope ) 창을 엽니다. SUIT 프로토콜의 각 적정에 의한 부유 샘플의 희석을 위한 적정 부피 보정 을 적용합니다.
  3. 상단 메뉴에서 마크를 선택합니다. 마크 통계 를 열어 잔류 산소 소비량(rox)을 빼서 기준선으로 보정된 표시된 데이터 포인트의 중앙값을 표시합니다.
  4. 스프레드시트를 사용하여 역회귀 분석25,28에 의해 sV 및 cV 챔버에서 얻은 쌍을 이루는 결과 사이의 절편 및 기울기를 계산합니다.
  5. 소프트웨어 jamovi 2.3.1338을 사용하여 쌍을 이루는 스튜던트 t-테스트로 sV 및 cV 챔버의 rox 상태(최소 O2 플럭스)의 호흡수를 비교합니다.
    참고: Oroboros 기기의 두 챔버는 기능적으로 독립적이므로(온도 및 DatLab 기록 간격 제외) 각 챔버의 측정은 다른 기기를 사용하는 것과 유사하게 별도로 고려할 수 있습니다. 최종 결과는 변동성에 대한 정보와 함께 여러 챔버의 중앙값 또는 평균으로 보고될 수 있습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

산소 센서(POS)의 원시 신호 R1[μA]는 에서 확인된 바와 같이 '개방된' 챔버에서 공기의 기체상과 평형 상태에 있는 수성상의 부피와 독립적일 것으로 예상됩니다. 보충표 2. 그러나 밀폐된 방에서는 악기 배경 O2공기 포화 상태에 가까운 플럭스 J°1[pmol∙s-1∙mL-1]는 볼륨에 따라 다릅니다. V (보충표 2). The O2센서 소비 [PMOL∙s-1]는 영으로 보정된 원시 신호 R1-R0 [μA]로 측정된 전자 흐름에서 예측할 수 있으며, 전하 번호 4 e-/O2패러데이 상수 F = 96 485.33 C∙몰-1. 1μA는 전자 흐름(e-) 10.36 pmol∙s-1. 전하 번호로 나누면 O가 됩니다.2흐름15,39 2.591 pmol∙s-1·μA-1. R1-R0의 기록된 중앙값은 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 각각 2.09μA 및 1.98μA였습니다(보충표 2; R0 = 0.006 ± 0.007 μA(s)V 및 R0 = 0.004 ± 0.003μA(c)V 챔버), 이론적으로 O에 해당합니다.25.41 pmol∙s의 소비율-1및 5.13 pmol∙s-1. The O2센서의 흐름은 공기 포화도(J°R1) 5.41 pmol∙s-1/0.5 mL = 10.82 pmol∙s-1∙mL-1및 5.13 pmol∙s-1/2.0 mL = 2.56 pmol∙s-1∙mL-1에서V 및 cV 각각 챔버. 2.0mL 및 0.5mL 챔버에 동일한 유형의 폴라로그래픽 산소 센서를 사용하면 부피별 배경 O2플럭스 - 현재 R1-R0(J°R1) - 이론적으로 챔버 부피에 반비례하여 4배 증가합니다. J°공기 (공기 포화도에서 후방 확산이 0인 경우; 비교 테이블 2 그리고 보충표 3)는 O2실험적 배경 테스트의 선형 회귀에서 공기 포화도에서의 농도(그림 3). J°공기 이론적으로 기대되는 값에 접근했습니다. J°R1 두 챔버 모두(테이블 2). 이 J°공기 / J°R1비율은 0.85 ± 0.04 및 0.92 ± 0.12였습니다.V 및 cV 챔버는 각각 2.0mL 챔버에서 독립적인 일련의 52개 측정과 일치하며, 이 비율은 0.95 ± 0.12(보충표 4). J°공기 는 2.0mL 챔버보다 0.5mL에서 3.9배 더 높았습니다. 넷 O2백 확산 J°50, 50μM O에서 계산2실험적 배경 테스트의 선형 회귀에서 0.5mL 챔버(테이블 2). 악기 배경 O의 가변성2플럭스는 두 개의 서로 다른 챔버 부피에서 거의 동일했으며 표준 편차(SD)는 0.5 및 0.3 pmol∙s였습니다.-1∙mL-1때문에 J°공기 및 0.9 및 0.8 pmol∙s-1∙mL-1 때문에 J°50에서V 및 cV 챔버, 각각 (테이블 2). 더 높은 악기 배경에도 불구하고 O20.5mL 챔버의 기울기, 배경 O2플럭스 켜기 cO2두 챔버 유형 모두에서 재현성이 높았습니다(그림 3D). 이로 인해 잔차 값이 낮아집니다. <±1 pmol∙s-1∙mL-1두 챔버 모두(보충표 5), Oroboros의 탐지 한계에 따라28.

챔버가 '개방형' 구성인 상태에서 350rpm(5.8Hz)에서 950rpm(15.8Hz) 사이의 POS의 교정 원시 신호 R1에 대한 교반 속도의 영향을 100rpm(1.7Hz) 단위로 정량화했습니다. 이 구성에서 매질에 용해된O2는 기체상과 평형 상태에 있습니다. 따라서 교반 속도의 함수로서 원시 신호(마이크로암페어[μA])의 변화는 cO2의 실제 차이를 반영하지 않습니다. 산소 센서는 챔버 부피와 무관하게 기본 속도인 750rpm에서 R1에서 약간의 편차로 교반 속도의 변화에 반응했습니다(그림 4). '개방' 구성에서 신호 안정화 후 각 단계에 대해 SD로 정의되는 O2 기울기의 노이즈는 두 챔버 유형 모두에서 850rpm에서 가장 낮았고 교반 속도가 어느 방향으로든 이 값에서 벗어날 때 증가했습니다(그림 5A). 550rpm 미만에서 O2 기울기의 소음은 ±4pmol∙s-1∙mL-1의 임계값을 초과하여 최소 실제 교반 속도를 정의했습니다. 기술적 한계로 인해 상한에 도달하지 못하여 최대 실제 교반 속도로 950rpm을 렌더링했습니다(그림 5A). 이 범위 내에서 R1에서 O2 신호의 편차는 <2.5%였습니다. 챔버를 닫아도 소음과 교반 속도 사이의 관계는 변경되지 않았습니다(그림 5B). 지수 시간 상수 τ는 0.5mL 챔버의 경우 550rpm에서 2.53 ± 0.05초, 750rpm에서 2.50 ± 0.05초였습니다(보충 그림 3).

혈소판에 적용되는 SUIT-003_D018 프로토콜에는 최대 14개의 적정 단계가 포함됩니다. 세포 생존력의 지표로서 살아있는 세포, ce 및 원형질막 투과성의 결합 제어를 연구하도록 설계되었습니다32. 두 가지 유형의 챔버(그림 6)에서 측정된 산소 흐름은 모든 호흡 상태에서 밀접하게 일치했습니다(그림 7). 간헐적 재산소화는 기능적 저산소증을 피하거나 실험적 O2 농도를 정의된 범위로 제한하기 위해 필요합니다. 재산소화는 Rot의 적정 후 챔버를 '열림' 위치로 열어 수행되었습니다. 챔버를 닫았을 때 O2 플럭스는 2.0mL 챔버에서 4분 이내에 안정화되었지만 안정화 및 새 표시를 설정하기 전에 0.5mL 챔버에서 약 10분이 필요했습니다(그림 6 및 보충 그림 4). O2 플럭스가 낮을 때 록스 상태의 재산소화는 안정화에 필요한 시간 동안 O2 농도의 감소를 방지합니다. 로테논 억제 rox는 sV 및 cV 챔버에서 각각 98 ± 17 및 94 ± 17 μM O2(평균 ± SD)에서 0.9 ± 0.6 및 2.0 ± 0.6 pmol∙s-1∙mL-1이었습니다. Rox는 재산소화 시 0.4 pmol∙s-1∙mL-1 ±± 3.1 0.4 pmol∙s-1∙mL-1 증가하여 sV 및 cV 챔버에서 각각 159 ± 8 및 147 ± 11 μM O2로 증가했습니다. 혈소판에서 관찰된 rox의 산소 의존성은 인간 섬유아세포 및 제대 정맥 내피 세포에 대한 결과와 일치합니다40.

투과화된 섬유아세포의 OXPHOS 분석을 위해 최대 17 및 20 적정 단계(SUIT-001 및 SUIT-002, 각각35; 그림 8); 따라서, 적정 부피 보정은 SUIT-002가 끝날 때 희석액이 sV 및 cV 챔버에서 각각 최대 14% 및 10.5%에 달했기 때문에 특히 중요합니다. 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 각각 0.35·106 x 및 1.44·106 x의 섬유아세포 수는 0.75·106 x∙mL-1의 동일한 세포 농도를 가져왔습니다. SUIT-001과 SUIT-002의 조합은 20가지 호흡 상태를 다루었으며, 모두 2챔버 유형에서 밀접한 상관관계가 있었습니다(SUIT-001의 경우 r2= 0.950, SUIT-002의 경우 r2= 0.959). 두 프로토콜 모두에서 복합체 IV는 상대적으로 높은 산란을 가졌습니다(그림 9). SUIT-001에서는 루틴 상태(평균 ± SD)에서 18.7 ± 7.0 pmol∙s-1∙mL-1의 낮은 부피별 O2 플럭스에서 시작하여 O2 농도가 프로토콜의 CIV 연결 섹션까지 56μM로 감소할 수 있었습니다(그림 8A; 8Ama). 그러나 SUIT-002에서는 언커플러 적정 전에 재산소화를 수행하여 O2 농도를 100μM에서 180μM로 증가시켰습니다(그림 8B, 6Gp). 재산소화 후 플럭스의 안정화에 필요한 오랜 시간을 고려할 때 언커플러 적정 중 재산소화는 피해야 합니다.

단축된 SUIT 프로토콜을 분리된 미토콘드리아에 적용했습니다(그림 10). 미토콘드리아 단백질 농도는 호흡 측정 분석 후에 결정되었으므로 챔버 내 정확한 샘플 농도를 미리 정의하는 것이 불가능했습니다. 부피별 호흡 플럭스는 미토콘드리아 농도의 함수로 달라집니다. 따라서 데이터는 부피별 및 단백질 질량별 플럭스로 표시되었습니다(그림 11). 두 표현 모두 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 얻은 측정 값 간의 긴밀한 상관관계를 보여줍니다(그림 11).

항마이신 A에 의한 복합체 III 억제 후 측정된 잔류 산소 소비량 rox는 매우 낮은 호흡수에서 기기 성능의 지표로 사용될 수 있습니다. 모든 실험 시리즈에서 rox는 0.5mL 챔버와 2.0mL 챔버 간에 비슷했습니다(혈소판: t(5) = -0.34, p = 0.74; 섬유아세포: SUIT-001: t(10) = 20.00, p = 0.06; SUIT-002: t(10) = 11.00, p = 0.96; 분리된 미토콘드리아: t(4) = -1.18, p = 0.27). 데이터의 산란은 그림 12에 표시된 것처럼 ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28의 기기 불확실성에 크게 해당합니다. 원본 파일은 Zenodo 저장소(10.5281/zenodo.11634408)에서 공개 액세스가 가능합니다. 

figure-results-1
그림 3: sV(0.5mL, 녹색 및 검은색) 및 cV 챔버(2.0mL, 파란색)에 대한 기기 배경 O2 플럭스. O2 농도 범위는 공기 포화도 (약 180 μM)에서 약 50 μM까지입니다. 열린 기호 : Na-디티오나이트 없이 얻은 O2 농도. 고체 기호: Na-디티오나이트의 수동 적정에 의해 제어되는 O2 농도. 검은색 원: 0.5mL 챔버(N = 8)에서 TIP2k를 사용하여 Na-디티오나이트의 적정에 의해 제어되는 O2 농도. 기기 배경 테스트의 결과는 살아있는 세포(ce)를 사용하기 전에 (A) 시리즈 1(sV: N = 2; cV: N = 2)에서 통합되었습니다. (B) 투과화 세포(pce)를 사용하기 전에 시리즈 2(sV: N = 38; cV: N = 50); (C) 분리된 미토콘드리아(imt)를 사용하기 전에 시리즈 3(sV: N = 10; cV: N = 10). (D) 패널 A-C의 중첩 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 4: 0.5mL 챔버(녹색) 및 2.0mL 챔버(파란색)의 공기 포화('개방' 챔버)에서 POS 신호에 대한 교반 회전 속도의 영향. 750rpm에서 R0 보정 공기 교정 신호 R1-R0 [μA]에 대한 응답 [%](sV: N = 4; cV: N = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 5: 교반 회전 속도의 함수로서의 O2 기울기 소음. (A) '개방' 챔버에서 표준 편차로 표현되는 소음; (B) 밀폐 챔버(0.5mL, 녹색, 2.0mL, 파란색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 6: 0.5mL 챔버에서 냉동 보존된 인간 혈소판의 O2 소비. O2 플럭스 [pmol∙s-1∙mL-1]를 세포 농도 157∙106 x∙mL-1로 나눈 값으로 계산된 O 2 농도[μM](파란색 선) 및 세포당 O2 유량 [amol∙s-1∙x-1]의 대표적인 미량(빨간색 선, 기기 배경 O2 플럭스에 대해 보정됨, 적정으로 인한 스파이크는 제거됨). O2 농도는 간헐적 재산소화(공기, '개방형' 챔버, 파란색 음영)에 의해 50μM 이상으로 유지되었습니다. 호흡 상태의 순서(적정 및 속도, 프로토콜 SUIT-003_D018): ce1, 살아있는 세포의 일상적인 호흡 R. ce1P, 피루브산 5 mM을 외부 기질로 사용합니다. ce2Omy10(패널 A), 5nM 단계의 Omy 적정; 누출 호흡 L. ce3U0.3(패널 A) 및 ce3U0.1(패널 B), 각각 0.3 및 0.1 μM의 최적 CCCP 농도로 분리기 적정; ET 용량 E. ce3Glc, 포도당 11 mM; E는 언커플러에 의해 점진적으로 억제됩니다. ce4썩음, 로테논 0.5 μM 억제 CI; 잔류 산소 소비량 ROX. ce5S, 숙시네이트 10 mM; 원형질막 투과성 세포에서 E를 자극합니다. 1Dig15(패널 A) 및 1Dig10(패널 B), 완전한 원형질막 투과화를 위해 각각 15 및 10 μg·mL-1의 최적 농도로 5 μg·mL-1 단계로 디지토닌 적정; 숙시네이트 경로 ET 용량 SE. 1c, 시토크롬 c 10 μM; 미토콘드리아 외막 무결성 테스트. 2Ama, 항마이신 A 2.5 μM 억제 CIII; 록스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 7: 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 측정된 냉동 보존된 인간 혈소판의 호흡 상관관계. Rox 보정 O2 흐름은 프로토콜 SUIT-003_D018에서 평가되었습니다(그림 6). N = 6입니다. (A) 올리고마이신 오미 함유; (B) 오미 없이. 모든 데이터에서 계산된 역최소 제곱 회귀 및 결정 계수 r2의 평균 기울 figure-results-6 기 및 절편figure-results-7. 검은색 점선은 정체성의 선을 나타냅니다. 빨간색 선은 계산된 회귀선을 나타냅니다. 포도당을 첨가한 후 상태의 O2 흐름은 제외되었습니다(그림 6 참조). 올리고마이신이 있는 프로토콜과 없는 프로토콜은 데이터 포인트의 중복을 피하기 위해 패널 A와 B로 분리됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 0.5mL 챔버에서 섬유아세포의 O2 소비. 세포당 CO2(파란색 선[μM]) 및 세포당 O2 흐름의 대표적인 흔적은 O2 플럭스[pmol∙s-1∙mL-1]를 세포 농도(0.75·106 x∙mL-1)로 나눈 값으로 계산되었으며, 기기 배경 O2 플럭스에 대해 보정되었습니다(빨간색 선, 적정으로 인한 스파이크가 제거됨). O2 농도는 간헐적 재산소화(공기, '개방형' 챔버, 파란색 음영)에 의해 50μM 이상으로 유지되었습니다. 호흡 상태의 순서(적정 및 속도). (A) 프로토콜 SUIT-001_D004: ce1, 일상적인 호흡 R. +Dig, 디지토닌 10μg·mL-1(ce to pce), 잔류 내인성 호흡 ren. 오후 1시, 피루브산 5mM 및 말산염 2mM; N-경로 누출 호흡 NL. 2D, ADP 2.5 mM; N-경로 OXPHOS 용량NP. 2c, 시토크롬 c 10 μM; 미토콘드리아 외막 무결성 테스트. 3U1.5, 최적의 CCCP 농도 1.5μM에 대한 언커플러 적정; NADH 연결 ET 용량 NE. 4G, 글루타메이트 10mM; N(PGM)E입니다. 5S, 숙시네이트 10 mM; NS 경로 ET 용량 NSE. 6썩음, 로테논 0.5μM; 숙시네이트 경로 ET 용량 SE. 7Gp, 글리세로인산염 10mM; SGpE. 8Ama, 안티마이신 A 2.5μM; 록스. 9AsTm, 아스코르브산염 2mM 및 TMPD 0.5mM; CIV 자극을 위한 기질; 챔버는 산소 고갈 없이 산화환원 평형을 허용하기 위해 20분 동안 열린 상태로 유지되었습니다4; O2 플럭스 오프 챔버 후 스케일(205 amol·s-1·x-1). 10Azd, 아지드 100 mM; 산소 의존성 화학적 배경 플럭스 CHB. (B) 프로토콜 SUIT-002_D007: ce1, R. +파고, 렌. +D, 자극 렌. +M.1, 말레이트 0.1 mM 및 1Oct, 옥타노일카르니틴 0.5 mM; F-경로 OXPHOS 용량 FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, 말레이트 2mM은 anaplerotic N-경로를 지원합니다. F(N)P. 3P 및 4G, FNP에 대한 점진적 활성화. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpP. 7U1.5, FNSGpE. 8썩음, SGpE. 9아마, 록스. 10AsTm O2 플럭스 오프 스케일 207 amol·s-1·x-1. 11아즈드, chb. 일반적으로 복합체 IV 활성은 밀접하게 일치하는 O2 농도에서 속도 J(AsTm)-J(Azd)의 차이입니다. 자세한 내용은 그림 6을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-9
그림 9: 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 투과화된 섬유아세포의 호흡 상관관계. (A) SUIT-001_D004 및 (B) SUIT-002_D007(N = 6)에서 Rox 보정된 O2 흐름. 모든 데이터에서 계산된 역최소 제곱 회귀 및 결정 계수 r2의 평균 기울 figure-results-10 기 및 절편figure-results-11. 검은색 점선은 신분의 선을 나타냅니다. 빨간색 선은 계산된 회귀선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-12
그림 10: 0.5mL(녹색) 및 2.0mL(파란색) 챔버에서 분리된 마우스 심장 미토콘드리아의 O2 소비. (A) 미토콘드리아 단백질 농도 0.023 mg∙mL-1에서 질량 특이적 O2 플럭스(기기 배경 O2 플럭스에 대해 보정됨, 적정으로 인한 스파이크가 제거됨) 및 (B) O2 농도[μM]의 대표적인 미량. 프로토콜 SUIT-002_D005에 따른 호흡 상태(적정 및 속도)의 순서: imt, 잔류 내인성 호흡 ren. +D, ADP 2.5mM; 자극적인 렌. +M.1, 말레이트 0.1 mM 및 1Oct, 옥타노일카르니틴 0.5 mM; F-경로 OXPHOS 용량 FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, 시토크롬 c 10 μM; 미토콘드리아 외막 무결성 테스트. 2M2, 아나플레로틱 N-경로를 지원하는 고말산염 2mM; F(N)P. 3P, 피루브산 5mM; FN피. 4G, 글루타메이트 10mM; FN피. 5S, 숙시네이트 10 mM; FNS피. 6Gp, 글리세로인산염 10mM; FNSGpP. 7U0.5, 최적의 CCCP 농도 0.5μM로 언커플러 적정; FNSGpE. 8썩음, 로테논 0.5μM 억제 CI; SGpE. 9Ama, CIII를 억제하는 항마이신 A 2.5μM; 잔류 산소 소비량 ROX. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-13
그림 11: 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 측정된 분리된 마우스 심장 미토콘드리아의 호흡 상관관계. O2 플럭스 그림 10에 표시된 프로토콜의 플럭스(N = 4). (A) 부피별 O2 플럭스. (B) Rox 보정 O2 플럭스를 미토콘드리아 단백질 농도로 나눈 값(0.013 - 0.026 mg∙mL-1). 모든 데이터에서 계산된 역최소 제곱 회귀 및 결정 계수 r2의 평균 기울 figure-results-14 기 및 절편figure-results-15. 검은색 점선은 정체성의 선을 나타냅니다. 빨간색 선은 계산된 회귀선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-16
그림 12: 0.5mL 및 2.0mL 챔버의 잔류 산소 소비량 rox . 살아있는 세포(ce, 사각형), 투과화 세포(pce, 원) 및 분리된 미토콘드리아(imt, 삼각형)를 사용한 실험에서 결합된 항마이신 A를 첨가한 후 측정된 부피당 플럭스. 거꾸로 된 최소 제곱 회귀의 평균 기울 figure-results-17 기와 절편 figure-results-18. 점선: 신분의 선입니다. 빨간색 선: 계산된 회귀선입니다. 그림자: 악기 해상도 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모듈에스V씨V
실험실 볼륨 V0.5 밀리미터2.0 밀리그램
유리 실린더의 내경12.0 밀리미터16.0 밀리미터
유리 실린더의 외경24.0 mm24.0 mm
유리벽의 두께6.0 밀리미터4.0 밀리미터
PVDF 코팅 교반기 바11.5 x 6.2 밀리미터15.0 x 6.0 밀리미터
스토퍼 모세관 직경1.00의 mm1.30 밀리미터
스토퍼 모세관 단면적0.79 밀리미터21.33 밀리미터2
스토퍼 모세관 길이50.64 밀리미터48.86 밀리미터
스토퍼 모세관 부피39.8 μL64.9 μL
스토퍼 모세관 데드 볼륨 Vstc 작은 방울포함0.04 밀리바이트0.07 밀리바이트
볼륨 보정을 위한 볼륨 V'0.54 밀리리터2.07 밀리바이트

ᅡ드롭은 챔버 cV 의 경우 5 μL, 챔버 sV의 경우 0 μL에 가까워야 합니다.
표 1: 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK) 스토퍼가 있는 소량(sV) 및 클래식 용량(cV) 모듈의 치수.

J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
실험실 볼륨 V0.5 밀리미터2.0 밀리그램0.5 밀리미터2.0 밀리그램
의미하다9.222.37-3.17-1.17
중앙값9.252.36-3.08-1.04
표준 편차0.490.340.930.83
최소8.201.79-5.11-3.72
최대10.413.42-0.820.67

표 2: 공기 포화도로 외삽된 J°air 및 50μM O 2 농도에서 계산된 J°50. 시리즈 2(pce) 및 3(imt) 및 TIP2k 적정 전(0.5mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 mL: N = 60).

보충 파일 1: 샘플 준비. 마우스 심장에서 분리된 인간 혈소판, 인간 섬유아세포 및 미토콘드리아. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: TIP2k를 사용한 기기 O2 백그라운드 테스트. 0.5mL 챔버에서 Na-디티오나이트(2.5mM)를 적정하기 위해 TIP2k를 사용하여 수행된 테스트의 대표적인 흔적. 매체: MiR05, 온도: 37°C, 교반 속도: 750rpm. 적정으로 인한 스파이크가 제거되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: O2 농도의 함수로서의 기기 배경 O2 플럭스 J°1. 시리즈 2(pce, 원) 및 3(imt, 삼각형)의 챔버 sV(0.5 mL; 녹색, N = 48) 및 챔버 cV(2.0 mL; 파란색, N = 60) 및 0.5mL 챔버(검은색 원, N = 8)에서 TIP2k 적정 전. 빨간색 선: 중앙값 ± SD. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 교반 회전 속도의 함수로서의 지수 시간 상수 τ . 37°C에서 0.5mL 챔버에 대한 개별 τ 값(N = 2). 0.5mL 챔버에서 τ 는 550rpm에서 2.53 ± 0.05초, 750rpm에서 2.50 ± 0.05초, 850rpm에서 2.47 ± 0.04초였습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 2.0mL 챔버에서 냉동 보존된 인간 혈소판의 O2 소비. 올리고마이신 적정(Omy)을 포함한 프로토콜 SUIT-003_D018의 대표적인 추적. 플럭스 [pmol∙s-1∙mL-1]는 기기 배경 O2 플럭스에 대해 보정되고 세포 농도(164∙106 x∙mL-1)로 나뉩니다. 적정으로 인한 스파이크가 제거되었습니다. cO2는 간헐적 재산소화(공기, '개방된' 챔버, 파란색 음영)에 의해 60μM 이상으로 유지되었습니다. 호흡 상태의 순서(적정 및 속도): ce1, 살아있는 세포의 일상적인 호흡 R. ce1P, 외부 기질로서의 피루브산염. ce2Omy10, 5nM 단계의 Omy 적정; 누출 호흡 L. ce3U2.0, 최적의 농도 2μM로 분리기 적정; ET 용량 E. ce3Glc, 포도당 11mM; E는 언커플러에 의해 점진적으로 억제됩니다. ce4Rot, 로테논 0.5μM 억제 CI; 잔류 산소 소비량 ROX. ce5S, 숙시네이트 10 mM; 원형질막 투과성 세포에서 E를 자극합니다. 1Dig20, 완전한 원형질막 투과화를 위해 최적의 농도 20μg·mL-1로 디지토닌 적정; 숙시네이트 경로 ET 용량 SE. 1c, 시토크롬 c 10 μM; 미토콘드리아 외막 무결성 테스트. 2Ama, CIII를 억제하는 항마이신 A 2.5μM; 록스. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 기질-억제제-분리자-적정(SUIT) 프로토콜에 사용되는 화학 물질. s, V 및 c, V 챔버에 대한 약어 및 원액 농도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 R1-R0 및 J°1의 비교. 시리즈 2(pce) 및 3(imt) 및 TIP2k 적정 전(0.5mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 mL: N = 60). 데이터는 해수면에서 얻은 시리즈 1(ce)의 데이터를 제외하고 평균 기압 94.9kPa(오스트리아 인스브루크)에서 수행된 실험 시리즈 2(pce) 및 3(imt)에서만 평균을 내렸습니다. 0.5mL 및 2.0mL 챔버에는 동일한 유형이지만 다른 개별 POS가 사용되었습니다. 따라서sV와cV 챔버를 비교할 때 센서 간의 가변성을 고려해야 합니다. 2.0mL 챔버에 대해 실험적으로 얻은 J°1 = 2.26 ± 0.41 pmol∙s-1∙mL-1은 계산된 값과 거의 일치했지만, 0.5mL 챔버에 대한 실험 J°1 = 8.48 ± 0.53 pmol∙s-1∙mL-1은 예상보다 낮았습니다. 이것은 다음과 같은 관찰로 설명되었습니다. 챔버를 닫은 후 0.5mL 챔버에서 더 높은 배경 O2 플럭스는 비슷한 시간 간격으로 설정된 J°1에 대한 표시에서 O2 농도를 낮춥니다(그림 1). J°1에서의 산소 농도는 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 각각 평균 4.06% 및 1.72% 낮은 공기 포화도였습니다(보충 그림 2, 보충 표 2). 낮은 cO2에서 센서에 의한 O2 소비 감소와 일부 O2 역 확산은 실험적으로 결정된 J ° 1을 감소시킵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: 보정(R1)과 J°1 을 얻은 산소 농도[μM]와 그 차이의 %. 시리즈 2(pce) 및 3(imt) 및 TIP2k 적정 전(0.5mL: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 mL: N = 60). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 4: 2.0mL 챔버에서 측정되고 예상되는 J°1. O2k 시리즈 A(티타늄 스토퍼13 포함), V = 2.0 mL(37°C, O2 용해도 계수 0.92인 NaCl 용액; N = 52)를 사용합니다. nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1. O2 후방 확산이 cO2,1에서 무시할 수 있다는 가정에 기초하며, 이는 cO2,1 ~ cO2*에서만 사실입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 5: 각 기기 O2 배경 테스트에 대해 계산된 선형 회귀 잔차(절대값[pmol O2∙s-1∙mL-1]). 시리즈 2(pce) 및 3(imt) 및 TIP2k 적정 전의 기기 배경 테스트의 통합 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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호흡 측정에 사용할 수 있는 샘플의 양은 예를 들어 생검, 일차 세포 또는 세포 수가 적은 천천히 성장하는 세포 배양에 대한 연구에서 종종 제한됩니다1. 더욱이, 호흡 활동은 미토콘드리아 손상으로 인해 억제됩니다.11 또는 지방산 산화와 같은 낮은 용량의 미토콘드리아 경로를 조사할 때12. 이러한 경우 호흡 측정 챔버 부피가 낮으면 O2 플럭스의 분해능에 이점이 있습니다. 그러나 기기 배경 O2 플럭스는 더 낮은 챔버 부피에서 증가하고 안정적으로 측정되지 않고 O2 농도의 함수로 적절하게 보정되지 않을 때 오류를 유발합니다. 기기 O2 백그라운드 테스트 및 백그라운드 보정의 복제 가능성은 낮은 챔버 부피에 특히 중요합니다. 이론적(J°R1) 및 실험적(J°air) O2 플럭스의 거의 동일한 값은 POS의 음극 반응에서 4 e-/O2를 사용한 폴라로그래피 측정의 정확성에 대한 증거를 제공합니다. J°R1과 J°air의 차이는 sV 및 cV 챔버에서 각각 1.64 ± 0.43 및 0.22 ± 0.31 pmol∙s-1∙mL-1이었으며, 이는 2.0mL 챔버(±1 pmol∙s-1∙mL-1)의 검출 한계 내에 속하는 측정의 정밀도를 나타냅니다28. 2.0mL 및 0.5mL 챔버에서 동일한 유형의 폴라로그래픽 산소 센서를 사용하면 부피별 배경 O2 플럭스가 챔버 부피에 반비례하여 4배 증가했으며 변동성은 두 챔버 부피에서 거의 동일했으며 SD는 J°air의 경우 0.5 및 0.3 pmol∙s-1∙mL-1, sV 및 cV의 경우 J°50의 경우 0.9 및 0.8 pmol∙s-1∙mL-1 챔버, 각각(표 2). 소용량 챔버가 설계된 최소한의 호흡 활동에서는 작은 배경 효과도 중요해집니다(보충 표 3; 보충 그림 2). 따라서 적절한 보정을 적용하려면 기기 배경 O2 플럭스(그림 1)에 대한 일상적인 평가가 필요합니다28.

균질한 시스템을 유지하고 안정적인 산소 신호를 보장하기 위해서는 매체의 높고 지속적인 교반이 필요합니다. 2.0mL 챔버에서는 750rpm의 교반 속도가 설정되었지만 0.5mL 챔버에서는 최적 속도를 알 수 없었습니다. 유리 챔버와 교반기 바의 다양한 형상(표 2)은 최적의 교반 속도에 대한 독립적인 평가가 필요합니다. 산소 센서는 챔버 부피와 관계없이 750rpm에서 O2 신호 R1에서 약간의 편차로 550rpm에서 950rpm 사이의 교반 속도 변화에 반응했습니다. 챔버 sV에 대해 평가된 지수 시간 상수 τ는 동일한 교반 속도13에서 2.0mL 챔버에 대해 보고된 τ와 일치했습니다. 이러한 결과는 교반이 두 챔버 형상 모두에서 동등하게 효과적이며 기본 교반 속도인 750rpm(2.0mL 챔버)을 0.5mL 챔버에 적용할 수 있음을 시사합니다. '개방형' 및 '폐쇄형' 챔버 구성 모두에서 0.5mL 챔버는 신호 대 잡음비가 더 높았으며, 이는 개별 POS 변동성의 영향을 배제할 수 없지만 0.5mL 챔버의 장점으로 더 높은 정확도를 시사합니다(그림 5). 교반 속도를 750rpm에서 550rpm으로 낮출 때 소음이 증가하지 않았기 때문에 0.5mL 챔버에서 교반 속도를 550rpm으로 낮추면 신호 대 잡음비를 손상시키지 않으면서 전단 응력을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

적절한 배경 보정이 적용되었을 때 3개의 실험 모델에서 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 거의 동일한 O2 소비율이 측정되었습니다. 직경 2μm의 작은 혈소판42, 살아있는 투과화된 섬유아세포, 분리된 미토콘드리아로 얻은 결과는 광범위한 세포 유형 및 미토콘드리아 제제의 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 일관된 호흡수를 얻을 수 있을 것으로 예상할 수 있음을 시사합니다. 그러나 투과화된 근육 섬유는 본 연구에서 테스트되지 않았습니다. rox의 정확한 측정은 산소 수준40 및 높은기기 분해능 1을 제어해야 합니다. rox의 부피별 O2 플럭스는 검출 한계만큼 낮을 수 있습니다. 실험에 세포 수가 적거나 일반적으로 적은 양의 샘플을 사용하는 경우 재산소화가 필요하지 않습니다. 그러나 필요한 경우 O2 플럭스의 안정화에 필요한 기간 동안 O2 농도의 급격한 감소를 피하기 위해 O2 플럭스가 낮은 호흡 상태에서 재산소화를 수행하는 것이 좋습니다. 재산소화 후 O2 플럭스의 안정화는 0.5mL 챔버에서 더 오래 걸립니다.

품질 관리에 기여하기 위해 부분 부피 교체 중에 현탁액 시료의 희석에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 완전히 삽입된 스토퍼를 제거한 후, 챔버 내 호흡 매체의 총 부피 V'는 실험 부피 V 및 스토퍼 모세관 부피 Vstc로 제공됩니다(표 2). 따라서 스톡 부피 V J.i는 V보다 큰 실제 부피 V'로 희석되어 0.5mL 및 2.0mL 챔버에서 각각 0.5/0.54 = 0.926 및 2.0/2.07 = 0.966의 희석 계수 V/V'가 됩니다(그림 2). 혈소판 실험에서 모세관 사부피가 0.05mL인 챔버 sV에 프로토타입 스토퍼가 사용되었으며, 이는 희석 계수 0.909에 해당합니다.

동일한 시료 농도(부피당 양)에서 2.0mL 챔버보다 0.5mL에 거의 4배 적은 양의 살아있는 세포, 투과화된 세포 및 분리된 미토콘드리아가 필요하며, 세포 수 또는 단백질 질량에 대해 정규화된 호흡기 O2 소비량의 정량적으로 비교 가능한 결과를 산출합니다. 이것은 챔버 (Chamber) 가 사용 가능한 샘플의 양이 제한된 연구에 유용한 도구임을 나타냅니다. 반면, 챔버 sV에 동일한 양의 샘플을 적용하면 부피별 O2 플럭스가 증가하여 호흡 활동이 낮을 때 측정의 불확실성이 줄어듭니다.

본 연구의 산소 체제는 공기 포화도의 O2 범위에서 30μM로 제한되었습니다. 이 범위를 초과하는 산소 수준에서의 적용 가능성은 조직 정상산소증 또는 저산소증43 및 고산소증9에서 투과화된 조직을 조사하기 위한 추가 평가가 필요합니다. Oroboros NADH 및 Q 모듈의 여러 다중 센서 구성; pH, NO 및 TPP+ 전극10,44 - 챔버 sV에 수용할 수 없으며 2.0mL 챔버가 필요합니다.

공개 사항

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EL은 Oroboros Instruments의 직원입니다. EG는 Oroboros Instruments의 창립자이자 CEO입니다.

LFGS는 프로젝트 기간 동안 Oroboros Instruments에 고용되었습니다. EÅF와 EE는 Oroboros Instruments와 상업적 계약을 맺고 있는 스웨덴 룬드에 있는 Abliva AB의 직원입니다.

LR은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분리된 미토콘드리아에 대한 데이터를 수집해 준 Manuela Passrugger, 교반 회전 속도 테스트에 대한 기술 지원을 해준 Patrizia Guerth, 교반기 테스트의 시상수 분석을 해준 Mateus Grings에게 감사드립니다. 유리 챔버, 스토퍼 및 자기장 강도에 대한 기술 데이터에 대한 정보를 제공해 주신 파트너인 WGT Elektronik GmbH & Co KG, Kolsass, Austria에 감사드립니다. Luiza HD Cardoso, Alejandra Romero-Martinez, Ondrej Sobotka, Alba Timon-Gomez 및 Jaime Willis의 의견에 감사드립니다. 이 작업은 보조금 계약 번호 859770, NextGen-O2k 프로젝트에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 단기 과학 임무(LFGS, LR)의 재정 지원을 통해 MitoEAGLE CA15203 COST Action에 기여합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anaconda3Anaconda 소프트웨어 배포https://www.anaconda.com/소프트웨어
ADPMerck, Germany117105
Antibiotics-antimycotics 100xBiosera, FranceXC-A4110주의 H317 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있음
Antimycin ASigma-Aldrich, USAA8674주의 H300  삼키면 치명적, H400 단기(급성) 수생 위험 
아스코르브산시그마-알드리치, 미국A7631
ATP시그마-알드리치, 미국&nbsp; A 2383
BSA 지방산 프리시그마-알드리치, 미국6003소 혈청 알부민
CaCO3Sigma-Aldrich, USAC 4830
CCCPSigma-Aldrich, USAC2759카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존 주의 H301 + H311 + H331 삼키거나 피부에 접촉하거나 흡입하면 독성
.Thermo Fisher Scientific, 미국AMQAX100
Cytochrome cSigma-Aldrich, USAC7752
DatLab Oroboros Instruments, 오스트리아버전 7.4데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어
DatLab Oroboros Instruments, 오스트리아버전 8.1데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어
DC 단백질 분석Bio-Rad, 미국5000112단백질 분석 키트; 주의 H314 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 일으킴
DigitoninSigma-Aldrich, USAD5628주의 H301 삼키면 독성이 있음
DithiothreitolSigma-Aldrich, USAD 0632주의 H318 심각한 눈 손상을 일으킴
DMEMPan Biotech, GermanyP04-05551Dulbecco' 의 수정된 독수리' s medium
DMSOSigma-Aldrich, 미국D2650디메틸설폭사이드
DPBSLonza Bioscience, 스위스LONBE17-512F칼슘 프리 Dulbecco' s 인산염 완충 식염수
EGTASigma-Aldrich, USAE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, USAA5256701소 태아 혈청
도당Sigma-Aldrich, USA&nbsp; G7528
글루타메이트 Sigma-Aldrich, 미국G1626
글리세로인산염Santa Cruz Biotechnologysc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific, 미국HM3S원심분리기
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germany1701원심분리기
ImidazoleHoneywell Fluka, Austria56750주의 H302 삼키면 유해함, H314 심한 피부 화상 및 눈 손상을 일으킴, H360D 태아를 손상시킬 수
jamovi jamovi 프로젝트버전 2.3.13소프트웨어
K+-MESSigma-Aldrich, USAM 8250
Leucosep tube Greiner Bio-One GmbH, 오스트리아Z642843-300EA폴리에틸렌 장벽 말레이트가 있는 원심분리기 튜브
 Sigma-Aldrich, USAM1000주의 H319 심각한 눈 자극을 일으킵니다.
만니톨시그마-알드리치, 미국M 4125
MgCl2 Scharlau, 스페인MA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, 오스트리아60101-01미토콘드리아 호흡 배지
믹서 Swelab Instruments, 스웨덴440S흔들 테이블
Mr. Frosty 냉동 용기Thermo Fisher Scientific, USA5100-0001냉동 용기
OroborosOroboros Instruments, 오스트리아NextGen-O2k 및 O2k는 ' 오로보로스
Oroboros 챔버 cVOroboros Instruments, 오스트리아23100-01클래식 볼륨 챔버
Oroboros 챔버 sVOroboros Instruments, 오스트리아33100-01소용량 챔버
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments, 오스트리아11100-03적정 주입 마이크로펌프
O2-Zero 분말Oroboros Instruments, 오스트리아26600-02&NBSP; Na-디티오나이트 주의 H251 자체 발열: 불이 붙을 수 있음, H302 삼키면 유해함, H319 심각한 눈 자극 유발
옥타노일카르니틴바이오트렌드 - APExBIO Technology, GermanyB6371
올리고마이신시그마-알드리치, 미국O4876
포스포크레아틴시그마-알드리치, 미국P 7936
피루베이트시그마-알드리치, 미국P2256주의 H317 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있음
RotenoneSigma-Aldrich, USAR8875주의 H300 삼키면 치명적일 수 있습니다
피부 섬유아세포 세포주   ATCC, USA
지드나트륨Sigma-Aldrich, USAS2002주의 H300 + H310 + H330 삼키거나 피부에 닿거나 흡입할 경우 치명적일 수 있습니다
Subtilisin ASigma-Aldrich, USAP 5380주의 H318 - 심각한 눈 손상을 일으킴, H334 - 흡입 시 알레르기 또는 천식 증상 또는 호흡 곤란을 유발할 수 있음
시네이트Sigma-Aldrich, USAS2378
자당Sigma-Aldrich, 미국S 7903
Swelab Alfa 혈액 세포 계수기 Boule Diagnostics AB, 스웨덴1420041
타우린 Sigma-Aldrich, USAT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan, 스위스분광 광도계
TMPDSigma-Aldrich, USAT3134N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 주의 H315 피부 자극을 유발, H319 심각한 눈 자극을 유발
립신Sigma-Aldrich, USAT4799주의 H334 흡입 시 알레르기 또는 천식 증상 또는 호흡 곤란을 유발할 수
Vacuette GreinerBio-One GmbH, 오스트리아15452520
A 이 있습니다 포 있음 아. 숙 트 있음

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